Diagnostic au laboratoire des diarrhées sanglantes. Pr Aïssatou Gaye-Diallo Bactériologie-Virologie Hôpital A. le Dantec Dakar - Sénégal

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1 Diagnostic au laboratoire des diarrhées sanglantes Pr Aïssatou Gaye-Diallo Bactériologie-Virologie Hôpital A. le Dantec Dakar - Sénégal

2 Introduction Diarrhées épidémiques o Choléra épidémique Vibrio cholerae O1 Vibrio cholerae O139 o Dysenterie épidémique = diarrhée sanglante Shigella spp Escherichia coli O157:H7 Autres agents

3 Introduction Diarrhée sanglante o Diarrhée avec sang et pus visibles dans les selles Envahissement et destruction cellules intestinales Ulcération des muqueuses Exsudats inflammatoires et hémorragiques o Fièvre, crampes abdominales et douleurs rectales

4 Bactéries Étiologie des diarrhées o Shigella spp sanglantes Shigella dysenteriae (15) Shigella flexneri (6) Shigella boydii (19) Shigella sonnei (1)

5 Bactéries Étiologie des diarrhées sanglantes o Escherichia coli O157:H7 (ECEH) o Campylobacter jejuni o Escherichia coli entéro-invasifs (ECEI) o Salmonella spp

6 Étiologie des diarrhées sanglantes Parasites o Entamoeba histolytica Cause occasionnelle Non épidémiogène Mais fréquent dans PVD

7 Épidémiologie dysenterie bacillaire à Shigella Épidémies mortelles (S. dysenteriae 1) o Amérique centrale ( ) o Asie du sud o Afrique centrale et australe (1979, 1994 ) Pays développés (S. sonnei) PVD : S. flexneri +++ et S. dysenteriae

8 Diagnostic au laboratoire de la diarrhée sanglante

9 Diagnostic de la shigellose Étapes du diagnostic o Prélèvement des selles + transport +conservation o Examen macroscopique o Examen microscopique o Mise en culture Isolement Identification o Évaluation sensibilité aux antibiotiques

10 Prélèvement et transport des Quand? matières fécales o Pendant les 4 premiers jours maladie o Avant traitement antibiotique Comment? o Selles o Écouvillonnage rectal o Écouvillon de selles fraîches o Milieu de transport (Cary Blair ou autre)

11 Milieu de transport (Cary Blair) et écouvillons

12 Prélèvement et transport des Conservation : matières fécales o +4 C si échantillon à traiter dans les 48 heures o -70 C si traitement échantillon différé Transport : o Récipients hermétiques o Boîtes étanches contenant glace sèche ou humide

13 Transport des échantillons

14 Prélèvement et transport des matières fécales Étiquetage o Identification claire o Nom, Prénoms du patient o Numéro échantillon Bulletin d analyses o Nom, Prénoms, Sexe, Âge o Renseignements cliniques o Traitement reçu o Date et Heure de prélèvement

15 Examen macroscopique Noter consistance: Selles moulées refusées Présence de glaires, de pus et de sang: choix de ces zones

16 Examen microscopique Etat frais: o Mobilité caractéristique / levures/ hématies/parasites o Peu informatif (manque de sensibilité) Colorations o Bleu de méthylène/giemsa : leucocytes Présence leucocytes o Gram : Appréciation de l équilibre de la flore G+/G-

17 Flore normale: majorité Bactéries à Gram (-) Présence quelques Bactéries à Gram (+) Apprécier déséquilibre flore

18 Morphologie caractéristique

19 Isolement Mise en culture o Divers milieux spécifiques : Gélose Xylose-Lysine-Désoxycholate (XLD) Gélose MacConkey (MAC) Gélose Désoxycholate-Citrate (DCA) Gélose Hektoen entérique (HE) Ne pas utiliser la gélose SS

20 Isolement Méthode d ensemencement d une boîte pour l isolement de Shigella

21 Colonies de S. dysenteriae 1 sur XLD

22 Colonies de S. flexneri sur XLD

23 Colonies de S. flexneri et E. coli sur XLD Les colonies de S. flexneri sont incolores ou rouges alors que les colonies de E. coli sont jaunes

24 Colonies de S. flexneri et E. coli sur MAC E. coli : roses à rouges

25 Milieu Hektoen Milieu sélectif par sels biliaires (taux élevé de peptone pour Shigella) Étude de 3 sucres ( lactose, saccharose, salicine) et H2S Couleur Jaune saumon Jaune saumon à centre grisnoir Bleues à centre noir vertes Germes E. coli, Citrobacter, Klebsiella, Enterobacter, Serratia, S. arizonae, Vibrio cholerae (ox+), Aeromonas (ox+), Yersinia Proteus vulgaris Proteus mirabilis Salmonella Shigella, S.Typhi, Pseudomonas spp (ox+)

26 Identification de Shigella spp Shigella o Lactose (-), TDA (-), SH 2 (-), immobile o Uréase (-), indole (-) o Agglutination

27 Kligler-Hajna de Shigella Lactose (-) SH 2 (-) Glucose (+) Gaz (-)

28 Identification de Shigella spp

29 Identification de Shigella spp

30 Identification de Shigella spp Une anse sert à dispenser de petites quantités d antisérum pour des tests d agglutination sur lame

31 Identification de Shigella spp Les sérums anti-shigella vont agglutiner les souches du même sérogroupe/sérotype (droite). La solution salée n agglutine pas les Shigella (gauche)

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33 Évaluation sensibilité aux antibiotiques a Si résistant à l acide nalidixique, tester avec ciprofloxacine

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35 Autres agents de diarrhée sanglante

36 Escherichia coli O157:H7 Isolement : o MacConkey / Sorbitol (sorbitol -) Identification : o Agglutination avec anti-sérum Laboratoire de référence

37 Escherichia coli O157:H7 Les colonies E. coli O157 sont incolores sur SMAC. Les colonies non E. coli O157 sont roses.

38 Escherichia coli O157:H7

39 Campylobacter jejuni Mise en culture o Recherche Campylobacter (gélose sélective) Milieu de Karmali Skirrow, Butzler, Campylosel Campylobacter sur karmali En microaérophilie (5 % O2, 10% CO2, 85% N2) Incubation à 37 C À 42 C (si C. fetus ou C. jejuni subsp. doyli) Lecture à partir J2 J5

40 Campylobacter jejuni Identification C.jejuni subsp jejuni C.jejuni subsp. doylei C.Coli C.fetus Croissance à 25 C Croissance à 42 C Hippurate + v - - Céfalotine R S R S Acide nalidixique S S S R indoxylacétate + v + - o Tests complémentaires : PCR Campylobacter test hippurate antibiogramme sur Columbia (microaérophilie) indoxylacétate en 2 ème intention API CAMPY Antibiogramme sur Columbia (microaérophilie)

41 Escherichia coli entéro-invasif

42 Salmonella spp Isolement : milieu d enrichissement + milieu d isolement Identification o Galerie : identification espèce o Sérotypage : Mélange agglutinines anti-o (OMA, OMB..) / sérum monovalent/ anti-h 1 et 2/ anti-vi ( selon labo) déclaré et envoyé au centre de référence Antibiogramme

43 Conclusion Diagnostic au laboratoire diarrhée sanglante utile o Identification agent étiologique o Détermination initiale profils de sensibilité aux antibiotiques o Suivi des changements dans profils de sensibilité aux antibiotiques o Surveillance des épidémies

44 Merci de votre aimable attention!