De la molécule aux organismes: construction et fonctionnement des organismes. Sylvain Chaillou Professeur AgroParisTech Juillet 2008

Transcription

1 De la molécule aux organismes: construction et fonctionnement des organismes Sylvain Chaillou Professeur AgroParisTech Juillet 2008

2 Pourquoi la nutrition azotée des plantes estelle un sujet de recherche important? Pour maîtriser la fertilisation: éviter les problèmes liés aux excès d engrais qui entraînent une pollution du sol et des eaux, donc pour inventer une «agriculture qui respecte l environnement». Pour améliorer la qualité des produits: augmenter la teneur en protéines des grains, abaisser la concentration en nitrate dans les légumes ou les fourrages. Pour dépolluer les sols et les eaux: création de plantes épuratrices? 2

3 Pour atteindre de tels objectifs, il faut connaître la physiologie de la nutrition de la plante. Quels sont les mécanismes d absorption de l azote par la racine (y compris au niveau moléculaire)? Quelles sont les régulations possibles en fonction de l environnement? Comment l azote absorbé est-il assimilé (voies métaboliques, gènes impliqués)? Comment les composés azotés sont-ils distribués dans les différentes parties de la plante? Quelles sont les variations des besoins de la plante selon son stade de développement ou sa vitesse de croissance? 3

4 Le Laboratoire de Nutrition Azotée des Plantes (INRA Versailles) Conduit des recherches sur l efficacité d utilisation de l azote: - Prélèvement de l azote par la racine - Stockage ou utilisation immédiate - Mobilisation à certains stades de développement et en réponse aux contraintes de l environnement Les connaissances acquises devraient permettre de créer de nouvelles variétés moins exigeantes en azote. 4

5 La plante et l azote: des relations encore bien mystérieuses L azote est absorbé par la plante, essentiellement sous forme de nitrate. Il a fallu développer des approches réductionnistes pour tenter de trouver les mécanismes d absorption qui restent encore très mal connus. Tout commence au niveau de la racine. 5

6 La racine peut s envisager de différentes manières : comme ceci ( 6

7 Ou comme cela Tout se passe au niveau des poils absorbants ( 7

8 Zone d épuisement autour de la racine Autoradiographie de racines de maïs dans du sable marqué au 33 P, 5 jours après germination Jungk (1991) 8

9 Vitesse d absorption Il existe deux systèmes de transport du nitrate HATS High Affinity Transport System LATS Low Affinity Transport System 0 1 mm Concentration en NO 3 - dans le milieu extérieur 9

10 A la recherche du transporteur de nitrate: des approches qui n ont pas abouti Etude du profil protéique chez des plantes aptes à absorber le nitrate. Problème de la faible quantité de protéines de transport. Utilisation de liposomes dans lesquels on inclut des fragments de membranes de plantes susceptibles de contenir le transporteur. Problème pour détecter le fonctionnement du transporteur. Approche immunologique: des anticorps peuvent être dirigés contre des protéines de membranes de plantes absorbant le nitrate. 10

11 Arabidopsis thaliana 11

12 La génétique moléculaire permet enfin de faire un grand pas vers le transporteur -Une belle histoire qui commence avec des observations de botanistes dès les années 1980: ils découvrent des mutants d Arabidopsis incapables d absorber le nitrate. -C est ensuite grâce aux mutants étiquetés par insertion d ADN-T que l on va remonter jusqu au gène. -Découverte de CHL1 (en 1993), gène d un transporteur à faible affinité, par étude d un mutant d Arabidopsis résistant au chlorate. Preuves fonctionnelles du transport : injection de l ARNm dans des oocytes de xénope. 12

13 Sélection de mutants («screening») résistants au chlorate Boîte de Petri avec milieu chlorate Jeune plante résistante au chlorate 13

14 Test de sensibilité au chlorate sauvages mutants chl-1 Liu et al, The Plant Cell 11 (Mai 1999),

15 Utilisation de mutants affectés dans le transport du nitrate (Tsay et al, 1993) Mutant (insertion ADN-T) d Arabidopsis thaliana incapable d absorber le nitrate, ni le chlorate mais capable de les réduire Clonage du gène (appelé Chl-1) responsable de cette mutation Synthèse de l ARNm correspondant à ce gène Injection de cet ARNm dans des oocytes de xénope (qui normalement n absorbent pas le nitrate) L addition de nitrate dans le milieu d incubation des oocytes provoque un transport de nitrate à l intérieur des oocytes. Le gène Chl-1 code donc bien pour un transporteur de nitrate. 15

16 Caractérisation de l activité de transport des protéines NRT2 Expression hétérologue des protéines membranaires dans des Ovocytes de Xenope Xenopus laevis Ovocytes utilisables Ovocytes endommagés 16

17 Microinjection d ARNm dans des Ovocytes de Xenopes pôle Végétatif pôle Animal 1mm micropipette 17

18 PAR LA SUITE, DE NOMBREUX CHERCHEURS VONT DECOUVRIR D AUTRES GENES -Découverte de plusieurs gènes de transporteurs à forte ou faible affinité ( ), par homologie de séquences avec des gènes déjà isolés. Les preuves fonctionnelles du transport ne sont pour l instant qu indirectes : expression du gène localisée dans les racines, ne répond qu au nitrate, expression parallèle à l influx de nitrate. -Pour ces gènes, des preuves fonctionnelles du transport sont en cours d obtention : création de plantes transgéniques dans lesquelles l expression du gène est accrue ou au contraire diminuée (voire éteinte), caractérisation de mutants chez lesquels le gène a été disrupté. 18

19 Expression du gène parallèle à l influx de nitrate Lejay et al, The Plant Journal (1999), 18 (5),

20 L utilisation de mutants permet de confirmer le rôle d un gène dans le transport à haute affinité du nitrate Analysis of the k.o.mutant atnrt2.1a AtNRT2.1 AtNRT2.2 RB T-DNA LB A 25 kb deletion occurs in the atnrt2.1a mutant NO 3 - influx External NO 3 - concentration (µm) wild type atnrt2-a...and affects the nitrate influx 20

21 Mais les choses sont un peu plus compliquées qu il n y paraissait: On a isolé des gènes de transport à faible affinité, les NRT1 ou à forte affinité, les NRT2. On découvre alors la double affinité de l un des transporteurs, régulée par phosphorylation de la protéine. 21

22 Double affinité du transporteur CHL1 10mM NO 3 CHL1 0,25mM NO3 eau Liu et al, The Plant Cell 11 (Mai 1999),

23 Il reste encore de nombreuses questions: Quelle est la structure moléculaire du transporteur, en rapport avec sa fonction? Parmi les nombreux gènes codant des transporteurs de nitrate,y a-til redondance ou spécialisation? (on connaît par exemple chez Arabidopsis 7 gènes de transport à forte affinité NRT2, et 51 gènes de transport à faible affinité NRT1!) Comment sont régulés les gènes de transport du nitrate? Dans quels organes et quels tissus s expriment-ils? Et une préoccupation plus appliquée: L étape d entrée du nitrate dans la racine est-elle limitante pour la nutrition de la plante? Pourrait-on accroître l efficacité d utilisation de l azote par la plante en jouant sur les gènes de transport? 23

24 Prédiction de la structure d un transporteur de nitrate 24

25 Redondance ou spécialisation? Spécialisation des gènes de la famille AtNRT2 Analyse Quantitative de l expression par PCR en temps réel. Plantes cultivées en hydroponie 10 mm NO 3-35 jours. Niveau d expression relatif en % APT 2,0 0,6 0,3 0, Racines Feuilles AtNRT2.1 est majoritaire dans les racines, Mais AtNRT2.4, 2.6 et 2.7 sont aussi présents dans les feuilles. 25

26 Hydroponie WS 6mM NO 3 - Les gènes NRT2 s expriment différemment au cours d une carence en N J31 T 0 +6h Carence J41 24h 48h 4j 10j +6h ~150µE.m -2.s -2 NO 3 - Induction NH 4 + Expression en % EF1α AtNRT2.1 Expression en % EF1α AtNRT2.5 AtNRT2.4 et AtNRT2.5 marqueurs de carence prolongée? Expression en % EF1α AtNRT2.4 26

27 Dans quels organes les gènes de transport du nitrate sont-ils exprimés? Un exemple de localisation de l expression d un gène de transport NRT1 dans les racines et dans les feuilles. Mise en évidence du rôle du transporteur de nitrate dans la régulation stomatique. 27

28 Localisation de l expression d un gène de transport du nitrate à faible affinité The AtNRT1.1 (CHL1) gene is activated and functions in nascent organ development during vegetative and reproductive growth Longitudinal section ofprimary roots of 5-day-old seedling Longitudinal section of a lateral root of 7-day-old seedling Surface views of emerging leaf and cotyledons From Guo et al,

29 CHL1 s exprime aussi dans les cellules de garde des stomates (Arabidopsis) Guo et al 2003, Plant Cell 15,

30 Les mutants Chl1 sont plus tolérants à la sécheresse que les sauvages 30 Guo et al 2003, Plant Cell 15,

31 Les techniques actuelles permettent de localiser avec de plus en plus de précision l expression des gènes de transport du nitrate dans les différentes cellules de la racine, voire au niveau infra-cellulaire. 31

32 LOCALISATION DE L EXPRESSION DU GENE NRT2.1 Gène rapporteur: GUS (bleu) ou LUC (fond gris) Promoteur du gène NRT2.1, sauf figures C et F (promoteur 35S) 10 mm 0,5 mm Témoin 10 mm 0,5 mm Tém Figures G à K culture sur 0,5 mm Remans et al., 2006, Plant Physiology 140, pp

33 Localisation d un transporteur de nitrate sur le tonoplaste De Angeli et al., 2006, Nature 442, (24 August 2006) 33

34 Transport du nitrate dans la vacuole contre le gradient de concentration Julian I. Schroeder Nature 442, (24 August 2006) 34

35 Localisation de la protéine NRT2.7 sur le tonoplaste de cellules racinaires GFP FM4-64 merged F Chopin 2007 GFP FM4-64 merged 35

36 Cependant, on n a toujours pas isolé une seule protéine de transport de nitrate fonctionnelle, c est une étape très difficile (quantité très faible, et probablement plusieurs sous-unité assemblées dans la membrane). L approche anticorps devrait permettre d y arriver. Plusieurs laboratoires y travaillent Revenons à la plante entière pour resituer les transporteurs de nitrate dans son fonctionnement: c est la physiologie intégrative. 36

37 Devenir du nitrate absorbé Redinbaugh MG et Campbell WH, Physiologia Plantarum (1991) 82,

38 Modèle général du rôle des protéines NRT2 à l échelle de la plante Remplissage de la graine AtNRT2.7 Adressage tonoplaste Vacuole de réserve? Chloroplaste vacuole AtNRT2.6? Transporteur de nitrite/nitrate Transport, mise en réserve Influx de nitrate Chargement du xylème AtNRT2.4? Tissus conducteurs racinaires AtNRT2.5? Tissus conducteurs foliaires Prélèvement direct du nitrate AtNRT2.1/NAR2.1 Adressage à la membrane plasmique 38

39 Modèle de régulation de l absorption de nitrate au niveau de la plante Imsande et Touraine, Plant Physiology (1994), 105,

40 Une découverte qui suscite de nombreux espoirs pour accroître l efficacité d utilisation de l azote par les plantes, en jouant sur certains facteurs de transcription, les facteurs Dof. Toutes ces recherches sont avant tout fondamentales, mais elles ont aussi pour but ultime de créer des variétés de plantes cultivées moins exigeantes en azote, afin de réduire l emploi d engrais, et de mieux respecter l environnement. 40

41 Construction de plantes transgéniques surexprimant le facteur de transcription Dof1 Yanagisawa et al 2004, PNAS 101, 20,

42 Des plantes surexprimant un facteur de transcription (Dof1) poussent mieux que le sauvage sur un milieu pauvre en azote Yanagisawa et al 2004, PNAS 101, 20,