ED 1. Jacques Elion. M1 Biologie Santé UE Maladies Génétiques et Cancer. Remerciements Anne Dumay Grégory Gautier.

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1 M1 Biologie Santé UE Maladies Génétiques et Cancer Année universitaire ED 1 Jacques Elion jacques.elion@inserm.fr Remerciements Anne Dumay Grégory Gautier

2 CONTEXTE Facteur de transcription Nucléaire Fixation sur le promoteur d un gène Module l expression d un gène en fonction des besoins de la cellule - Protéines à doigt de zinc - Leucine Zipper (exemple des SREBP) - FOIE Métabolisme glucidique Métabolisme lipidique Alimentation / Insuline

3 Famille SREBP Sterol regulatory element binding proteins SREBP-1 SREBP-2 SREBP-1a SREBP-2 SREBP-1c 1a et 1c sont des isoformes (promoteurs alternatifs) Homologie ancêtre commun pas le même N-ter

4 Famille SREBP Sterol regulatory element binding proteins SREPB-1c et SREPB-2 sont synthétisés sous la forme d un précurseur :

5 Question 1 Simulation du jeûne influence de la privation en cholestérol sur les clivages protéolytiques activateurs SREBP-2 Transcription enzymes synthèse du cholestérol ± Stérols 48h + Transfection SREBP-2 sauvage (WT) SREBP-2 muté x D478RS AS x R519 A Western Blot Ac dirigé contre le domaine "Leucine- zipper " SREBP -2 Y Y Y * *

6 Mock : vecteur vide =125 kda =75 kda = 70 kda

7 WT - Stérols : 2 clivages et adressage au noyau du fragment de 70 kda WT + Stérols : pas de clivage ni d adressage au noyau (SREBP-2 totalement ancré dans la membrane du RE)

8 X

9 D478RSR AS - Stérols : 1 clivage sans adressage du fragment de 74 kda au noyau, ancrage membranaire D478RSR AS + Stérols : pas de clivage ni d adressage au noyau (SREBP-2 totalement ancré dans la membrane du RE) Résultats identiques au WT

10 X

11 R519A - Stérols : on ne détecte aucun fragment clivé Le clivage en 519 se fait en premier et est indispensable au clivage en 478

12 Modèle d activation 2 clivages successifs - R519 (stérol) - D478SRS (?) adressage au noyau de la forme mature? Q : 2 ème clivage stérol-dépendant? Q : nature du stérol? Q : Rôle du domaine «sensor sterol»?

13 Question 1 Rôle du domaine sterol sensor Expériences complémentaires Mutagénèse dirigée dans le domaine sterol sensor à Rôle du domaine dans les clivages Recherche de la ou des protéase(s) impliquée(s) dans les clivages de SREBP et effet des stérols sur ces protéases

14 Question 2 Action des facteurs SREBP sur la transcription de la glucokinase hépatique SREBP-1c OU SREBP-2 Co-transfection Promoteur GK luciférase Augmentation luciférase ó Augmentation activité promoteur GK Luciférase : émission d un photon en présence de son substrat

15 X Promoteur GK luciférase SREBP-2 OU SREBP-1c Promoteur GK luciférase

16 Question 2-a Promoteur GK sous le contrôle de SREB-1c Promoteur GK pas activé par SREB-2 à spécificité des facteurs de transcription

17 Question 2-b Site de fixation de SREBP-1c sur le promoteur de la GK Quelle région du promoteur fixe SREBP-1c? promoteur tronqué Promoteur GK luciférase -593 P GK luciférase -238 P GK luciférase -161 P GK luciférase Région -238 à -161 du promoteur de la GK est sous la dépendance de SREBP-1

18 Principe de l empreinte à la DNAse I

19 Question 2-b Site de fixation de SREBP-1c sur le promoteur de la GK Q : Région -238 à -161 Où se fixe SREBP-1c? SREa Région protégée de l action de la DNAse 1 2 SRE potentiels SREb

20 Question 2-b Site de fixation de SREBP-1c sur le promoteur de la GK Principe retard sur gel : Migration fragment nucléotidique avec ou sans une protéine capable d interagir avec cet ADN ou ARN. Si intéraction: un retard de migration est observé par rapport au fragment sans protéine NM M FT Mut migration FT NM : ADN non marqué FT : ADN 32 P + facteur transcription M : ADN marqué 32 P Comp : ADN muté 32P + FT

21 Question 2-b Site de fixation de SREBP-1c sur le promoteur de la GK 2 bandes retardées correspondant à la fixation de 1 ou 2 facteurs SREBP-1c ADN marqué 32 P

22 Question 2-b Expériences complémentaires Les sites SRE sont ils fonctionnels? Mutation de chacun des 2 SRE potentiels Fixation de SREBP-1c???

23 Question 2-b Expériences complémentaires SREa SREb Pas de fixation qd mutation Intensité SREb<SREa Pour valider la spécificité : compétition et super shift

24 Question 2-b Expériences complémentaires Conditions normales SREBP-1 se fixe sur sonde Gel shift avec compétition Anti-SREBP-1 complexe avec SREBP-1 SREBP-1 ne se fixe pas Compétiteur normal SREB1C se fixe sur sonde et compétiteur Diminution de la bande Compétiteur muté SREBP-1 se fixe seulement sur sonde Idem SREBP-1 a plus d affinité pour SREa

25 Question 2-b Expériences complémentaires Si mutation du site SREa ou SREb: pas de fixation de SREBP-1 sur le promoteur et donc pas d expression de la luciférase Les 2 SRE sont nécessaires pour une activation complète du promoteur par SREBP-1c

26 Question 2-c Influence de l état nutritionnel sur l expression de la GK A jeun nourrit Northern BLot Le régime riche en glucides induit transcription de GK et SREBP-1 mais pas de SREBP-2

27 Promoteur GK luciférase Question 2-c Effet de l insuline SRE a et b semblent impliqués dans l activation de la transcription de la GK par l insuline

28 Question 2-c Effet de l insuline RT- PCR semi quan@ta@ve Insuline augmente spécifiquement la transcription de la GK et de SREBP-1c sans affecter SREBP-1a

29 Question 2-c Effet de l insuline ChiP : Chromatin Immunoprecipitation à Mesure du changement de liaison de SREBP aux SRE en réponse à l'insuline à Culture d'hépatocytes en présence d'insuline. à Précipitation de la chromatine à Incubation avec sérum anti-srebp à Précipitation de l'adn à PCR avec des primers spécifiques du promoteur LGK

30 Question 2-c Effet de l insuline Insuline augmente la fixa@on de SREBP- 1 au promoteur de la LGK

31 Chromatin Immunoprecipitation