Purification des acides nucléiques Centrifugation en gradient de saccharose Centrifugation en gradient de densité (ClCs2)

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1 Les techniques de la biologie moléculaire Préparation des acides nucléiques Isolement des noyaux La centrifugation Purification des acides nucléiques Centrifugation en gradient de saccharose Centrifugation en gradient de densité (ClCs2) Dosage spectrophotométrique des acides nucléiques Gels d electrophorèse Dénaturation thermique des acides nucléiques

2 Préparation des acides nucléiques L ADN se trouve dans le noyau des cellules eukaryotes. La première étape de la préparation consistera à isoler les noyaux des autres organites On utilisera la technique de centrifugation différentielle.

3 Isolement de noyaux n découpe finement le orceau d organe à extraire n homogénéise de manière ouce dans une solution mpon placée entre 0 C et C. filtre à froid l homogénat ur éliminer les morceaux tissus et les cellules intactes n centrifuge le le filtrat à 600g ndant 10 On On reprend le le culot culot de de noyaux noyaux à froid froid dans dans un un tampon tampon

4 La centrifugation = vitesse angulaire (rad.s -1 ) = vitessedesédimentation (cm.s -1 ) eff = rayon effectif(c m) g =ω 2.r eff = ω 2.r.S eff S = M (1-V.r) f

5 ntrifugation en gradient de saccharose Saccharose a sédimentation sédimentation en en gradient gradient de de saccharose saccharose épare épare les les macromolécules macromolécules en en fonction fonction de de eur masse masse moléculaire moléculaire Une Une centrifugation centrifugation en en gradient gradient de de Chlorure Chlorure de de Césium Césium sépare sépare les les macromolécules macromolécules en en fonction fonction de de leu leu densité densité

6 Centrifugation en gradient de Chlorure de Césium Si i l'on l'on charge charge un un mélange d'adn d'adn et et d'arn d'arn sur sur sur un un gradient de de Chlorure de de Césium 6M 6M et t que que l'on l'on centrifuge à l'équilibre, chaque chaque macromolécules se se répartit répartit selon selon sa sa densité. (a) (a) Supposons que que l'on l'on traite traite ce ce mélange d'adn d'adn et t d'arn d'arn par par une une RNase RNaseon on n'observe plus plus qu'une qu'une bande qui qui migre migre à la la densité densité de de l'adn. l'adn. (b) (b) densité a b On n charge charge un un échantillon d'adn d'adn dans dans un un tube tube et t un un échantillon de de protéine dans dans un un autre. autre. A l'équilibre, on on obtient obtient les les bandes bandes en en c et et d. d. c d e Dans le le tube tube e on on fait fait centrifuger un un échantillon de e chromatine. On On obtient obtient une une bande bande en en e densité

7 éparation selon le poids moléculaire ou la densité

8 Isolement de noyaux n découpe finement le orceau d organe à extraire n homogénéise de manière ouce dans une solution mpon placée entre 0 C et C. filtre à froid l homogénat ur éliminer les morceaux tissus et les cellules intactes n centrifuge le le filtrat à 600g ndant 10 On On reprend le le culot culot de de noyaux noyaux à froid froid dans dans un un tampon tampon

9 Extraction et purification de l'adn es noyaux sont éclatés mélange de détergent (SDS ou Sarcosyl) et de protéinase K ; le détergent détruit les membranes et la protéinase digère les protéines associées à l'adn entrifugation à haute vitesse Les macromolécules vont au fond du tube xtraction par le phénol Il y a séparation de la phase aqueuse et de la phase phénolique. L'ADN va dans la phase aqueuse et les protéines dénaturées restent à l'interphase DNA f récipitation à l'éthanol à froid entrifugation en gradient de chlorure de césium

10 Dosage spectrophotométrique des acides nucléiques Loi de Beer-Lambert Spectre d absorption de l ADN Hyperchromicité

11 I0 l I Loi de Beer-Lambert % T T A = = = 100 T I I 0 log 10 I I 0 T = Transmission A = Absorbance La loi de Beer-Lambert A = ε. l. c ε : Absorbance molaire l : Trajet optique (cm) c : Concentration (mol L (L mol -1 ) -1 cm -

12 Absorbance molaire 'absorbance molaire est ne caractéristique physique ssociée à une molécule. Molécule Trp Tyr ëmax (nm) å.10-3(m-1.cm-1) 5,6 47,0 1,4 7,0 48,0 'absorbance molaire des cides nucléiques est la oyenne de l'absorbance olaire de chaque base. Phe His Cys Adénine ,5 0,2 9,3 60,0 5,9 0,3 13,4 Adénosine 259,5 14,9 our l'adn natif, on estime u'une absorbance de,212 sous 1 cm de traversé orrespond à une concenation de 10 µg/ml Guanine Cytosine Uracil Thymine DNA ,5 264, ,1 7,1 8,2 7,9 6,6 (par base) RNA 258 7,4 (par base)

13 Spectre d'absorption de l'adn A 260nm A 280nm» 2 ADN d'e Coli natif 0.31 lmax : 258 nm 0.16 si A 260nm A 280nm < 1.85 l'adn est contaminé par des protéines

14 Hyperchromicité ADN d'ecoli à 25 C ADN d'ecoli à 82 C lmax : 258 nm hyperchromicité

15 Dénaturation thermiques des acides nucléiques La température de demie dénaturation Effet de la force ionique Effet de la composition en paires GC

16 Dénaturation de l'adn uand on chauffe une molécule d'acide nucléique, elle se énature. La double hélice se sépare. l y a rupture des liaisons hydrogènes et désempilement des ases. a dénaturation de l'adn s'accompagne d'un effet yperchromique. L'absorbance de la molécule augmente. t On peut donc suivre la dénaturation thermique d'un acide nucléique en mesurant la variation de l'absorbance en fonction de la température. t

17 Courbe de dénaturation thermique La température de demi dénaturation ( tm) est la température pour laquelle 50% de l'adn est dénaturé Absorbance (260 nm) t m =48 C

18 Effet de la force ionique

19 ffet de la composition en paires GC La stabilité des acides nucléiques dépend de la teneur en GC de l'acide nucléique. Appariement G-C = 3 liaisons hydrogènes Appariement A-T = 2 liaisons hydrogènes

20 Gels d'électrophorèse L'électrophorèse Migration de particules chargées sous l'effet d'un champ électrique La particule atteint très rapidement une vitesse limitev= q.e/f avec q: charge de la particule; E: champ électrique; f: coefficient de frottement particule/solvant _ - q v E v + q dépend dépend de de la la charge charge de de la la macromolécule macromolécule f f dépend dépend de de la la taille taille (encombrement) (encombrement)

21 Gel de polyacrylamide En faisant varier la concentration d'acrylamide et de bis acrylamide, on obtient des mailles très différentes par polymérisation. CH 2 =CH-CO-NH 2 acrylamide (CH 2 =CH-CONH) 2 CH méthylène bis acrylamide

22 Electrophorèse sur Gel de polyacrylamide

23 Détermination du poids moléculaire d'un AN