Résumé. Introduction

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1 Résumé Dans cette expérience, la haute sélectivité d un biosenseur va être développée sur la base de la technique des microbalances à cristal de quartz. Pour cela nous allons tester la détection d une faible concentration (1 nm) d une solution d Avidine. Introduction Une microbalance à quartz est un cas particulier de microbalance piézoélectrique dans lequel le matériau piézoélectrique utilisé est le quartz. Elle est classiquement réalisée en déposant deux électrodes conductrices de part et d'autre d'un substrat piézoélectrique. La mesure d'une faible prise ou perte de masse sur une surface lorsque les phénomènes mis en jeu sont micrométriques nécessite l'utilisation d'une méthode adaptée. Dans ce cas, les méthodes classiques de pesée ne peuvent pas être utilisées du fait de leur faible sensibilité et de la difficulté de les mettre en œuvre dans des milieux variés, notamment liquides. La microbalance à cristal de quartz (QCM) est une méthode basée sur les propriétés piézo-électriques du quartz. Elle est très sensible, ce qui permet la mesure de très faibles variations de masse. Cependant, l'utilisation de la QCM nécessite certaines précautions, qui sont dues au principe de fonctionnement du capteur utilisé (cristal de quartz) et à sa sensibilité à d'autres paramètres tels que la température, la pression et les contraintes exercées sur le quartz. Le principe de la QCM est basé sur l habilité d un champs électrique externe à induire une déformation dans un solide (effet piézo-électrique).la direction de cette déformation dépend de l orientation de la couche de cristal. Lorsqu un champs électrique est appliqué, les dipôles des molécules tendent à s aligner dans la même direction que le champs externe : ceci induit la déformation du cristal. La résonnance est obtenue lorsque la fréquence appliquée correspond à la fréquence de résonnance f o du cristal. L équation de la fréquence de résonnance dépend donc de l ajout de masse sur l une des deux surfaces du cristal de quartz : Δf = n C Δm Page 1

2 n = 1,3,5, les harmoniques du système f = fréquence fondamental m = masse ajouté d q = «tickness of the sensor» p q = densité du quartz (2,55 g/cm 3 ) L avidine est une protéine produite dans les coquille des œufs d oiseaux, de reptiles et d amphibiens. Dans cette expérience, nous allons utiliser un dérivé de cette protéine, la neutravidine. Méthodologie 1. Préparation des vésicules uni-lamelles : Six solutions standard ont été préparées dans du chloroforme : Tube % mol asolectin % mol biotin- DHPE % mol biotin X-DHPE Total dried mass (mg) Page 2

3 Dans le troisième tube, 48,5 μl d asolectin et 15 μl de biotin X-DHPE ont été placé dans une solution de chloroforme. Dans le quatrième tube, 45,5 μl d asolectin et 45 μl de biotin X-DHPE ont été placé dans une solution de chloroforme. Nous avons ensuite évaporé le chloroforme en chauffant à 42 C les tubes test pendant 1 heure. Lorsque le chloroforme est complètement évaporé, les lipides sont dissous dans.5 ml de buffer (2 mm Tris/HCl,,1 M NaCl, ph 8) puis on les laisse poser pendant 2 minutes. Les tubes sont ensuite vortexés 3 fois pendant 3 secondes. Ces solutions sont des vésicules multi-lamelles qui sont transformées en des vésicules uni-lamelles par ultrasons (1 minutes). 2. Préparation des biosenseurs : Les biosenseurs en quartz sont nettoyés pendant 1 minutes par UV ozone puis rincés avec de l eau millipore et finalement, séchés par un jet d azote. Le cristal est ensuite placé dans la cellule qui est rempli avec.4 ml d octanethiol (2 nm) dans l éthanol. Après minutes, la solution est enlevée par aspiration et la couche de thiol est rincée 5 fois avec 1 ml d éthanol et 5 fois avec 1 ml de buffer. Les biosenseurs sont ensuite rempli de.3 ml de la solution de vésicules et de.3 ml de buffer. Il est important de ne pas laisser sécher la surface du biosenseur et de toujours laisser un film liquide. Ceci est fait pour ne pas endommager la bicouche membranaire. Résultats 1. Caractérisation du bio senseur: La membrane du phospholipide inhibe l adsorption du BSA, nous avons pu vérifier cette conclusion avec les données du tube 1. On peut voir que la fréquence reste globalement constante. Ce tube ne contient qu une solution d asolectine. La BSAdesthiobiotine est absorbées directement sur la surface d or du cristal. Puis par l affinité entre l avidine et la desthiobiotine immobilisée il y aura formation d une bicouche. On a fonctionnalisé la membrane en ajoutant, en plus de l asolectine et des biotines contenant des lipides. Page 3

4 Avec le tube 2 nous avons ajouté de la biotin-dhpe, tandis que dans le tube 3 nous avons changé de biotine : biotin-x-dhpe. Nous pouvons désormais voir laquelle marche le mieux. La différence entre les deux chaînes est que la biotin-dhpe est plus petite, la biotin- X-DHPE a un groupe C 5 NHCO en plus. Donc lors de la déformation du cristal avec l absorption de phospholipide le mouvement serra plus ample. Sur le graphique nous pouvons voir que la fréquence de résonance diminue avec l ajout de masse sur les électrodes ce qui est normal d après la formule : Δf = n C Δm Le bio senseur qui marche le mieux est la biotin-x-dhpe car la variation de fréquence est plus grande se qui correspond a un plus grand nombre de molécules adsorbés. Tandis que le K s est plus petit. Tube : biotin-dhpe frequence Exponentielle simple Df =-. ±. e+ Ks =. ±. t =. ±. e+ C =. ±. e+ Double exponentielle Df =-. ±. e+ Ks =. ±. t =. ±. e+ Df =-. ± Ks =. ±. C =. ±. e+ time fréquence Tube 3: biotin-x-dhpe Exponentielle simple Df = ± 2.54e+4 Ks =.3921 ± 4.44e-5 t = ± 4.e+5 C =5.543 ± 2.54e+4 Double exponentielle Df1 = ± 4.89e+3 Ks1 = ±.442 t =79.4 ± 2.9e+4 Df2 = ± 83 Ks2 =.2311 ± 2.59e-5 C =9.48 ± 5.72e temps s Page 4

5 Le fitting des courbes a été réalisés par deux fonctions. Le D f ( f) correspond à la différence de fréquence donc à l amplitude du signal. Tous d abord une exponentielle simple : Δf = Δf e e K s t t C Traduisant df dt = etat final etat initial Δfe = t t Puis une exponentielle double : Δf =Δf e1 1 exp K s1 t t Δf e2 1 exp K s2 t t C Cette équation prend en compte deux équilibres. A Basse concentration l exponentielle simple est assez précise mais avec l augmentation de concentration l utilisation de la double exponentielle est plus judicieuse. Dans le tube 4 le pourcentage de biotin-x-dhpe a été augmenté par rapport au tube 3 : 1 Tube 4 8 Fréquence Hz temps s On remarque que la variation de fréquence est plus grande, elle est d environ 1Hz. Plus la quantité de biotine est grande plus l adsorption est importante. Page 5

6 Fréquence Hz 1 5 Tube 4 Coefficient values ± one standard deviation Df =-1 ± 4.1e-15 Ks =.3 ± t =285 ± C =8.5 ± times s Puis l isotherme d adsorption a été réalisée : 4 fréquence Hz 3 2 Dfmax = ± 3.48 Kass =4.7853e+ ± 8.75e concentration M x1 - La plus petite concentration de protéine détectée par le biosenseur est de 1nM. Page

7 Conclusion Cette expérience nous a permis de mettre en évidence l orientation de la couche de cristal par rapport à un champs électrique. Ceci nous a aussi permis de déterminer la concentration de la protéine étudiée ici, la neutravidine. La microbalance à cristal de quartz est très simple à mettre en œuvre et l'équipement nécessaire est d'un coût modéré. Annexes [1] M. Borkovec. Lab journal of analytical chemistry II : Biosensing with a Quartz Crystal Microbalance, Page 7