Analyse d échantillons alimentaires pour la présence d organismes génétiquement modifiés

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1 Analyse d échantillons alimentaires pour la présence d organismes génétiquement modifiés Module 11 Détection quantitative du soja Roundup Ready par PCR en temps réel N. Foti WORLD HEALTH ORGANIZATION REGIONAL OFFICE FOR EUROPE ORGANISATION MONDIALE DE LA SANTE BUREAU REGIONAL DE L EUROPE WELTGESUNDHEITSORGANISATION REGIONALBÜRO FÜR EUROPA ВСЕМИРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ ЗДРАВООХРАНЕНИЯ ЕВРОПЕЙСКОЕ РЕГИОНАЛЬНОЕ БЮРО

2 Détection quantitative su soja Roundup Ready par PCR en temps réel 2 Table des matières Module 11 Détection quantitative du soja Roundup Ready par PCR en temps réel INTRODUCTION 3 PCR EN TEMPS REEL UTILISANT LE THERMOCYCLEUR ABI PRISM PCR EN TEMPS REEL UTILISANT LE THERMOCYCLEUR LIGHTCYCLER (ROCHE) 9 REFERENCES 15

3 Détection quantitative su soja Roundup Ready par PCR en temps réel 3 Introduction Les protocoles suivants sont des méthodes basées sur la PCR en temps réel pour la quantification d une lignée de soja GM spécifique (le soja Roundup Ready ) dans les matières premières et les produits transformés. Les quantifications par PCR en temps réel s effectuent au moyen de deux thermocycleurs différents équipés pour détecter une amplification en temps réel en mesurant la fluorescence : le thermocycleur ABI PRISM 7700 SDS (Applied Biosystèmes) et le thermocycleur LightCycler (Roche). La PCR en temps réel est utilisée pour amplifier une séquence d ADN cible de référence endogène (spécifique du soja), plus une séquence cible d ADN indiquant la présence de soja génétiquement modifié (soja Roundup Ready ). Les deux essais impliquent deux systèmes PCR indépendants, chacun ayant des amorces d ADN spécifiques et des sondes marquées par un fluorochrome. L un des systèmes PCR détecte une séquence d ADN cible spécifique de l OGM, l autre est un système de référence endogène conçu pour servir de référence quantitative détectant le soja GM et non GM. Remarque : les protocoles qui figurent dans ce manuel ont été sélectionnés à des fins didactiques et doivent être considérés comme des exemples de base de quantification d OGM par la méthode de la PCR en temps réel. Nous recommandons de consulter périodiquement les sources et la littérature pertinentes afin d obtenir des informations sur les derniers protocoles mis au point et validés. Veuillez noter également que ces protocoles ont été sélectionnés en fonction de l équipement disponible dans notre laboratoire. Le CCR et l OMS n encouragent en aucun cas le recours exclusif à une société ou à une marque spécifique. PCR en temps réel utilisant le thermocycleur ABI PRISM 7700 Protocole de PCR en temps réel spécifique du soja RR : méthode PCR multiplexe Cette méthode consiste en une amplification/quantification du gène de référence de la lectine et d une partie du transgène inséré dans le soja RR au moyen d une PCR multiplexe (deux réactions PCR dans le même tube) (Foti et al., 2006). Les sondes

4 Détection quantitative su soja Roundup Ready par PCR en temps réel 4 TaqMan de lectine et de RR sont marquées respectivement avec les fluorochromes VIC et FAM, ce qui permet de détecter l amplification de plusieurs cibles dans le même tube. Le fluorochrome rapporteur (FAM) se distingue du fluorochrome VIC en raison de leurs différentes longueurs d ondes d émission maximale. Le thermocycleur ABI PRISM 7700 SDS est capable de détecter des fluorochromes multiples avec différentes longueurs d ondes d émission. La quantité de fluorochrome (FAM) du soja RR est normalisée par rapport à la quantité de fluorochrome végétal (VIC) détecté dans chaque échantillon. On obtient ainsi une valeur C T, dont la moyenne est établie pour les échantillons répétés. Ces valeurs sont comparées à une courbe d étalonnage générée par le C T des standards de concentration connue de soja RR (méthode comparative C T, ou C T ). Cette procédure a été mise en œuvre avec succès pour diverses matières premières, ingrédients et aliments contenant du soja (par ex. aliments pour animaux, boissons à base de soja, yaourts, farine, lécithine, etc.). La performance analytique de la méthode a été contrôlée avec succès dans le cadre de plusieurs procédures d essai d aptitude (par ex. FAPAS, GIPSA). Équipement et réactifs Sequence Detector System ABI PRISM 7700 (Applied Biosystems) Plaques de réaction MicroAmp Optical à 96 cupules (Cat. N N ) Couvercles MicroAmp Optical (Cat. N N ) TaqMan Universal Mastermix (Cat. N ) 2X contenant : tampon TaqMan 2x AmpliTaq Gold ADN polymérase (5 U/µl), UNG AmpErase (1 U/ml), dntp 200 µm avec dutp, référence passive 1 Microcentrifugeuse Centrifugeuse réfrigérée pour tubes coniques de 15 ml Micropipettes Agitateur vortex Portoir pour tubes de réaction Tubes microcentrifuges de 1,5 ml Tubes centrifuges coniques de 15 ml en polypropylène Eau exempte de nucléase Amorces (Le-F et Le-R) et sonde (sonde Le) spécifiques du gène de référence Amorces (RR-F et RR-R) et sonde (sonde RR) spécifiques du transgène

5 Détection quantitative su soja Roundup Ready par PCR en temps réel 5 Caractéristiques des amorces et de la sonde pour le gène de référence Le-F TCC ACC CCC ATC CAC ATT T Longueur (pb) 19 Poids moléculaire 5586,0 Le-R GGC ATA GAA GGT GAA GTT GAA GGA Longueur (pb) 24 Poids moléculaire 7532 Sonde Le 5 -(VIC)-AAC CGG TAG CGT TGC CAG CTT CG-(TAMRA)-3 Longueur (pb) 23 Poids moléculaire 7019,0 Caractéristiques des amorces et de la sonde pour le transgène RR-F GCC ATG TTG TTA ATT TGT GCC AT Longueur (pb) 23 Poids moléculaire 7014 RR-R GAA GTT CAT TTC ATT TGG AGA GGA C Longueur (pb) 25 Poids moléculaire 7712 Sonde RR 5 -(FAM)-CTT GAA AGA TCT GCT AGA GTC AGC TTG TCA GCG-(TAMRA)-3 Longueur (pb) 33 Poids moléculaire 10137

6 Détection quantitative su soja Roundup Ready par PCR en temps réel 6 Préparation du Mastermix Décongeler, mélanger doucement et centrifuger la quantité de réactifs requise pour la réaction. Conserver les réactifs décongelés dans la glace. Dans un tube de 15 ml conservé dans la glace, ajouter les éléments suivants dans l ordre indiqué ci-dessous (à l exception de l ADN) pour préparer les mastermix. Chaque extrait d ADN est analysé en «tripliquât» (3 répétitions). Veuillez noter que quatre mélanges réactionnels supplémentaires sont préparés afin de faciliter le calcul des erreurs de pipetage dues à la viscosité de la solution. Tableau 1. Préparation du mastermix pour une plaque d essai PCR multiplexe. Concentration PCR Mastermix pour cuve de réaction (µl) Mastermix pour un échantillon (3 répétitions) Mastermix pour une plaque (32+4 échantillons) Eau déionisée stérile 18,3 54,9 1976,4 TaqMan Universal Mastermix 2X 1x Amorce Le-F (20 µm) 40 nm 0,1 0,3 10,8 Amorce Le-R (20 µm) 40 nm 0,1 0,3 10,8 Amorce RR-F (20 µm) 100 nm 0,25 0,75 27 Amorce RR-R (20 µm) 100 nm 0,25 0,75 27 Sonde Le (10 µm) 100 nm 0,5 1,5 54 Sonde RR (10 µm) 100 nm 0,5 1,5 54 ADN ng 5 15 TOTAL Mélanger doucement et centrifuger brièvement. Préparer un tube microcentrifuge de 1,5 ml pour chaque échantillon d ADN à tester : échantillons de courbe standard (soja RR CRM à 0,1, 0,5, 1,2, et 5 %) échantillons inconnus et échantillons de contrôle (0 % soja RR, ADN de soja RR et contrôle sans matrice). Ajouter à chaque tube microcentrifuge la quantité de mastermix requise pour 3 répétitions (135 µl de mastermix). Ajouter à chaque tube la quantité d ADN requise pour 3 répétitions (c est-à-dire 15 µl d ADN). Passer chaque tube au moins trois fois pendant env. 10 secondes dans l agitateur vortex. Cette étape est primordiale, car elle contribue à réduire au maximum la variabilité entre les trois répliquâts de chaque échantillon.

7 Détection quantitative su soja Roundup Ready par PCR en temps réel 7 Centrifuger brièvement. Placer la plaque de réaction à 96 puits dans une base et aliquoter 50 µl dans chaque cupule horizontalement de gauche à droite. Après avoir ajouté les mastermix à une rangée verticale de puits, les couvrir avec des bouchons au moyen de l outil prévu à cet effet. NB : ne rien écrire sur la plaque optique et ne pas toucher les bouchons. Veiller à ce que les parties aliquotes de mastermix déposées se trouvent au fond des puits, et à ce qu il n y ait aucune éclaboussure ou bulle sur le côté ou à l intérieur des bouchons. Placer la plaque dans le thermocycleur ABI PRISM 7700 ; ouvrir une nouvelle fenêtre de configuration de plaque afin d assigner le type d échantillon à chaque puit : le type d échantillon IPC est associé au fluorochrome VIC et l échantillon UNKN (inconnu) à la couche FAM. Soumettre les échantillons aux cycles décrits au Tableau 2. Tableau 2. Programme de cycles pour l essai multiplex du soja RR dans le thermocycleur ABI PRISM 7700 SDS Configuration : mode PCR en temps réel Volume de réaction : 50 µl Étape Phase T C Durée Acquisition Cycles 1 UNG 50 o C 120 s Non 1x 2 Dénaturation initiale 95 o C 600 s Non 1x 3 Amplification Dénaturation 95 o C 15 s Non 45x 4 Hybridation & Élongation 60 o C 60 s Mesure Analyse des données et interprétation des résultats Une fois l opération terminée, les données sont analysées à l aide du logiciel ABI PRISM 7700 SDS pour déterminer les valeurs C T du fluorochrome rapporteur respectif de chaque échantillon. Il est essentiel de numéroter correctement les échantillons dans la fenêtre de configuration des plaques du logiciel SDS. Chaque cupule doit se voir affecter un numéro unique dans le champ «Replicate» ; les répliquâts d un même échantillon doivent se voir attribuer le même numéro.

8 Détection quantitative su soja Roundup Ready par PCR en temps réel 8 Procéder à l analyse en sélectionnant «analyse» dans le menu Analyse pour accéder automatiquement aux courbes d amplification ; régler la valeur de seuil pour les couches FAM et VIC. Après analyse, exporter les résultats dans un fichier Microsoft Excel. A l ouverture du fichier, un tableau contenant deux séries de données correspondant aux couches de fluorochromes FAM et VIC indique les valeurs C T correspondant à chaque puit. Calculer les moyennes C T (FAM) et C T (VIC) de chaque groupe de répliquâts pour déterminer les valeurs C T (C T FAM C T VIC ). Pour chaque échantillon, le pourcentage d OGM est calculé en analysant le C T de l échantillon, en le comparant à la série de valeurs log (% OGM) et aux valeurs C T obtenues pour les échantillons de la courbe standard.

9 Détection quantitative su soja Roundup Ready par PCR en temps réel 9 PCR en temps réel en utilisant le thermocycleur LightCycler (Roche) Protocole de PCR en temps réel spécifique du soja RR La méthode consiste en une amplification/quantification du gène de référence de la lectine et d une partie du transgène inséré dans le soja RR, réalisée en deux réactions PCR indépendantes (BgVV, Rapport d appel d offres UE, 2000). Les deux systèmes PCR utilisent des sondes marquées par le fluorochrome FAM. Pour chaque échantillon, la quantité de séquences spécifiques du soja GM et la séquence du gène de référence (gène de la lectine) sont déterminées à partir des courbes standard appropriées, élaborées à la fois pour le transgène et le gène de référence. La teneur en soja GM est divisée par la quantité de gène de référence afin d obtenir une valeur de soja GM normalisée. Équipement et réactifs Système de thermocycleur LightCycler Roche Capillaires pour échantillons LightCycler. Roche, cat. N Adaptateur de capillaires LightCycler. Roche, cat. N Sondes d hybridation LightCycler FastStart DNA Master. Roche, cat. N , contenant : ADN Polymérase Taq FastStart, mélange dntp (avec dutp au lieu de dttp) et tampon de réaction, conc. 10x ; eau stérile, classe PCR Sérumalbumine bovine (SAB), exempte de nucléase (exempte de DNase et de RNase), par ex. Promega, cat. N R9461 (1 µg/µl) ADN Polymérase Taq Platinum 5 U/µl (avec le tampon 10x original et 50 mm de MgCl 2 ). Invitrogen Life Technologies cat. N Microcentrifugeuse Micropipettes Agitateur vortex Portoir pour tubes de réaction Tubes microcentrifuges de 1,5 ml Eau exempte de nucléase Amorces (GM1-F et GM1-R) et sonde (sonde GM1) spécifiques du gène de référence Amorces (GM2 F, GM2-R) et sonde (sonde GM2) spécifiques du transgène

10 Détection quantitative su soja Roundup Ready par PCR en temps réel 10 Caractéristiques des amorces et de la sonde pour le gène de référence GM1-F 5 -CCA GCT TCG CCG CTT CCT TC-3 GM1-R 5 -GAA GGC AAG CCC ATC TGC AAG CC-3 Sonde GM1 5 -(FAM)-CTT CAC CTT CTA TGC CCC TGA CAC -(TAMRA)-3 Caractéristiques des amorces et de la sonde pour le transgène GM2-F 5 -CAT TTG GAG AGG ACA CGC TGA-3 GM2-R 5 -GAG CCA TGT TGT TAA TTT GTG CC-3 Sonde GM2 5 -(FAM)-CAA GCT GAC TCT AGC AGA TCT TTC (TAMRA)-3 Courbes standard Pour chaque série, les deux courbes standard sont obtenues avec 5 dilutions différentes d ADN de référence (étalonnage). Une seule réaction est effectuée avec chaque ADN standard d étalonnage avec les deux mastermix. Les courbes standard pour la quantification d ADN de soja et de la séquence spécifique de l OGM sont obtenues avec des solutions d ADN standard d étalonnage à des valeurs de concentration décroissantes partant de 2 % d ADN de soja RR avec un tampon TE (0,1 M, ph 8,0). Environ 100 ng d ADN sont utilisés pour le premier point des courbes standard. Les dilutions et les concentrations des courbes standard sont indiquées au Tableau 3.

11 Détection quantitative su soja Roundup Ready par PCR en temps réel 11 Tableau 3. Quantité d ADN et dilutions des courbes standard. Quantité d ADN (ng)/réaction % d ADN de soja % d ADN GM Facteur de dilution STD STD :2 STD ,5 1:4 STD 4 12,5 12,5 0,25 1:8 STD 5 6,25 6,25 0,125 1:16 Préparation du Mastermix Décongeler, mélanger doucement et centrifuger la quantité d éléments requise. Conserver les réactifs décongelés dans la glace. Pour chaque système, ajouter les éléments suivants dans l ordre indiqué ci-dessous (à l exception de l ADN) à un tube microcentrifuge de 1,5 ml dans la glace afin de préparer les mastermix. Veuillez noter que deux mélanges réactionnels comprennent un excès de volume pour tenir compte des erreurs de pipetage dues à la viscosité de la solution. Tableau 4. Préparation du mastermix pour le système GM1. Composant Concentration PCR µl/réaction Total µl (pour 18 réactions) Pol.ase Taq Platinum Tampon 10x MgCl 2 (50 mm) datp, dgtp, dctp,dttp (4 mm) Amorce GM1-F (20 µm) Amorce GM1-R (20 µm) Sonde GM1 (10 µm) SAB exempte de nucléase (1 µg/µl) Pol.ase Taq Platinum (5 U/µl) Eau exempte de nucléase ADN 1x 4 mm 0,8 mm 500 mm 500 nm 200 nm 0,1 mg/ml 0,8 U # 2 1,6 4 0,5 0,5 0,4 2 0,16 6, , ,2 36 2,9 123,5 Volume total : 18 µl+2 µl ADN 324,2 µl (sans ADN)

12 Détection quantitative su soja Roundup Ready par PCR en temps réel 12 Tableau 5. Préparation du mastermix pour le système GM2 Composant Concentration PCR µl/réaction Total µl (pour 18 réactions) Pol.ase Taq Platinum Tampon 10x MgCl 2 (50 mm) datp, dgtp, dctp,dttp (4 mm) Amorce GM2-F (20 µm) Amorce GM2-R (20 µm) Sonde GM2 (10 µm) SAB exempte de nucléase (1 µg/µl) Pol.ase Taq Platinum (5 U/µl) Eau exempte de nucléase ADN 1x 4 mm 0,8 mm 500 mm 500 nm 200 nm 0,1 mg/ml 0,8 U # 2 1,6 4 0,5 0,5 0,4 2 0,16 6, , ,2 36 2,9 123,5 Volume total : 18 µl+2 µl ADN µl (sans ADN) Mélanger doucement et centrifuger brièvement Préparer deux tubes de réaction de 0,5 ml (un pour le système GM1 et un pour le système GM2) pour chaque échantillon d ADN à tester (échantillons de courbe d étalonnage et échantillons inconnus) Ajouter à chaque tube de réaction la quantité de mastermix requise pour 2 répétitions (36 µl de mastermix). Ajouter à chaque tube la quantité d ADN requise pour 2 répétitions (c est-à-dire 4 µl d ADN). Passer chaque tube au moins trois fois pendant env. 10 secondes dans l agitateur vortex. Cette étape est primordiale, car elle contribue à réduire au maximum la variabilité entre les répliquâts de chaque échantillon. Placer les capillaires dans l adaptateur centrifuge préalablement refroidi. Pipeter 20 µl du mastermix dans chaque capillaire conformément au procédé prévu à cet effet (cf. le Tableau 6 «Configuration de la plaque ordre de chargement» - carrousel LightCycler standard) Centrifuger à basse vitesse (env tr/mn). Cette étape assure la concentration du volume total du mélange réactionnel dans l extrémité du capillaire Transférer les capillaires dans le carrousel LightCycler (Roche) Soumettre les échantillons aux cycles décrits au Tableau 7

13 Détection quantitative su soja Roundup Ready par PCR en temps réel 13 Tableau 6. Configuration de la plaque ordre de chargement du carrousel LightCycler : positions 1 à 16 = système GM1, positions 17 à 32 = système GM2. Chaque échantillon d ADN en double pour les systèmes du gène de référence et du transgène (OGM) Position Échantillon (%) Position Échantillon (%) Position Échantillon (%) 1 STD (100) 13 U2 25 STD (0,125) 2 STD (100) 14 U2 26 STD (0,125) 3 STD (50) 15 NTC 27 U1 4 STD (50) 16 NTC 28 U1 5 STD (25) 17 STD (2) 29 U2 6 STD (25) 18 STD (2) 30 U2 7 STD (12,5) 19 STD (1) 31 NTC 8 STD (12,5) 20 STD (1) 32 NTC 9 STD (6,25) 21 STD (0,5) 10 STD (6,25) 22 STD (0,5) 11 U1 23 STD (0,25) 12 U1 24 STD (0,25) Tableau 7. Programme de cycles pour le système LightCycler Réglage : pente 20 C/s à tous les paliers. Mode d affichage fluorescent : F1/1 Dénaturation : Cycles: Cycles: 1 Type: None Fluorescence Display Mode: F1/1 Segment Number Temp. Time Slope 2 Target Temp. Step Size Step Delay (Cycles) Acquisition Mode 1 96 C 120 sec 20 C/sec 0 C 0 C 0 None Cycles: 45 Type: Quantification Fluorescence Display Mode: F1/1 Segment Number Refroidissement: Temp. Time Slope 2 Target Temp. Step Size Step Delay (Cycles) Acquisition Mode 1 95 C 5 sec 20 C/sec 0 C 0 C 0 None 2 60 C 15 sec 20 C/sec 0 C 0 C 0 Single 3 72 C 15 sec 20 C/sec 0 C 0 C 0 None Cycles: 1 Type: None Fluorescence Display Mode: F1/1 Segment Number Temp. Time Slope 2 Target Temp. Step Size Step Delay (Cycles) Acquisition Mode 1 40 C 30 sec 20 C/sec 0 C 0 C 0 None

14 Détection quantitative su soja Roundup Ready par PCR en temps réel 14 Durant l opération, cliquer sur le bouton EDIT SAMPLE et introduire les noms des échantillons dans l écran de chargement. Définir toutes les positions (y compris l ADN d étalonnage) comme «Unknowns». Analyse des données et interprétation des résultats Pour l analyse des données, sélectionner «Fluorescence» F1/F2 dans la fenêtre avant d analyse des données. Pour la quantification, cliquer sur le bouton quantification. Le logiciel LightCycler propose deux méthodes de quantification différentes : la méthode «Second Derivative Maximum» et la méthode «Fit Points». Pour la quantification avec le kit de détection d ADN de soja RR, il est préférable d appliquer la méthode «Fit Points». Opérer les réglages suivants : réglage de base = «Proportionnal» ; nombre de points = 2. Sélectionner la courbe standard avec toutes les réactions d échantillons inconnus correspondantes. Ouvrir le dossier «Step 2: Noise Band». Placer le seuil de bruit de fond à une de position 0,1. Le seuil de bruit de fond peut être déplacé manuellement à l aide de la souris ou en appuyant sur le bouton en dessous du bouton «Chance Graph Settings». Ce bouton ouvre la fenêtre «Manual Cursor Adjustment» (réglage manuel du curseur) et la valeur du curseur peut être réglée sur 0,1. Ouvrir le dossier «Step 3: Analysis». A l étape 3, les points d intersection ainsi que les concentrations correspondantes de solutions étalon et de matrices d ADN inconnues sont calculés. Contrôler la valeur «r» de la courbe standard. Les valeurs r -0,98 sont acceptables ; valeur «r» optimale = -1.

15 Détection quantitative su soja Roundup Ready par PCR en temps réel 15 Références EU Tender Report. (2000). Development of qualitative as as well quantitative detection methods to identify a genetic modification in soybean and maize products. Report of the EU tender n. XXIV/98/A3/001. LightCycler Operator s Manual, version 3.0 (Roche Molecular Biochemicals). User Bullettin #2. Relative quantitation of gene expression. ABI PRISM 7700 Sequence Detection System. PE Applied Biosystems, User Bullettin #5. Multiplex PCR with TaqM VIC probes.abi PRISM 7700 Sequence Detection System. PE Applied Biosystems, Foti, N., Onori, R., Donnarumma, E., De Sanctis, B., and Miraglia, M. (2006). Real- Time PCR multiplex method for the quantification of Roundup Ready soybean in raw material and processed food. European Food Research and Technology Journal 222,