Résonance paramagnétique électronique (RPE)

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1 Résonance paramagnétique électronique (RPE) Application à l évaluation de la production mitochondriale d EROs C. Monteil UFR Médecine Pharmacie Rouen

2 Partie 1 : Introduction à la RPE Généralités Principe Schéma d un spectromètre RPE Spectre électromagnétique Spin trap/spin probes Partie 2 : Application à la mesure de production mitochondriale d EROs Partie 3 : avantages et limites

3 Partie 1 : Introduction à la RPE Généralités => Technique d analyse qui ne concerne que les espèces paramagnétiques, comme les radicaux libres, les métaux de transition (ex : Cu II, Fe II/III,Mn II )

4 Partie 1 : Introduction à la RPE Généralités Remarques sur les grandeurs physiques et leurs unités Les grandeurs magnétiques : L unité d énergie en RPE champ magnétique Tesla ou Gauss (1G=10 4 T) moment magnétique µ Am² ou J.T 1 fréquence ν = E/h MHz ou GHz (1 MHz = 6,6261x10 28 J) le nombre d ondes 1/ = E/hc

5 Partie 1 : Introduction à la RPE Généralités Les échanges d énergie entre matière et rayonnement La matière : niveaux d énergie Le rayonnement : ondes électromagnétiques Photons E=hν=h(c/ ) E hν h=cste de Planck ν =fréquence de radiation (nb d oscillations/s) c= vitesse de la lumière longueur d onde (distance parcourue pdt le tps d une oscillation)

6 3mrs.fr/Chap1.pps

7 Partie 1 : Introduction à la RPE L électron Généralités

8 Partie 1 : Introduction à la RPE Effet Zeeman Principe L électron se comporte comme un barreau aimanté qui, placé dans un champ magnétique (B), s aligne sur l axe du champ. Deux populations existent, une de basse énergie alignée au champ et une de plus haute énergie opposée au champ Champ nul Champ B B

9 Partie 1 : Introduction à la RPE Effet Zeeman Principe µ Ms=+1/2 E=g B Ms= 1/2 Magnéton de Bohr 9, JT 1 Champ magnétique G ou mt B=0 B>0

10 Partie 1 : Introduction à la RPE Les transitions de RPE Principe Cste de Planck 6, Js E=hν=g B 0 Fréquence GHz ou MHz Transitions => signal absorption=> raie de résonance

11 Partie 1 : Introduction à la RPE Principe Fréquences utilisées et bandes correspondantes Bandes B ʋ (GHz) L 43 mt 1,2 S 114 mt 3,2 X 336 mt 9,4 K 892 mt 25 Q 1,249 T 35

12 Partie 1 : Introduction à la RPE Principe Interactions hyperfines

13 Partie 1 : Introduction à la RPE Appareillage Source échantillon détecteur Pont console aimant cavité RPE

14 magnettek Bruker

15 Partie 1 : Introduction à la RPE Spectre RPE Vergely et al. Archives of biochemistry and biophysics 420 (2003)

16 Partie 1 : Introduction à la RPE Spin trap/spin probes Spin trap + RL Spin adduct

17 Partie 1 : Introduction à la RPE Spin trap/spin probes Spin trap : nitrones (5,5 dimethylpyrroline N oxide) (N tert butyl phenylnitrone))

18 Partie 1 : Introduction à la RPE Spin trap/spin probes Spin trap : nitroso spin traps (2 methyl 2 nitrospropane) (3,5 dibromo 4 nitrosobenzene sulfonic acid))

19 Spin trap : inconvénients demie vie courte (ex adduit du superoxyde avec le DMPO = 50 s à ph 7, < systèmes cellulaires) car dismutation Bartosz G Clinica chimica acta 2006

20 Spin trap : inconvénients réduction par les antioxydants endogènes solution : CD congélation concentrations élevées nouveaux spin traps plus stables 5 ethoxyphosphoryl 5 methyl 1 pyrroline N oxide

21 Partie 1 : Introduction à la RPE Spin trap/spin probes Spin probe + RL Spin probe + RX 1 hydroxy 3 methoxycarbonyl 2,2,5,5 tetramethyl pyrrolidine (Dikalov et al. Biochem Pharmacol 2007)

22 Partie 1 : Introduction à la RPE Spin trap/spin probes Spin probe + RL Spin probe + RX Bartosz G Clinica chimica acta 2006

23 Partie 1 : Introduction à la RPE Spin trap/spin probes (Dikalov et al. Biochem Pharmacol 2007)

24 (Dikalov et al. 2002)

25 DEPMPO/O 2 DEPMPO/ OH DEPMPO/O 2 + DEPMPO/ OH

26 Spin traps Spin trap + RL Avantages Limites Solution Identification des RL +++ Quantification ± ½ vie courte (biodégradation, bioréductions) Cyclodextrine Nouveaux composés? Spin adduct Constante de vitesse Concentrations élevées Concentrations élevées Spin probes Spin probe + RL spin probe + RX Constante de vitesse +++ Interprétation des spectres +++ Quantification +++ Spécificité Réduction ± AO DETC deferoxamine

27 Partie 2: application à la mesure de production mitochondriale d EROs

28 Exemple 1 mise en évidence de la production d anions superoxyde dans un système acellulaire hypoxanthine 0,5 mm + XO 5 mu/ml + CMH 0,5 mm ± antioxydants incubation 1h 37 c congélation Vergeade et al. FRBM 2010

29 mise en évidence de la production de peroxynitrite dans un système acellulaire système in vitro : sin 1 ( µm) + CMH (500 µm) ± MEG (mercaptoethylguanidine 10 3 M) Thèse M. Isabelle

30 Mitochondries isolées rats Incubation Tp Krebs/Hepes + deferoxamine + DETC; 1h à 37 C puis congélation Environ 50 µg protéines mito

31 Application à des mitochondries isolées de rats pathologiques

32 Exemple µg protéines mito + DMPO 200 mm + glu/mal 3 min d incubation; lecture à T ambiante

33

34 Exemple 3

35 Production tissulaire de ROS et O 2 Production tissulaire totale de ROS : Vg (rat) : mg tissu + KHB + deferoxamine+ DETC Incubation 30 min 37 C lavage réincubation + CMH 30 min 37 C Capillaires 50 µl milieu d incubation Production tissulaire totale de superoxyde Vg (rat) : mg tissu + KHB + deferoxamine+ DETC + PEG SOD incubation 30 min + CMH incubation 30 min Capillaires 50 µl

36 Production mitochondriale totale mitochondries isolées de Vg (rat) : 7 10µg protéines + CMH Capillaires en verre de 50 µl Mesures en mode «Time Scan» 10 min 37 C (toutes les 10s)

37 Production mitochondriale de O 2 mitochondries isolées de Vg (rat) : 7 10µg protéines + PPH ±SOD (50 UI/ml) Capillaires en verre de 50 µl Mesures en mode «Time Scan» 10 min 37 C (toutes les 10s)

38 Activité respiratoire du complexe I mitochondries isolées de Vg (rat) +spin label (Nox 13.1 OS) + CMH + glutamate

39 Exemple 4

40

41 Génération d O 2 par Fe 3+ CytC en présence de NADH et H Fe 3+ CytC (0,1 mm), H 2 O 2 (0,5 mm), NADH (1 mm), DMPO (50 mm), CD (0,1 M) DMPO OOH 1 Fe 3+ CytC, H 2 O 2, NADH, DMPO, CD Fe 3+ CytC, H 2 O 2, NADH, DMPO, CD Fe 3+ CytC, H 2 O 2, NADH, DMPO, CD SOD Fe 3+ CytC, H 2 O 2, NADH, DMPO, CD DMPO OOH DMPO OH DMPO X 5 Fe 3+ CytC, H 2 O 2, NADH, DMPO, CD 6

42 Effet de la concentration de NADH sur la génération d O 2 par Fe 3+ CytC en présence de H NADH 0,1 mm NADH 0,5 mm NADH 1 mm NADH 2 mm

43 Influence de l oxygène sur la génération d O 2 par Fe 3+ CytC en présence de NADH et H 2 0 2

44 Partie 3 : Avantages et limites

45

46 But Comparaison de deux méthodes de détection d EROs, dans des cultures cellulaires et des mitochondries isolées 2 méthodes de détection Microscopie confocale DCF DA / MitoSOX Cultures et conditions de stress : HL1 : H/R 32D : dépendante à l IL3 NIH 3T3 : SVF RPE CPH/PPH Cultures ou mitochondries isolées

47 Détection de la production de ROS

48 localisation mitochondriale vs extramitochondriale et intracellulaire vs extracellulaire

49 Sites de production

50 Production de H 2 O 2 dans des mitochondries isolées en stade 4

51

52 Pour résumer : Avantages : identification directe et quantification d EROs localisation intra/extracellulaire et extra/intramitochondriale sur mitochondries isolées possibilité d études ex vivo, à partir de tissus congelés congélation également possible des cellules ou mitochondries => possibilité de collaborations! Possibilité de mesures in vivo (Bande L) Inconvénients interprétation des spectres parfois délicates choix des sondes Détection au niveau d une seule cellule impossible (sensibilité) détection de ROS non radicalaires impossible topographie de la production de ROS Conclusion => Combinaison de différentes méthodologies

53

54 UV/Vis

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