Effets de Stenotrophomonas maltophilia sur Aspergillus fumigatus dans un modèle de biofilm mixte in vitro

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1 Effets de Stenotrophomonas maltophilia sur Aspergillus fumigatus dans un modèle de biofilm mixte in vitro E. Melloul, S. Luiggi, L. Anaïs, P. Arné, J-M. Costa, V. Fihman, B. Briard, E. Dannaoui, J. Guillot, JW Decousser, A. Beauvais, F. Botterel Equipe Dynamyc EA 7380 (ENVA, UPEC)

2 Equipe Dynamyc 1 Dynamics in Mycology Dynamics of colonisa9on and infec9on by Aspergillus fumigatus in the respiratory tract of humans and animals Aspergillus fumigatus 1 2 bactéries Cellules épithéliales

3 Biofilm mixte 2 Communauté physique, métabolique et structurée de microorganismes, enrobés d une matrice hydratée, riche en polymères extracellulaires et en contact avec une surface biokque ou abiokque Kaur, 2014 è Hypoxie, modifica9on du ph Infec9ons persistantes Tolérance aux an9microbiens Résistance aux défenses de l hôte

4 Introduc9on Pathogènes opportunistes 3 A. fumigatus Emergence de résistance aux ATF S. maltophilia Bactérie Gram négatif Proche de P. aeruginosa Multi résistante aux ATB - Agents opportunistes - Saprophytes de l environnement - Présents dans le tractus respiratoire è Patients atteints de mucoviscidose (stades avancés) 1 è Patients immunodéprimés 2 1. Sudfeld CR et al. J Cystic Fib Cabaret O et al. J Med Microbiol 2016

5 Objec9fs de l étude 4 è Développement d un biofilm mixte S. maltophilia/a. fumigatus è Étude des interac9ons entre les deux microorganismes

6 Matériels et méthodes Biofilm mixte 5 A. fumigatus ATCC GFP J.A. Wasylnka PréparaKon des microorganismes (MO) Croissance en condi9on sta9que : 24 h à 37 C S. maltophilia ATCC Lavages (élimina9on des MO en phase planctonique) Sm = 10 6 cells/ml Af = 10 5 spores/ml 10 6 cells/ml Sm spores/ml Af RPMI (contrôle - ) Milieu de culture RPMI + SVF 10% Cristal Violet PCR quan9ta9ve Microscopies

7 Matériels et méthodes Analyses du biofilm 6 Analyse qualitatives Microscopies à fluorescence (MF) et électronique (MEB et MET) Cristal Violet (CV) Analyse quantitatives PCR quanktakve (qpcr) But : Valida9on du modèle et analyse phénotypique du champignon! Collaboration : Plateformes d imagerie But : Quan9fica9on de la biomasse totale (MO + MEC) CondiKons : CV 0,01 % Unité : Densité op9que (DO)! Collaboration : Unité des Aspergillus But : Quan9fica9on des MO au sein du biofilm CondiKons : Gènes cibles 28S (Af) et 23S (Sm) mul9plex en temps réel Unité : Équivalent cellules (EC) Biofilm + -

8 Résultats Biofilms en microscopie IF/ MEB Biofilms simples vs biofilms mixtes Cinétique de formation des biofilms Phénotype fongique Analyse de la MEC Interactions S. maltophilia A. fumigatus

9 Résultats Biofilm mixte Présence des deux micro- organismes enchâssés dans une matrice extracellulaire MET 8

10 CV Résultats Biomasse des biofilms 10 è Augmenta9on des biomasses au cours du temps

11 CV Résultats Biomasse des biofilms 10 è Inhibi9on de la biomasse du biofilm mixte par rapport à Af

12 qpcr Résultats Croissance des microorganismes 11 è Croissance normale des microorganismes au cours du temps

13 Résultats Croissance des microorganismes qpcr 11 è Croissance de Sm iden9que dans biofilms simple et mixte è Inhibi9on de la croissance d Af dans biofilm mixte

14 Résultats effet inhibiteur de Sm sur Af Biofilm Af FLUO Biofilm mixte è En présence de bactéries, ramifica9ons courtes du champignon, réseau moins dense, conidies rares, structures atrophiées Melloul E et al. Soumis

15 Résultats effet inhibiteur de Sm sur Af ± 4.6 nm ± 3.3 nm è Augmenta9on de l épaisseur de la paroi d Af en présence de la bactérie MET

16 Modèle de biofilm mixte 12 Valida9on du modèle de biofilm mixte þ þ þ Présence des deux MO et de la MEC (Microscopie) Croissance du biofilm mixte (CV) Croissance des deux MO au sein du biofilm mixte (qpcr) Effet inhibiteur de la bactérie Sm sur le champignon Af þ þ þ Inhibi9on de la biomasse (CV) Inhibi9on de la croissance d Af (qpcr et MF)) Paroi du champignon (MET)

17 Modèle de biofilm mixte 12 Valida9on du modèle de biofilm mixte þ þ þ Présence des deux MO et de la MEC (Microscopie) Croissance du biofilm mixte (CV) Croissance des deux MO au sein du biofilm mixte (qpcr) Effet inhibiteur de S. maltophilia sur A. fumigatus þ þ þ Inhibi9on de la biomasse (CV) Inhibi9on de la croissance d A. fumigatus (qpcr) Paroi du champignon (MET)

18 Discussion 14 Biofilms mixtes champignon filamenteux + bactéries rares dans la lioérature 1,2 Diminu9on de croissance d A. fumigatus en présence de S. maltophilia Effet direct ou indirect de la bactérie sur le champignon? Briard et al., 2015 (Institut Pasteur) è Molécules (phénazines) sécrétées par P. aeruginosa = effet inhibiteur sur A. fumigatus Mowat et al., 2010 è Effet indirect de molécules sécrétées par P. aeruginosa sur la croissance du biofilm d A. fumigatus Manavathu EK et al. BMC Microbiol 2014 Granillo AR et al. BMC Microbiol 2015

19 Conclusion - Perspec9ves 15 Valida9on du modèle de biofilm mixte 1. ComposiKon en sucres de la MEC et de la paroi d Af dans le biofilm mixte ü différences de chi9ne, cellulose dans paroi entre biofilm simple et mixte Collaboration avec l Unité des Aspergillus, Institut Pasteur de Paris Aspergillus fumigatus 1 2 bactéries Biofilm mixte 3 Cellules CFTR+ (lignée S9) Cellules CFTR- (lignée IB3-1) 2. Expérience sur cellules épithéliales respiratoires in vitro ü Analyse des agents an9microbiens sur les cellules en présence de biofilm ü Evalua9on de la réponse inflammatoire des cellules épithéliales face à un biofilm mixte vs un biofilm simple sur un épithélium in vitro (RNAseq)

20 Remerciements Equipe Dynamyc J. Guillot F. Booerel C. Angebault E. Dannaoui P. Arné Etudiants V. Risco E. Melloul F. Foulet J.M. Costa S. Luiggi L. Anais N. Ait- Ammar D. Rivollet Plateformes d imagerie X. Decrouy (IMRB) P. Ausset (LISA) Laboratoire de Bactériologie J.W. Decousser V. Fihman Unité des Aspergillus A. Beauvais B. Briard J.P. Latgé

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22 Résultats Biofilm mixte Hyphes A. fumigatus MET 8

23 Résultats Biofilm mixte Bactéries S. maltophilia MET 8

24 Résultats Biofilm mixte Matrice extracellulaire MET 8

25 Résultats Biofilms simples MEB 7 A. fumigatus S. maltophilia Matrice Extracellulaire Biofilm simple Af 25µm Biofilm simple Sm 10µm