INTERACTIONS PROTEINE - PROTEINE

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1 INTERACTIONS PROTEINE - PROTEINE 1. Introduction Les génomes de différentes espèces ayant été séquencés ces dernières années, la majorité des efforts de la communauté scientifique se porte aujourd hui sur l'analyse du produit des gènes, les protéines. En effet, la fonction biologique de la plupart de ces molécules codées par les gènes ne sont pas encore connus. L étude des protéines est appelée la protéomique. Comment accéder à la fonction (aux fonctions) d une protéine X? Analyse in silico : Recherche de protéines présentant des homologies de séquences avec cette protéine, recherche de domaines connus (de liaison à l ADN par exemple), Etudes biochimiques : recherche d une activité enzymatique Etudes de biologie cellulaire : Types cellulaires/compartiments dans lesquels la protéine X est présente Etudes de biologie structurale : recherche de domaines structuraux de fonction connue Etudes génétiques : inactivation du gène (KO, RNAi) suivie d étude du phénotype obtenu Etudes biologie moléculaire : quels sont les facteurs impliqués dans la régulation de ce gène? Comme les protéines fonctionnent le plus souvent (toujours?) en réseaux, l'identification des interactions entre protéines permet de mieux comprendre leur fonction (si la fonction du (des) partenaires de la protéine X est connue, cela nous donnera des informations sur sa propre fonction) et permettra éventuellement de découvrir de nouvelles cibles thérapeutiques. => Etude de l INTERACTOME 2 Recherche de partenaires protéiques à partir d une banque d ADNc Principe de ces techniques : Les partenaires protéiques de la protéine d intérêt (que nous appellerons la protéine appât) seront recherchés à partir de banques d ADNc. Ces ADNc seront transcrits puis traduits chez un hôte particulier (la nature de l hôte dépend de la technique choisie). L interaction sera révélée par différentes méthodologies décrites par la suite. Intérêt de ces techniques : une fois le partenaire identifié, on aura directement accès à son ADNc. Simplicité de mise en œuvre Inconvénients : Les interactions binaires pourront essentiellement être étudiées les interactions sont réalisées de façon artificielle dans un organisme qui n est pas celui auquel appartiennent normalement les protéines étudiées (problème de quantité relative de chacun des partenaires, de compartimentation de la cellule, de modifications post-traductionnelles, ). 1

2 Double hybride ou «piège à interaction». Cette technique est basée sur la capacité des domaines de liaison à l ADN (BD) et d activation de la transcription (AD) du facteur de transcription Gal4 à fonctionner de manière indépendante. Dans le système du double hybride, ces deux domaines sont séparés et chacun est fusionné aux protéines d intérêt (X et Y). Ainsi, c est l interaction entre les deux protéines X et Y qui permettra de reconstituer un facteur de transcription actif. Il y aura alors transcription de gènes rapporteurs. Gène rapporteur : gène non présent dans la souche de levure utilisée et dont l expression est facilement repérable. Ex : lacz : gène d E. coli, non présent chez S. cerevisiae facile à repérer grâce à son activité enzymatique. Autres rapporteurs utilisés : gènes d auxotrophie : HIS, ADE, URA. La séquence codant la protéine X (l appât) sera fusionnée à la séquence codant pour le domaine de liaison à l ADN de Gal4 -> clonée dans un plasmide La proie (protéine Y) correspondra soit à l ADNc de la protéine dont on veut tester son interaction avec la protéine X, soit une banque d ADNc si aucune expérience préliminaire n a encore été réalisée. Sa séquence sera fusionnée avec le domaine d activation de la transcription de Gal4. -> clonée dans un plasmide. Le gène rapporteur, précédé du promoteur portant les sites de liaison de Gal 4 (répétés 6x), est inséré dans le génome de la levure. Parmi les sites de liaison de Gal4, l UAS de Gal1 est souvent utilisé. UAS : Upstream Activated Sequence Les deux plasmides sont co-transformés dans la souche de levure appropriée présentant le gène rapporteur sous la dépendance d une UAS de Gal4 et déficiente pour les gènes d auxotrophie utilisés comme marqueurs de sélection. Les protéines X et Y n interagissent pas. Y Gal 4 AD Pas d expression Gal 4 BD X ARN Pol II Gène rapporteur Sites de liaison de Gal 4 Les protéines X et Y interagissent. Gal 4 BD X Y Gal 4 AD ARN Pol II Expression Gène rapporteur Si le gène rapporteur est LacZ, les colonies positives seront capables de pousser sur milieu galactose et, en présence de Xgal, les levures seront bleues. Sites de liaison de Gal 4 2

3 Xgal : Le X-gal, (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-galactopyranoside) est un dérivé du galactose, lié à un noyau indole. Il peut être hydrolysé par la β-galactosidase, produit du gène LacZ, en formant un composé bleu, ce qui permet de détecter la présence de cette enzyme. Xgal Les Plasmides : Origine de réplication procaryotes : puc ori, 2 ori Marqueurs de sélection bactérien : Amp r (gène de résistance à l ampicilline), Kan r (gène de résistance à la kanamicine) P ADH1 T ADH1 : Promoteur et terminateur de levure Gènes d auxotrophie (marqueur de sélection chez la levure) : LEU2 et TRP1 Les levures utilisées pour ce double hybride seront donc : Gal4 -, déficientes pour les gènes d auxotrophie utilisés (LEU2 et TRP1), et porteront le gène rapporteur (sous la dépendance de Gal4) inséré dans leur génome. Ces levures seront cultivées sur des boites en présence d un milieu de culture sans leucine, sans tryptophane et en présence de XGal. Avantages de cette technique : Plus sensible que la technique précédente. Inconvénients de cette technique : Nombreux faux positifs ou négatifs (faire des contrôles) Si on veut tester un grand nombre de partenaires, il faudra cribler un grand nombre de boîtes ce qui alourdi considérablement l expérimentation. 3 - Recherche de partenaires protéiques à partir d un extrait protéique : Coimmunoprécipitation (co IP) 3 1 : Principe général : La co immunoprécipitation est une technique qui consiste à isoler un complexe protéique en utilisant un anticorps dirigé contre un des membres du complexe. Avec elle seront isolés ses partenaires protéiques. Ces protéines seront alors identifiées. Bille de sépharose Protéine A Anticorps Protéine cible Partenaire 3

4 L anticorps utilisé sera de préférence un anticorps polyclonal, afin d éviter que l épitope reconnu par l anticorps ne soit masqué dans le complexe. L immunoprécipitation se fera en utilisant de la protéine A ou de la protéine G, couplée à des billes de sépharose. Le choix protéine A / protéine G dépend de l anticorps que l on va utiliser. Les protéines A et G sont des protéines d origine microbienne qui présentent la capacité de fixer les molécules d immunoglobuline de mammifère. Ces protéines sont couplées de façon covalente à des billes de sépharose. L interaction entre ces protéines et les immunoglobulines n est pas équivalente pour toutes les catégories d anticorps : Antibody Protein A Protein G W = interaction faible Human IgG S S S = interaction forte Goat IgG W S NB = pas d interaction Chicken IgG NB NB Si les Ig dont nous disposons pour faire l immunoprécipitation ne se fixent ni sur la protéine A, ni sur la protéine G, il est toujours possible de faire un «sandwich» : 3 2 : Méthodologie : Le matériel de départ est un extrait protéique. On peut éventuellement simplifier le système en faisant du fractionnement cellulaire. On va dans un premier temps ajouter l anticorps dirigé contre notre protéine puis des billes protéine A/ G. On va centrifuger et récupérer les billes que l on va laver afin de se débarrasser de toutes les interactions non spécifiques. Enfin, il faudra éluer les complexes des billes. Différentes techniques sont alors possibles en fonction du type d analyse que l on veut réaliser sur les co-immunoprécipitats (reprendre dans du tampon SDS/DTT et chauffer si on veut faire une séparation sur gel polyacrylamide dénaturant, élution par la force ionique, élution par un peptide compétiteur, élution par choc acide, ). Un contrôle est réalisé avec un Ac non relevant (généralement anti idiotype). 3 3 : Identification des protéines du complexe : Une fois les complexes isolés, elles devront être identifiées. Cependant, une étape de séparation des membres du complexe (par électrophorèse sur gel SDS-PAGE) est souvent utilisée comme étape préliminaire. Après coloration (généralement avec du bleu de coomassie), le gel sera découpé en bandes de tailles égales. Les protéines contenues dans les bandes découpées sont alors digérée à la trypsine (ou toute autre protéase spécifique). La masse précise de l ensemble des peptides obtenus est alors déterminée par spectrométrie Maldi ToF (ou autre spectrophotomètre de masse présentant ce type d ionisation). La comparaison avec des banques de données nous permet d identifier la protéine recherchée. Si des ambiguïtés restent à lever, un séquençage par LC/MS/MS est possible. 4

5 3 4 : Avantages/inconvénients : Avantages de la co IP : Le complexe s est formé in vivo avec de la protéine «endogène». L affinité Ag/Ac est généralement très forte, on peut donc utiliser des lavages à forte force ionique pour ne récupérer que les protéines partenaires fortement liées sans risquer de dissocier la liaison Ag /Ac. La liaison Ag/Ac est très spécifique. Inconvénient de la coip : Il faut avoir un Ac immunoprécipitant c'est-à-dire un anticorps reconnaissant la protéine appât au sein d un complexe avec à la fois une forte affinité et une grande spécificité. Si la quantité d appât est trop faible, la quantité de complexe isolée sera insuffisante pour l identification. Dans le cas de complexes de tailles très importantes, le/les épitope(s) peuvent être masqués. Pour cette technique également, il faudra réaliser différents contrôles et en particulier extrait +billes protéine A/G+Ac non spécifique. 3 5 : Alternatives à la Co Immunoprécipitation : exemple du pull down. Quand l immunoprécipitation n est pas possible (on n a pas d anticorps utilisable pour l immunoprécipitation ou la protéine appât est en quantité trop faible), on peut utiliser des variantes à cette technique que sont les chromatographies d affinité ou les «pull down» qui ne sont autre que des chromatographies d affinité pour lesquelles la phase stationnaire n est pas insérée dans une colonne mais est récupérée par centrifugation. Support solide Pour la purification d un complexe protéique associé à une protéine, on utilise un support solide constitué de billes de sépharose sur lesquelles on a greffé un ligand présentant une forte affinité avec la protéine X. Tag Protéine cible Partenaire Ces billes seront alors introduites dans une colonne. Ensuite on fait passer l extrait de protéine contenant la protéine X. Après différents lavages, l élution se fera le plus souvent à l aide d un compétiteur, d un gradient de force ionique ou dans un tampon dénaturant. Si la protéine appât ne possède pas naturellement de ligand connu, on utilisera une protéine X taguée. Ce tag sera éloigné de notre protéine grâce à un espaceur qui permettra l interaction quelque soit la taille et la géométrie du complexe. On a alors deux possibilités : soit on transfecte (transforme) nos cellules par un vecteur d expression portant l ADNc de la protéine appât fusionné avec une (ou plusieurs) étiquette(s), soit la protéine tagguée aura été au préalablement préparée. Dans ces cas-là, c est le ligand du tag qui sera fixé sur les billes. 5

6 L inconvénient de ces deux variantes est qu on ne travaille plus sur une protéine sauvage mais sur une protéine modifiée. La quantité de protéine appât est généralement plus importante que la protéine endogène ce qui peut engendrer des faux positifs. Ex. GST pull down, complexe formé in vitro. GST : glutathione Sulfo Transférase fusionné avec la protéine X. Fixation et lavage SDS-PAGE On veut tester la liaison de la protéine X avec la protéine Y: 1 - fusionner la protéine X avec la GST et marquer la protéine Y. 2 - fixer la protéine X sur des billes de glutathione sépharose 3 - ajouter la protéine Y en présence d une grande quantité de protéines Protéine X, fusionnée à la GST Bille de glutathione sépharose Protéine Y, radioactive Autoradiographie Coloration Protéines compétiteurs coomassie La même technique peut être utilisée pour aller «pêcher» des partenaires de la protéine X dans un extrait protéique complexe. Témoins : billes + extraits, billes + GST + extraits. Avantage de cette technique : simple et rapide Inconvénients : Fait en dehors du contexte cellulaire Souvent des «faux positifs», valider la validité de ces interactions par une autre technique, si possible «in vivo». Quelle que soit la technique utilisée, les interactions doivent ensuite être vérifiées in vitro et même de préférence in vivo afin de S assurer de la validité de l interaction Vérifier si cette interaction est directe ou indirecte. 4 Vérification des interactions protéine/protéine. Pour tester l interaction entre une protéine X et une protéine Y ou vérifier la validité d un partenaire, toutes les techniques permettant de rechercher des partenaires protéiques peuvent être utilisées. Cependant, dans le 6

7 cas de la vérification d une interaction, il faudra changer de type d expérience mais aussi inverser la nature de l appât et de la proie (si la protéine Y a été identifiée comme partenaire de la protéine X en utilisant cette dernière comme appât, la vérification se fera en prenant la protéine Y comme appât). 4.1 Colocalisation par immunofluorescence Rappels sur l immunofluorescence : L'immunofluorescence permet la détection et la localisation d'une ou plusieurs protéines grâce à l'utilisation d'anticorps. La réalisation d'un marquage passe par différentes étapes : (i) prétraitement (fixation et perméabilisation) du tissu ou des cellules, (ii) ajout de l'anticorps primaire puis lavages, (iii) ajout de l'anticorps secondaire spécifique de l anticorps primaire couplé à un fluorochrome puis lavages, (iv) révélation du signal fluorescent à l'aide d'un microscope de fluorescence ou par microscopie confocale. L'immunofluorescence est utilisée sur les cellules en culture (d'immunocytochimie) ou sur des coupes de tissus (immunohistochimie). I ii iii iv Utilisation de l immunofluorescence pour faire de la colocalisation de protéines : Pour que deux protéines puissent interagir in vivo, il faut qu elles se trouvent à proximité dans la cellule. Pour vérifier cela, l immunofluorescence sera réalisée de la même façon que décrite précédemment mais on met les deux anticorps primaires dirigés contre les deux protéines dont on veut tester la colocalisation puis les deux anticorps secondaires dirigés contre les deux anticorps primaires et portant des fluorochromes différents. Il est impératif que les deux anticorps primaires soient de type différent afin que l on puisse différencier les signaux des anticorps secondaires. L acquisition des deux signaux se fait indépendamment puis on superpose les deux images pour voir s il y a colocalisation. Exemple : Une protéine détectée avec un anticorps préparé dans la chèvre et la deuxième avec un anticorps préparé dans la souris. L anticorps secondaire révélant la première protéine est un anticorps anti anticorps de chèvre couplé à la Cy3 (fluorescence rouge) et l anticorps secondaire révélant la deuxième protéine est un anticorps anti anticorps de souris couplé au FITC (fluorescence verte). La superposition des deux images montre un signal jaune, ce qui nous permet de valider l hypothèse d une colocalisation de ces deux protéines. Avantages de cette technique : la visualisation de la colocalisation se fait in vivo sur des protéines endogènes. 7

8 Inconvénients : Il faut avoir des anticorps spécifiques des deux protéines à tester, les anticorps doivent pouvoir être différenciés (organismes à partir desquels ils ont été préparés différents ou isotypes différents). La concentration de chacune des protéines doit être suffisamment importante pour pouvoir être révélée par cette technique qui n est pas très sensible. Pour cette technique, l interaction n est pas prouvée, on montre juste que cette interaction est possible de part la localisation des partenaires. Cette expérience n est donc en aucun cas suffisante pour démontrer une interaction. 4.2 FRET (Föster Resonance Energy Transfer) Le FRET permet de détecter la proximité de deux molécules et donc de visualiser directement leur interaction par un transfert d énergie de fluorescence. Chacune de ces molécules porte un groupement fluorescent et la technique repose sur le transfert, par résonance, de l excitation de l un de ces groupements (le donneur) à l autre (l accepteur) sans émission d un photon. Le receveur excité libère un photon qui est détecté et indique que le donneur et le receveur sont à proximité l un de l autre car l efficacité du FRET est proportionnelle à la distance entre ces deux molécules. Pour cela, les deux partenaires de l interaction (protéines A et B) sont conjugués avec un couple de fluorophores de couleurs différentes. On excite ensuite le donneur A. Si l interaction entre A et B amène les fluorophores à faible distance l un de l autre, un signal de fluorescence nouveau (issu de l émission du receveur B) est développé. La présence de ce signal confirme la faible distance et donc l interaction entre A et B. Ces interactions peuvent être suivies en temps réel grâce à une caméra jointe au microscope à fluorescence. La famille des GFP (Green Fluorescent Protein) offre différentes paires de mutants utilisables pour ces expériences (exemple, le mutant EGFP (Enhanced GFP) et le mutant BFP (Blue Fluorescent Protein)). Avantage de cette technique : La visualisation de l interaction se fait dans les cellules vivantes 8

9 Inconvénients : on ne travaille pas sur des protéines endogènes. 9

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