Principe du séquençage de l ADN selon la technique de Sanger et Coulson (prix Nobel de Chimie 1980)

Transcription

1 rincipe du séquençage de l DN selon la technique de Sanger et oulson (prix Nobel de himie 1980) d après ndré OUREU modifié ENF École Nationale de Formation gronomique

2 3 5 Brin à séquencer, présenté dans l orientation inverse par rapport au sens de lecture conventionnel : l extrémité 3 -OH est à gauche, l extrémité 5 - est à droite. Le séquençage selon la technique de Sanger met en œuvre une DN polymérase. Il est donc nécessaire de disposer d une amorce nucléotidique, donc de connaître la séquence du fragment contigu de celui à séquencer. ette partie est colorée sur le schéma.

3 Brin à séquencer, présenté dans l orientation inverse par rapport au sens de lecture conventionnel : l extrémité 3 -OH est à gauche, l extrémité 5 - est à droite. Le séquençage selon la technique de Sanger met en œuvre une DN polymérase. Il est donc nécessaire de disposer d une amorce nucléotidique, donc de connaître la séquence du fragment contigu de celui à séquencer. ette partie est colorée sur le schéma.

4 amorce Le principe du séquencage est : 1. de faire fabriquer par l DN polymérase tous les brins complémentaires possibles du brin à séquencer, du plus court au plus long possible, à partir de l extrémité 3 de l amorce... etc...

5 Le principe du séquencage est : 1. de faire fabriquer par l DN polymérase tous les brins complémentaires possibles du brin à séquencer, du plus court au plus long possible, à partir de l extrémité 3 de l amorce de les ordonner par taille...

6 Le principe du séquencage est : 1. de faire fabriquer par l DN polymérase tous les brins complémentaires possibles du brin à séquencer, du plus court au plus long possible, à partir de l extrémité 3 de l amorce de les ordonner par taille d identifier le dernier nucléotide mis en place sur l extrémité 3.

7 our satisfaire aux points 1 et 3 il faut : être capable de stopper la synthèse des brins complémentaires de manière aléatoire, sur chaque nucléotide ajouté par la polymérase, être capable de déterminer la nature de ce nucléotide. Une solution pour répondre simultanément à ces deux exigences : réaliser la réaction en présence d un didéoxynucléotide (voir article Biofutur mai 2000) Qu est-ce qu un didéoxynucléotide?

8 eci est un déoxynucléotide triphosphate ou dnt, élément de base des brins d DN. Base azotée purique 5 O 1 3 OH J ai un trou de mémoire

9 5 Base azotée purique O 1 3 OH La perte du OH en 3

10 La perte du OH en 3 donne un didéoxynucléotide ou ddnt 5 Base azotée purique O 1 3 ourquoi les ddnt bloquent-ils la synthèse d DN?

11 La liaison d un se fait par réaction carbone 3 du.. et le groupement phosphate α fixé sur le carbone 5 du nucléotide n + 1 O nucléotide sur l extrémité 3 d une chaîne entre le groupement OH fixé sur le dernier nucléotide (n).. nucléotide n 3 OH 5 nucléotide n + 1 Si je ne comprends pas, Je clique ici

12 La liaison d un se fait par réaction carbone 3 du.. et le groupement phosphate α fixé sur le carbone 5 du nucléotide n + 1 O nucléotide sur l extrémité 3 d une chaîne entre le groupement OH fixé sur le dernier nucléotide (n).. nucléotide n 3 OH 5 nucléotide n + 1

13 La liaison d un se fait par réaction carbone 3 du.. et le groupement phosphate α fixé sur le carbone 5 du nucléotide n + 1 O nucléotide sur l extrémité 3 d une chaîne entre le groupement OH fixé sur le dernier nucléotide (n).. nucléotide n 3 OH 5 nucléotide n + 1

14 La liaison d un se fait par réaction carbone 3 du.. et le groupement phosphate α fixé sur le carbone 5 du nucléotide n + 1 O nucléotide sur l extrémité 3 d une chaîne entre le groupement OH fixé sur le dernier nucléotide (n).. nucléotide n liaison phosphodiester O nucléotide n + 1 3

15 Dans le cas où le est impossible... dernier nucléotide est un ddnt, la liaison O didéoxynucléotide n 3 5 nucléotide n + 1

16 Dans le cas où le est impossible... dernier nucléotide est un ddnt, la liaison O didéoxynucléotide n 3 5 nucléotide n + 1

17 Dans le cas où le est impossible... dernier nucléotide est un ddnt, la liaison O didéoxynucléotide n 3 La synthèse de la chaîne est bloquée

18 La réaction de séquençage Répartition de l DN à séquencer en quatre lots : une réaction en présence de ddt une réaction en présence de ddt une réaction en présence de ddt une réaction en présence de ddtt Mélange équimolaire de chaque ddnt avec le dnt correspondant choix aléatoire par la polymérase localisation aléatoire du site de blocage obtention de tous les brins possibles

19 Mélanges de fragments obtenus dans une réaction en présence de : ddt ddt ddt ddtt

20 hargement du mélange de chaque réaction dans un puits d un gel de poly-acrylamide T

21 hargement du mélange de chaque réaction dans un puits d un gel de polyacrylamide Migration électrophorétique T

22 hargement du mélange de chaque réaction dans un puits d un gel de polyacrylamide Migration électrophorétique Révélation (radio-activité ou nitrate d argent) Lecture du gel de séquence des fragments les plus courts vers les fragments les plus long... donc de 5 en 3, selon le sens conventionnel de lecture des séquences 3 T T T 5 T

23 T el de séquence coloré au nitrate d argent Séquence répétée de type microsatellite

24 Résultat d un séquençage sur séquenceur automatique d une fraction du gène «culard». llèle «normal» à droite. llèle muté (délétion), responsable du caractère culard, à gauche. FIN

25 3 5 amorce brin à séquencer 5 Sens de lecture du gel de séquençage Brins résultant du séquençage 3

26 omment faire pour séquencer un fragment totalement inconnu? ar exemple, l insérer dans un vecteur plasmidique dont on connaît la séquence : DN à séquencer DN plasmidique de séquence connue Séquences plasmidiques contiguës du fragment à séquencer, de séquence connue et pouvant donc servir pour la définition et l hybridation d amorces

27 T T T T

28 3 5 3 T T T T