Techniques moléculaires non morphologiques. Dr S Poglio Année

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2 Techniques moléculaires non morphologiques Dr S Poglio Année

3 Généralités Techniques d Analyse : -Au niveau Tissulaire : IHC, macroscopie -Au niveau Cellulaire : FISH, culture, microscopie, cytométrie en flux -Au niveau Moléculaire : non morphologique 3

4 Généralités A B C 4

5 Généralités Récapitulatif de la transcription et la traduction: ADN polymérase ARN polymérase 5

6 Plan A- Techniques moléculaires d analyse de l ADN 1- Southern Blot 2- PCR 3- PCR quantitative 4- Methylation-specific PCR 5- Séquençage 6- CGH array Nb de copies Mutations Délétions B- Techniques moléculaires d analyse de l ARN 1- Northern Blot 2- RT-PCR quantitative 3- Puces d expression Expression C- Techniques moléculaires d analyse des Protéines 1- Western Blot Expression 2- Immunoprécipitation Interactions 6

7 1/ Southern blot: But : analyser la présence (et/ou les modifications) d une séquence donnée dans un génome Point de départ : ADN de bonne qualité (non dégradé) Quantité suffisante (minimum 10 mg) Sonde marquée (ap 32 ou autres) Principes : Sites de restriction disséminés sur le génome (fragments d ADN de taille connue) 7

8 1/ Southern blot: Etape 1: Digestion complète de l ADN ( multiples fragments de taille variable) 8 Ajout d enzymes de restriction. Chaque tube reçoit une enzyme de restriction différentes. Exemple: enzymes EcoR I dans le tube 1 et Not I dans le tube 2 Ex : EcoRI GAATTC CTTAAG Homo sapiens sites

9 1/ Southern blot: Séparation par électrophorèse sur gel d agarose ( taille) Ajout de bleu de bromophénol et prélèvement des échantillons. Migration de la cathode (-) à l anode (+) 9

10 1/ Southern blot: 90 mv pendant 1 heure Les fragments d ADN migrent d autant plus vite vers l anode qu ils sont de petites tailles agarose Arrêt de l électrophorèse lorsque le colorant, le plus rapide à migrer, arrive à la base inférieure du gel 10

11 1/ Southern blot: L ADN est alors coloré à l aide de bromure d éthidium, agent intercalant de l ADN. La coloration rougeâtre est révélée grâce aux UV. Dénaturation des brins d ADN double brin en monobrin par traitement alcalin. 11

12 1/ Southern blot: Transfert des ADN du gel sur un support (membrane nylon) Par capillarité, les fragments d ADN simples brins sont transférés sur la membrane de nitrocellulose 12

13 1/ Southern blot: Hybridation avec sonde complémentaire marquée (séquence d intérêt) Une exposition aux UV permet la formation des liaisons covalentes entre l ADN simple brin et la membrane Le milieu d hybridation contient des sondes radioactives d ADN simples brins 13

14 1/ Southern blot: Autoradiographie L hybridation correspond à la reconnaissance spécifique de la sonde radioactive avec une partie des fragments de l ADN On applique un film photographique à la surface de la membrane. Les radiations émises permettront l impression du film photographique. 14

15 1/ Southern blot: Ces deux bandes contiennent les fragments d ADN qui contiennent la séquence spécifique d intérêt. 15

16 Allèle sauvage EcoRI ATG TGA sonde 1 XbaI XbaI Allèle recombiné EcoRI ATG PGK-Hygro WT:8.2Kb TGA sonde1 Southern blot (XbaI) XbaI XbaI XbaI XbaI 8.2Kb Rec : 5.1Kb Rec Rec 5.1Kb Inconvénients : Long, bcp d ADN, mise en place lourde, radioactivité 16

17 2/ PCR: Polymerase Chain Reaction Buts : amplifier une séquence donnée pour la rendre plus facilement détectable / analysable (clonage, séquençage.) Principes : Taq DNA polymerase : Enzyme supportant des températures élevées Synthèse d ADN à 72 C 17

18 Points de départ de la PCR : - ADN de qualité moyenne voire médiocre (fragmentés) - Faibles quantités (ng) - Amorces/primers complémentaires (de synthèse donc de séquence connue) encadrant la région d intérêt ADN cible sens Anti-sens Primers dntps DNA polymérase Cations mono et di-valents 18

19 ADN Un cycle de PCR 1) Dénaturation (95 C) Amorces de synthèse complémentaires 2) Hybridation des amorces (TM 55/60 C) Pol Pol 3) Synthèse du brin complémentaire (72 C) Après 30 à 40 cycles, L analyse des produits de PCR est réalisée. 19

20 Analyse des produits de PCR amplifiés : - Migration (- +) en fonction de la taille Gel d agarose + visualisation après incorporation de Bromure d éthidium (BET = agent intercalant, fluorescent en lumière U.V.) - Marqueur de taille Marqueur de taille - 20 Interprétation : - amplification (1 bande ou non) - en fonction de la taille +

21 Exemple génotypage de population: +/Neo* X +/Neo* Allèle bp +/+ +/Neo* Neo*/Neo* 25.5% 55 % 19.5% +/+ +/Neo Neo/Neo Amorce commune et A. spécifique Allèle Neo* 800 bp Neo 800 bp 640 bp Migration Gel agarose +BET 21

22 3/ qpcr: PCR quantitative/en temps réel Definition: Suivi en temps réel de la réaction d amplification. But: Estimer la quantité initiale d ADN d un échantillon : - Par rapport à un autre échantillon (témoin) - En comparant avec une gamme étalon connue Avantages: Sensibilité, Reproductibilité Principe: Fluorescence 22

23 3-1 qpcr avec SYBR Green I dye: colorant des doubles brins d ADN. ADN double brin + colorant libre (fluorophore faible) Liaison à l ADN (fluorescence 1,000x) 23

24 ADN Un cycle de PCR 1) Dénaturation (95 C) Amorces de synthèse complémentaires 2) Hybridation des amorces (TM 55/60 C) Pol Pol 3) Synthèse du brin complémentaire (72 C) Détection de la fluorescence à chaque cycle 24

25 Mesure de la production des produits PCR en fonction du temps: Quantification ADN relative Fluorescence Plateau Echantillon A Echantillon B Phase exponentielle Bruit de fond Threshold (seuil) 0 c t (A) ct (B) Temps, Cycles - Concept : utilisation du Ct (threshold cycles) et non du plateau pour la quantification - Quantification ADN relative : A par rapport à B 25

26 Nombre de cycle Techniques d analyses moléculaires de l ADN Quantification réelle d ADN 1 copie de l ADN d intérêt 10 copies de l ADN d intérêt 100 copies de l ADN d intérêt Courbe étalon 26

27 Nombre de cycle Techniques d analyses moléculaires de l ADN Quantification réelle d ADN Courbe étalon Ct (A) Ct (B) Val (A) Val (B) 27

28 3-2 qpcr avec Sondes Internes (Fluorophores et Quenchers) Augmente la spécificité FRET: Fluorescence Resonance Energy Transfer 1. Le fluorochrome est inhibé par la proximité du suppresseur (quencher) 1. Les sondes sont séparées et n émettent pas de fluorescence 2. L amorce et la sonde s hybrident sur leurs séquences cibles 3. La polymérase déplace et hydrolyse la sonde. Le fluorochrome émet de la fluorescence. Plus on a de sondes hydrolysées, donc de cibles et plus on a de fluorescence 2. L amorce et les sondes s hybrident sur leurs séquences cibles. La proximité des fluorochromes permet le transfert d énergie de l un et l autre avec émission de fluorescence. 3. La polymérase déplace les sondes qui retournent à l état libre. 28

29 3-3 Applications Echantillon de cellules leucémiques 100% des cellules portent la délétion PTEN Gamme étalon avec différentes dilutions de cellules avec PTEN délété. Echantillons au diagnostic Conclusion: la population de cellule qui greffe dans les souris représente 0.07% de la population de départ 29 Clappier E et al. J Exp Med 2011;208:

30 4/ Methylation specific-pcr: OBJECTIF Allie les principes de la PCR ou qpcr pour vérifier l état de méthylation de l ADN Ex d ADN méthylé : - Séquences promotrices : à l origine de l activation/inhibition de l expression de gènes - Méthylation des Cytosines quand elles sont associées à une Guanine 30

31 PRINCIPE DE LA TECHNIQUE : M CG U CG ADN Traitement au bisulfite de sodium: déamination des cytosines en uraciles CG UG PCR (ou qpcr): GC AC (M : methylated U : unmethylated) 31

32 Stratégie : Primers spécifiques ADN méthylé Amplification possible ADN non méthylé TCATAG AGTATUGG Pas d amplification AGTATTGG 32

33 5/ Le séquençage: Le séquençage de l'adn consiste à déterminer l'ordre d'enchaînement des nucléotides pour un fragment d ADN donné 33

34 Séquençage des produits de PCR (car permet l amplification de l ADN à tester). - Sur produit pré-amplifié en PCR : direct sequençing (séquençage direct) - Sur produit pré-amplifié en PCR + purifié sur colonne - Sur produit pré-amplifié en PCR + purifié sur gel d agarose 34

35 M 35 Le choix de la technique de purification du produit de PCR (en vue du séquençage) se fera en fonction de l efficacité de la PCR

36 Séquençage direct: Peut être utilisé si un seul type de produit de PCR spécifique est généré. M Avantages: - Rapide et peu coûteux. - Rendement important. Inconvénients: - Requiert une optimisation. - Pas d élimination de produits spécifiques et des dimères d amorces. 36

37 Purification sur colonnes: - Utilisé pour la purification de produit pur de PCR et si des produits autre < 100pb sont présents. - Avantages - Rapide et facile - Reproductible - Inconvénients - Relativement cher - N élimine pas les produits de PCR 100pb 37

38 Purification sur gel: - Migration du produit de PCR sur gel d agarose 1% avec BET Coupe la bande d intérêt et utilisation de kit commerciaux - Qiaquick (QIAGEN) - MinElute (QIAGEN) M - Avantages " - Elimination des produits de PCR non spécifiques - Inconvénients: - Variable et rendement faible. - Temps long - L utilisation d UV peut dégrader l ADN. 38

39 Purification sur colonnes: - Application de l échantillon dans la partie supérieure de la colonne - Lavage avec solution contenant de l EtOH. - Centrifugation - Centrifugation + H 2 O distillée -Changer le tube -(tube collecteur) 39

40 4/ Le séquençage: Sanger Method Chain Termination Sequencing Matrice d ADN Taille du fragment Didéoxynucléotides = terminateurs de chaine 40

41 Sequencing Reaction: Separation of single-stranded DNA fragments Electrophoresis 41 T - A - C - T - A- G - G - T - A - C - T - A - T - C - G T - A - C - T - A- G - G - T - A - C - T - A - T - C T - A - C - T - A- G - G - T - A - C - T - A - T T - A - C - T - A- G - G - T - A - C - T - A T - A - C - T - A- G - G - T - A - C - T T - A - C - T - A- G - G - T - A - C separation matrix : gel or polymer Separation according to the size of the DNA fragment 1 bp resolution

42 BigDye Terminator Kits- Result Example: Heterozygote Detection v1.1 v Note: More homogenous peak pattern and better identification of mixed bases with version 3.1

43 Exemple de séquençage: Séquençage du gène PHF6 chez un patient atteint de leucémie aigue lymphoblastique T: Séquence normale: GGATTTTGCCATGTA Nat Genet. Apr 2010; 42(4): F= phénylalanine C= cystéine

44 6/ CGH array: Comparative Genomic hybridization array Principe : Analyse globale du génome Sur puces contenant des séquences connues, couvrant +/- le génome 44

45 6/CGH array: Principe Incorporation de dutp fluorescents Philippe Hupé - Emmanuel Barillot, Laurence Calzone, Philippe Hupé, Jean-Philippe Vert, Andrei Zinovyev, Computational Systems Biology of Cancer Chapman & Hall/CRC Mathematical & Computational Biology 45

46 ANALYSE III.Résultats Gain/Perte Sensibilité dépendant de la densité de la puce (ici 2000 bases entre 2 sondes) 46 Clappier E et al. J Exp Med 2011;208:

47 Microdissection et techniques moléculaires Développements en Recherche Clinique Analyse des Réarrangements IgH / TCR & des translocations à l échelon unicellulaire (B. Vergier et al, J Pathol 2002) B (CD 22) Lymphome B (CD22+) 5/13 IgH + 0/13 TCR + 0 T T (CD 3) Cellules T (CD3 +) 0/30 IgH + 5/30 TCR + (CD4+) 47 47

48 Techniques d analyses moléculaires de l ARN 1/ Northern Blot: But : analyser la présence (et/ou les modifications) d une séquence d ARNm Point de départ : ARN de bonne qualité (congélation +++) en quantité suffisante (minimum 5 mg) Sonde complémentaire marquée (ap 32 ou autres) Protocole : cf Southern Electrophorèse sur gel des ARN totaux en condition dénaturante séparation par taille Transfert sur support (membrane nylon) et fixation Hybridation avec sonde complémentaire marquée Lavages Révélation du signal (en fonction du marquage) Interprétation Intérêts : Quantitatif mais peu sensible/mise en place lourde 48

49 Techniques d analyses moléculaires de l ARN Exemple d utilisation du Northern Blot : Détection d un ARNm codant pour une protéine transmembranaire dans différents tissus. Largement remplacé par d autres techniques moins lourdes 49

50 Techniques d analyses moléculaires de l ARN 2/ RT-PCR quantitative: But : détecter la présence d un ARN spécifique par une approche voisine de la PCR. Nécessite une étape supplémentaire de transcription inverse Principes : Basée sur l activité de la transcriptase inverse qui permet à partir d un brin d ARN la synthèse d un brin d ADNc (ADN complémentaire). puis PCR sur cet ADNc ARNm ADNc mesure de la quantité d ADN Réverse Transcription PCR quantitative 50

51 Techniques d analyses moléculaires de l ARN 3 possibilités d amorces initiatrices pour la Réverse Transcription Random hexamers 5 AAAAAAA ARNm Amorces specifique d un ARNm 5 AAAAAAA ARNm PolyT 5 AAAAAAA ARNm TTTTTTT 51

52 Techniques d analyses moléculaires de l ARN Principe de la RT-PCR 5. Dégradation du brin d ARN 1. Hybridation de l amorce 6. PCR 2. Initiation de la réverse transcription 3. Synthèse de l ADN complémentaire 52

53 Techniques d analyses moléculaires de l ARN Exemple d application: Caractérisation des micro-arn (mir) dans sérum de patients: Sérum de patients avec cancer du poumons qrt-pcr Corrélation de l expression des micro-arn sérique avec survie? L expression de mir-155 corrélée à la survie 53 Feng Gao, Jingxia Chang, Huaqi Wang, Guojun Zhang. Oncology report. 2013

54 Techniques d analyses moléculaires de l ARN 3/ Puces d expression: But : étudier le transcriptome dans sa totalité Comparaison des niveaux d expression (ARNm) d un échantillon par rapport à une référence Principe : ARNm Réverse transcription cdna marqués par fluorophores différents Hybridation sur puces «d expression» (oligonucléotides ou cdna). Chaque puits = 1 cdna Analyse des intensités de fluorescence : «Heat Map» 54

55 FC<-3 Techniques d analyses moléculaires de l ARN Exemple d anamlyse d échantillons de leucémies: Echantillons «greffe rapide» Echantillons «greffe lente» Expression forte Expression moyenne Expression faible Analyse avec les programmes ingenuity Et GSEA Identification de la voie NF-kB Analyse fonctionnelle 55 Poglio S, Cahu X et al., Leukemia, 2014

56 Techniques d analyses moléculaires des protéines 1/ Le Western Blot: But : étudier l expression d une protéine à partir d extrait cellulaires ou tissulaires Principe : Cf Southern blot Migration des protéines sur gel Transfert sur membrane Saturation des sites de fixation aspécifique Incubation avec l anticorps primaire Lavages Incubation avec l anticorps secondaire marqué Lavages Détection du signal Difficulté : disposer d un anticorps primaire spécifique. 56

57 Techniques d analyses moléculaires des protéines Western Blot Migration Transfert Protéine d intérêt Incubation (Ac) 57 Détection du Signal

58 Techniques d analyses moléculaires des protéines Western blot Exemple de résultat doxycyclin 0h 24h 48h 72h p14 ARF UBF1 pubf (Ser 388) pubf (Ser 484) actin Mesure des niveaux d expression de protéines par rapport à un gène de référence qui ne varie pas (actine) 58

59 Techniques d analyses moléculaires des protéines 2/ Immunoprécipitation: Principe : Immunoprécipiter une protéine avec un anticorps spécifique But : - Concentrer la protéine d intérêt : IP (immunoprécipitation) - étudier son interaction avec d autres protéines : co-ip (coimmunoprécipitation) - étudier son interaction avec des séquences d ADN (promoteurs) : ChIP (chromatine immunoprécipitation) 59

60 Techniques d analyses moléculaires des protéines Extraction des noyaux + anticorps contre 1 protéine d intérêt (orange) + billes de liaison à l anticorps Western blot avec Ac dirigé contre l autre protéine (rouge) Lavage et récupération des protéines immunoprécipitées Immunoprécipitation 60