Les techniques de criblage à grande échelle en génomique fonctionnelle. L exemple des puces à ADN

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1 Les techniques de criblage à grande échelle en génomique fonctionnelle L exemple des puces à ADN Les Puces à ADN : Pourquoi? Comment? INSTN - Saclay - 8 juin 2005 Laboratoire de Biologie Moléculaire du Développement - INSERM Plate-forme transcriptome - ENS Stéphane LE CROM -

2 Le «dogme central» de la biologie moléculaire Transcription Traduction ADN ARN Protéines Génome Transcriptome Protéome Les puces à ADN sont une des techniques de génomique fonctionnelle qui permet d analyser le génome et le transcriptome des cellules.

3 Les profils d expression des gènes Qu est-ce qu un «profil d expression»? - La localisation des sites d expression des gènes : organes, tissues ou cellules - Estimation du niveau d expression = Abondance des transcrits dans un tissue spécifique - Mesure de la taille des transcrits - Recherche d expression différentielle Les différentes classes d ARN messagers (mrna) - Les ARNm fortement abondants : 10% des ARNm -> Environ 10 gènes - Les ARNm moyennement abondants : 1% des ARNm -> Autour de 100 gènes - Les ARNm faiblement abondants : la plupart des gènes. Autour de 1 à 20 copies d ARNm par cellule

4 Les méthodes d analyse de l expression des gènes Petite échelle : quelques gènes étudiés - Northern blot - RNase protection - RT-PCR quantitative - Hybridation in situ Grande échelle : études simultanées de plusieurs milliers de gènes - Systèmes «ouverts» : le nombre de gènes à découvrir n est pas limité > Hybridation comparative : criblage différentiel > Hybridation soustractive : banques soustraites, sondes soustraites, > PCR : «differential display» - Systèmes «fermés» : le nombre de gènes à analyser est fixé au départ > Séquençage systématique : SAGE > Hybridation : macroarrays, microarrays,

5 La méthode SAGE

6 Hybridation des acides nucléiques complémentaires A complémentaire de T G complémentaire de C Deux séquences complémentaires peuvent s apparier (hybrider). L hybridation est influencée par de nombreux paramètres : - Spécificité (cross-hybridation) - Sensibilité (Tm, structure secondaire, ) - Séquences choisies (taille, composition) Certains paramètres peuvent être contrôlés par la stringence du milieu d hybridation (température, concentration saline et présence d agents déstabilisant les liaisons H comme la formamide).

7 Le principe général des puces à ADN Échantillon (cible) = mélange complexe d acides nucléiques marqués par un ou plusieurs fluorochromes Scanner à fluorescence Support contenant plusieurs milliers de sondes nucléiques individualisées (sonde) Hybridation Quantification du signal d hybridation pour chaque sonde = Détermination qualitative et quantitative de la composition de l échantillon pour plusieurs milliers d acides nucléiques

8 Les principales solutions disponibles Filtres haute densité (macroarrays) Lames de verre (microarrays) 12 cm x 8 cm 2000 spots/cm clones par membrane marquage radioactif 1 condition à la fois GeneChips (oligo-chips) 5,4 cm x 0,9 cm 8000 spots/cm clones par lame marquage fluorescent 2-3 conditions à la fois 1,28 cm x 1,28 cm spots/cm oligonucleotides par lame marquage fluorescent 1 condition à la fois

9 Les différentes méthodes de dépôts Greffage - Dépôt mécanique de produits de PCR ou d oligonucléotides Synthèse in situ - Méthode Affymetrix (masques, photo-activation) - Chambre de réaction en diamant (Oxford Gene Technology) - Méthode d imprimante jet d encre (Agilent) - Masques virtuels (miroirs, Nimblegen)

10 Le principe des puces à ADN par dépôt Fabrication des puces à ADN Lames de verre (microscope) Hybridation Souche 1 Souche 2 Obtention des résultats Lecture (scanner) + ~6000 ORFs de levure PCR ou oligonucléotides Cy3 Extraction des ARN Transcription inverse cdna Cy5 Spotting (dépôt) Analyse des résultats

11 Les différents types de spotter A Exemple : GMS (MWG) B Exemple : Microgrid (Biorobotics) C Exemple : Rosetta

12 Exemple du système de dépôt sur lames de verre

13 Exemples de puces produites à l ENS Levure pan-génomique Souris 15k Souris NeuroDev

14 Le principe des puces à ADN Affymetrix Population n 1 Synthèse d acides nucléiques biotinilés Streptavidine Phycoérythrine Hybridation

15 Comparaison des différentes méthodes de dépôts Greffage 1. Synthèse des sondes 2. Fixation des sondes une par une Synthèse in situ 1. Les sondes sont directement synthétisées à la surface Avantages : Avantages : - pas de restriction de tailles - procédé flexible - haute densité - processus industriel existe Inconvénients : - densité «moyenne» - difficile de rendre le procédé industriel Inconvénients : - processus rigide - uniquement des oligonucléotides Coûts moyens Coûts élevés

16 Choisir le type de sonde à déposer Sondes oligomer Taille : mers Avantages : Avantages : - Détection des SNP - Plus grande spécificité (famille multigéniques) - Livrés «prêt à spotter» - Homogénéité de l oligoset = meilleur spotting Sondes polymer Taille > 100 pb - Insensibles aux allèles/variants - Sensibilité - Production en grande quantité - Collections disponibles (EST, BAC ) - Double brin, plus de choix de marquage, meilleur couverture du génome Inconvénients : - Sensibles aux allèles/variants - Coût de la production de masse - Le design des oligos est une étape complexe - Simple brin, attention à la méthode de marquage Inconvénients : - Une résolution plus faible - Il nécessaire de réfléchir au design des amorces et qu ils marchent en PCR - La production des produits de PCR est lourde - Hétérogénéité (taille) pouvant entraîner des problèmes de spotting - Problème d hybridation croisée - Erreurs des collections (EST)

17 Choisir les gènes à déposer Collection (non redondante) d ADNc ou d oligonucléotides correspondant à : - Des gènes connus avec des fonctions connues - Des gènes connus avec des fonctions inconnues - Des gènes similaires à des gènes connus - Des nouveaux gènes - Et surtout des gènes contrôles!!!!!!! > Des contrôles positifs (des gènes avec différents niveaux d expression, ubiquitaires, des gènes modifiés dans le système étudié, des contrôles de normalisation, des spots «d atterrissage», des contrôles de qualité ) > Des contrôles négatifs (tampon, ADN hétérologue, ) Contraintes optionnelles : - Taille homogène des produits déposés - Des expériences «test» pour la recherche des protocoles optimaux

18 Les puces par dépôt combien ça coûte? Un investissement de départ lourd : - Spotter biorobotics = Les pointes de dépôt = 250 pièce (48 pour spotter gènes en 24 heures) - Scanner Axon = Logiciel d analyse (une licence GenePix) = Le matériel génétique = très variable (6000 oligos levures = ) Des coûts de fonctionnement important : - Contrat d entretien du Spotter = annuels - La garantie du scanner = annuels - Une lame de verre corning UltraGAPS = 14 Heureusement de plus en plus de solutions existent pour utiliser des puces à ADN sans les fabriquer!! - Companies privées : Agilent, Eurogentech, MWG Compter 400 pour une puce. - Plate-formes académiques : ENS Paris, CEA Evry, etc Exemple : ENS Paris, 70 pour une puce levure pan-génomique.

19 Que faire avec des puces à ADN? - Utiliser les puces à ADN comme une version améliorée des méthodes qui sont déjà disponible à «petite» échelle avec un petit nombre de gènes choisis comme importants : => Permet de cribler rapidement un grand nombre de conditions sur des questions très précises parfois non couverte par les puces pan-génomiques (épissage alternatif, familles multi-géniques, ) - Utiliser les puces à ADN sans a priori et sans sélection de gènes d intérêt : => Permet d obtenir une vision globale non biaisée de la réponse cellulaire

20 Génotypage : Exemples d applications des puces à ADN - Recherche de polymorphismes (SNP) - Recherche de mutations Analyse des profils d expression des gènes : - Comparaison des niveaux d expression dans différentes conditions biologiques - Analyses de la dynamique de la transcription, de la réplication - Étude de la stabilité des ARN et leur maturation - Études des interactions acides nucléiques - protéines - Aide au diagnostique (identification de souches pathogènes, ) - CGH array - Analyse du profil d expression du génome entier => «Empreinte» transcriptionnelle (cancer, classements de drogues, )

21 Un exemple : le «ChIP on chip» Recherche des cibles d un facteur de transcription Chromatin immunoprecipitation = ChIP Utilisation de puces à ADN contenant les régions géniques et/ou inter-géniques (tilling) = on chip

22 Avantages et inconvénients des puces à ADN Avantages Inconvénients Étude simultanée des profils d expression de plusieurs millier de gènes Les données sont cumulables La technique est assez lourde à mettre en place L équipement de départ est d un coût relativement élevé Les groupes de gènes affichent des comportements identiques dans une situation biologique donnée Le grand nombre de résultats obtenu très rapidement nécessite un traitement informatique et statistique non négligeable

23 Si vous avez besoin d aide! La plate-forme transcriptome du département de biologie (ENS Paris)

24 Présentation générale Historique : 1998 : Création de la plate-forme en commun avec les laboratoires de l École Normale Supérieure (ENS), de l Institut Curie et de l École Supérieure de Physique et de Chimie Industrielles de la Ville de Paris (ESPCI) 2000 : La plate-forme fait partie du «réseau Génopole Ile de France» 2002 : La plate-forme est sélectionnée comme plate-forme RIO (Réseau Inter- Organismes - INSERM, CNRS, INRA and CEA) Mission : => Contribuer à la diffusion de la technologie puces à ADN en France et en Europe au sein de la communauté scientifique en : 1/ distribuant des puces à ADN abordables, fiables et flexibles ; 2/ formant les utilisateurs aux protocoles d hybridations et aux outils d analyse ; 3/ permettant l accès aux derniers outils et appareils.

25 Les appareils accessibles de la plate-forme Gestion des collections : - Mastercycler à gradient (Eppendorf) - Liquid handling Biorobot 8000 (Qiagen) - Lecteur de microplaques Spectramax plus 384 (Molecular Devices) Production des puces à ADN : - MicroGrid II (Genomic Solutions) Hybridations et analyses : - Bioanalyzer 2100 pour le contrôle de qualité des ARN (Agilent) - 2 scanners Genepix (Axon) - 2 ordinateurs dédiés à l analyse des données

26 Les puces disponibles au catalogue Levure : - Puce à ADN pan-géomique, 6500 oligos (2x) Souris : Levure pan-génomique - 15,000 ADNc - Puce à ADN pan-génomique, oligos - Puces «NeuroDev», 2000 ADNc dédiés à l analyse du développement du système nerveux Souris NIA 15k - Puces «Synapse», 1160 oligos (design maison) dédiés à l analyse de l activités des cellules neuronales Drosophile : Souris NeuroDev - Puce à ADN pan-génomique, oligos Spotting à façon - Lames humaines CGH, diatomées, Drosophile pan-génomique

27 La distribution des puces à ADN L année dernière (2004) : puces à ADN produites > 40 demandes de lames acceptées > 80 utilisateurs enregistrés > Dans 7 pays européens : France Italie Pologne Irelande République chèque Angleterre Portugal puces CGH (Institut Curie)

28 Les principaux laboratoires partenaires Au sein de l ENS : - 75 % des unités de recherche du département de biologie utilise les puces à ADN - Et ce pour des sujets de recherche variés : > Biologie moléculaire du développement > Développement et évolution du système nerveux > Biologie cellulaire de la synapse > Neurobiologie moléculaire et cellulaire > Régulation de l expression génétique > Organismes photosynthétiques et environnement À l extérieur : - Des instituts de recherche : > Institut Curie > Institut Pasteur > ESPCI - Des hôpitaux : > Pitié Salpêtrière > Saint-Antoine > Cochin > Hôtel Dieu - Des universités : > Rome > Prague > Cork > Lisbonne (ITQB)

29 Les échanges avec les utilisateurs sont facilités Un site web Annonce des différentes sessions de formation Espace d échanges (forum et liste de diffusion) Système de demande en ligne de puces à ADN Accessibilité aux protocoles recommandés Un espace utilisateur dédié : > Suivi des demandes > Réservation des appareils > Autour de 5500 visites par mois

30 Des tutoriels sont accessibles en ligne Plusieurs étapes : Analyse de l image Normalisation Traitement des matrices d expression Analyse différentielle Clustering Exploration et gestion des résultats puces Interactif : Mise à jour Retour des formations

31 Des solutions bioinformatiques adaptées Chercher dans les données de puces à ADN - ymgv : - Une interface simple et intuitive pour : > Chercher des données d expression pour un gène > Chercher des gènes co-régulés > Comparer l expression des gènes entre expériences - Des statistiques pour mieux interpréter les données - Prêt pour l ajout de nouveaux organismes - Plus de 1500 expériences stockées dans la base de données

32 Une section intranet pour le suivi de la production Un système de gestion des données : - Le suivi de la production - Un système de suivi de chaque lame - La gestion des contrôles de qualité des lots de lames - L aide à la gestion des commandes et des livraisons - Une section LIMS > 240 échantillons > 375 hybridations - Le stockage des données brutes

33 Avec la plate-forme transcriptome vous pourrez Commander des puces à ADN pour un coût raisonnable Développer des projets personnalisés (puces à façon, gestion de collection, ) Obtenir de l aide et des conseils tout au long de l expérimentation Accéder aux derniers protocoles et méthodes d analyse statistique Développer des collaborations pour l hybridation et/ou l analyse des puces à ADN

34 L équipe de la «plate-forme transcriptome» Claude Jacq - Responsable IFR 36 École Normale Supérieure (Paris) Production des lames Frédéric Devaux - Corinne Blugeon - Véronique Tanty - Fanny Coulpier Bioinformatique Stéphane Le Crom - Sophie Lemoine - Laurent Jourdren - Florence Combes

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