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1 Microscopie confocale : outils de réglage spatial, spectral et dynamique. Application aux études de co-localisation. Edmond Kahn INSERM U678 / UMR S UPMC, Paris Livres! Applications of Fluorescence in the Biomedical Sciences - D. Lansing Taylor et al - Alan R. Liss, New York Handbook of Biological Confocal Microscopy, Second Edition - James B. Pawley - Plenum Press, New York The Handbook, a Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies, Tenth Edition - Richard P. Haugland - Invitrogen Corporation, USA Généralités 1. Une molécule fluorescente (fluorophore ou fluorochrome) possède la propriété d'absorber de l'énergie lumineuse (lumière d'excitation) et de la restituer rapidement sous forme de lumière fluorescente (lumière d'émission). Une fois l'énergie du photon absorbée, la molécule se trouve alors dans un état électroniquement excité. 2. Le retour à l'état fondamental peut alors se faire par l'émission d'un photon, c'est le phénomène de fluorescence. La longueur d'onde ré-émise par la molécule excitée peut être de même longueur d'onde (fluorescence de résonance) ou de longueur d'onde plus grande. Le fait que la longueur d'onde d'émission soit plus grande provient du fait que, dans les milieux liquides en particulier, la molécule retourne à l'état fondamental à partir du niveau de vibration le plus bas de l'état excité. Cette différence est appelée déplacement de Stokes.

2 Généralités Le déplacement du spectre d'émission vers des longueurs d'onde plus élevées, décrit par la loi de Stokes, est essentiel pour la séparation et la détection de la lumière de fluorescence, signal spécifique délivré par le fluorophore. Il existe un grand choix de fluorochromes, chacun pouvant être caractérisé par ses spectres d'excitation et d'émission. Le principe de fluorescence est utilisé dans les microscopes à fluorescence et les microscopes confocaux à balayage laser. Caractéristiques des fluorochromes (1) * Longueurs d'onde : celles qui correspondent aux pics des spectres d'excitation et d'émission. * Coefficient d'extinction (ou absorption) : il relie la quantité de lumière absorbée, pour une longueur d'onde donnée, à la concentration du fluorochrome en solution. * Rendement quantique : efficacité relative de la fluorescence comparée aux autres voies de désexcitation (= nombre de photons émis / nombre de photons absorbés). * Durée de vie à l'état excité : c'est la durée moyenne pendant laquelle la molécule reste à l'état excité avant de retourner à son état de base (psec). Caractéristiques des fluorochromes (2) Photoblanchiment : lorsque la molécule est à l'état excité, il existe une certaine probabilité pour qu'elle participe à des réactions chimiques. Le fluorochrome perd alors ses propriétés de fluorescence. Autrement dit, quand on excite une solution de molécules fluorescentes, une certaine proportion d'entre elles est détruite à chaque instant et par conséquent l'intensité de fluorescence décroît au cours du temps. Ce phénomène peut être gênant, notamment en microscopie de fluorescence, mais il peut également être mis à profit.

3 Principe de base de la fluorescence source filtre d excitation échantillon marqué filtre d émission détecteur Principe de base du microscope à fluorescence Lampe EPI-Fluorescence Diaphragme d excitation Filtre d excitation Oculaire Filtre dichroique Objectif Filtre d emission Spectres d excitation des lampes Lampe à Xénon Irradiation à 0.5 m (mw m -2 nm -1 ) Lampe à mercure

4 Relation entre des fluorochromes et le spectre d excitation d une lampe à mercure Intensité Acridine orange Hoescht DAPI Lucifer yellow FITC Iodure de propidium Energie Fluorescence Différence d énergie entre le pic d excitation et le pic d émission (Stokes) Intensité de Fluorescnece Fluorescéine 25 nm 495 nm 520 nm Longueur d onde Filtres et miroirs dichroiques 1. Filtres et miroirs dichroïques Types Types de de filtres :: Passe Passe bas, Bas, Passe Passe haut, Passe Haut, bande Passe Bande Technologies : Filtres colorés, filtres avec revêtement métallique, filtres interférentiels

5 La séparation des fluorochromes par filtrage spectral Nombre de photons A B C Energie Nombre de photons A B Energie Photons émanant de B Photons émanant de A Réaction d immunofluorescence marquage direct, où l anticorps est conjugué directement à un fluorochrome marquage indirect, où l anticorps est révélé par un deuxième anticorps lui-même fluorescent amplification : reconnaissance de l antigène par un anticorps conjugué à la biotine qui interagit avec la streptavidine couplée à un fluorochrome Fixation de l acridine orange à l ADN acridine orange base paire de base

6 streptavidin and fluorochrome In situ hybridization biotin and spacer arms Biotin-labeled cdna-probe DNA sequence in host cell Exemple de double marquage fluorochrome 1 lapin-anti-mouton mouton-antidigoxygenine digoxygenine fluorochrome 2 protéine lapin-anti-biotine biotine sonde 1 sonde 2 cible 1 cible 2 Principe de base de la microscopie confocale miroirs tournants filtres d excitation source laser détecteurs observateur échantillon marqué filtres dichroïque ouverture filtres source lampe d émission filtre dichroïque images objectif

7 Longueurs d ondes d excitation Lasers Argon Krypton-Argon Helium-Neon Helium-Cadmium 363, 457, 488, 514 nm 488, 568, 647 nm 543 nm, 633 nm nm Titane:Sapphire nm Résolution théorique du microscope confocal (longueur d onde : 550 nm) ouverture numérique résolution latérale profondeur de champ 0.25/air 1.0 µm 12 µm 0.5/air 0.50 µm 3.1 µm 0.9/air 0.28 µm 1.0 µm 0.5/huile 0.50 µm 4.6 µm 1.0/huile 0.25 µm 1.2 µm 1.4/huile 0.18 µm 0.59 µm excitation UV Fluorochromes Argon émission FITC TOTO PE TRITC PI

8 excitation UV Fluorochromes Argon émission DAPI Hoechst ELF Europium Propriétés physicochimiques des fluorochromes paramètre nom excitation émission constante de décroissance calcium Fluo nm 526 nm 0,183 contenu en ADN Hoechst DAPI Iodure de propidium 340 nm 450 nm 0, nm 470 nm i 536 nm 623 nm 0,09 marquage covalent FITC chelate d europium 490 nm 520 nm 0, nm 615 nm i Billes Produits Tailles : de 40 nm à 5µm Fluorochromes : FITC, Texas Red, Europium, etc... Matières : or, ferrites, carboxylates, etc... Conjugaisons : streptavidine, anticorps, etc Producteurs Molecular Probes Miltenyi Biotec Bang Labs (FCSC) Fabricants de cytomètres en flux

9 Imagerie quantitative Standards fluorescents en microscopie confocale Propriétés physico-chimiques des fluorochromes Résolution spatiale Détection des défauts d alignement Décalages en Z Recouvrements colorimétriques Paramètres impliqués dans l imagerie Préparation des lames Epaisseur des lamelles Ouverture numérique Blanchiment Calibration Mouvements Microscopie confocale (BIORAD MRC 1024) Billes FITC-Texas Red Excitation à 488nm (-> vert) et à 568 nm (-> rouge) 32µm Microscopie confocale (BIORAD MRC 1024) Mélanges de billes Excitation à 488nm (-> vert) et à 568 nm (-> rouge) 32µm Avant réglage des miroirs

10 Microscopie confocale (BIORAD MRC 1024) Mélanges de billes Excitation à 488nm (-> vert) et à 568 nm (-> rouge) z x 32µm Après réglage des miroirs Microscopie confocale (Zeiss LSM META510) Mélanges de billes Excitation à 488nm (-> vert) et à 543 nm (-> orange) y x z 32µm Profil en z Bille colorée à l iodure de propidium.

11 Superposition des images confocales CO-LOCALISATION AU MICR OSCOPE CONFOCAL L analyse des préparations en multifluorescence (excitation sur plusieurs longueurs d onde) produit des images qui sont décalées en x, y, et z. Elles peuvent être réalignées par des méthodes de traitement d images (analyse factorielle et corrélation numérique), avant la superposition qui permet de juger des co-localisations. Pour éviter partiellement ce problème, on peut essayer l analyse des préparations en monofluorescence (excitation sur une seule longueur d onde). Superposition des images factorielles et recalage en x, y

12 La séparation des fluorochromes en profondeur source excitation intensité échantillon marqué émission séquence en profondeur La séparation des fluorochromes en profondeur pixel i" séquence" facteur" (séquence)" facteur" (séquence)" facteur" (séquence)" = a (i) + b(i) + c(i) " image factorielle" image factorielle" image factorielle" Analyse Factorielle des Séquences dʼimages Médicales! Séquence dʼimages" i j Analyse oblique Facteur" Facteur" pixel i" spectre" u u1 Facteur" pixel j " spectre" Analyse orthogonale

13 Analyse Factorielle des Séquences dʼimages Médicales! séquence dʼimages" S(pixel,profile) " Images factorielles a k (pixel)" Estimation classique des images factorielles a k (pixel)." Minimisation aux moindres carrés de la distance D 1 définie ci-dessous: " D 1 = S( pixel, profile) a k (pixel ).P k ( profile) k pixel profile 2 Caractérisation des plans focaux! Séquence en profondeur (billes verte et rouge) Caractérisation des plans focaux! Billes verte et rouge Face Profil

14 Caractérisation des plans focaux! Imagerie quantitative Standards fluorescents en microscopie confocale Propriétés physico-chimiques des fluorochromes Résolution spatiale Détection des défauts d alignement Décalages en Z Recouvrements colorimétriques Optimisation des paramètres d imagerie Préparation des lames Epaisseur des lamelles Ouverture numérique Blanchiment Calibration Mouvement Cellules traitées au 7-cétocholesterol colorées au Nile Red : émissions jaune et/ou rouge selon l effet du traitement ANALYSE SPECTRALE 37 µm nm nm nm

15 Caractérisation spectrale! A.U.! Laser Argon" émission" excitation" 488 nm" FITC! PI! TO! FR! autofluorescence" TRITC! nm! Caractérisation spectrale! Séquence spectrale d ʼimages" pixel i" spectre" facteur" (spectre)" facteur" (spectre)" facteur" (spectre)" = a (i) + b(i) + c(i) " image factorielle"image factorielle" image factorielle" Caractérisation spectrale! Laser émission" A.U." Argon" excitation" A.U." 488" TO!FR! nm! autofluorescence" 488" TO! FR! autofluorescence" nm!

16 Cellules traitées au 7-cétocholesterol colorées au Nile Red : émissions jaune et/ou rouge selon l effet du traitement Séquence spectrale 100 µm 620 nm 580 nm Spectre d émission : 700 nm -> 410 nm Cellules traitées au 7-cétocholesterol colorées au Nile Red : émissions jaune et/ou rouge selon l effet du traitement Facteurs et images factorielles 100 µm 620nm 580nm Spectre d émission : 700 nm -> 410 nm Cellules traitées au 7-cétocholesterol colorées au Nile Red : émissions jaune et/ou rouge selon l effet du traitement 37 µm nm nm nm

17 Cellules traitées au 7-cétocholesterol colorées au Nile Red : émissions jaune et/ou rouge selon l effet du traitement Facteurs et images factorielles 83 µm Spectre d émission : 700 nm -> 410 nm 620nm 580nm Imagerie quantitative Standards fluorescents en microscopie confocale Propriétés physico-chimiques des fluorochromes Résolution spatiale Détection des défauts d alignement Décalages en Z Recouvrements colorimétriques Optimisation des paramètres d imagerie Préparation des lames (autofluorescence) Epaisseur des lamelles (influence des milieux de montage et immersion) Ouverture numérique (maintien de la confocalité) Blanchiment Mouvements Microscopie bi-photon (LEICA SP2 MP) Billes marquées de 1 µm (Laser Coherent-Mira F200 pompé par un laser Verdi 8 Watts) 173µm 505 nm 612 nm Excitation laser 743 nm (spectre d émission : 419 -> 698 nm)

18 Billes marquées de 1 µm Microscopie bi-photon (LEICA SP2 MP) (Laser Coherent-Mira F200 pompé par un laser Verdi 8 Watts) 505 nm 612 nm Excitation laser 743 nm (spectre d émission : 419 -> 698 nm) Caractérisation! par lʼextinction! A.U.! Laser Argon" excitation" émission" 488nm" FITC! PI! nm" TO! FR! autofluorescence" TRITC! t! Caractérisation! par lʼextinction! Séquence temporelle d ʼimages" pixel i" extinction" facteur" (extinction)" facteur" (extinction)" = a (i) + b(i) " Image factorielle" image factorielle"

19 Caractérisation par lʼextinction! Laser Argon" A.U." excitation" émission (blanchiment)" A.U." FR! FR! TO! 488" nm" t" t Caractérisation par lʼextinction! Séquence temporelle de noyaux marqués au Hoechst T= 1 T = 16 Caractérisation par lʼextinction! Séquence temporelle de noyaux marqués au Hoechst Images et courbes factorielles Hoechst

20 Caractérisation par lʼextinction! Séquence temporelle sur une cellule marquée à la phycoérythrine et à l iodure de propidium Caractérisation par lʼextinction! Images et courbes factorielles Séquence temporelle sur une cellule marquée à la phycoérythrine et à l iodure de propidium PE PI Caractérisation par lʼextinction! Séquence temporelle sur des cellules HeLa contenant des hybrides marqués au Fast Red et contrecolorées au Thiazole orange.

21 Caractérisation par lʼextinction! Séquence temporelle sur des cellules HeLa contenant des hybrides marqués au Fast Red et contrecolorées au Thiazole orange. Images et courbes factorielles TO FR Caractérisation par lʼextinction! Séquence temporelle de deux billes marquées à la FITC et au Texas Red T= 1 T = 64 Caractérisation par lʼextinction! Séquence temporelle de deux billes marquées à la FITC et au Texas Red Images et courbes factorielles

22 Imagerie quantitative Standards fluorescents en microscopie confocale Propriété des colorants Résolution spatiale Détection des défauts d alignement Décalages en Z Recouvrements colorimétriques Optimisation des paramètres d imagerie Préparations des lames Epaisseur des lamelles Ouverture numérique Blanchiment Calibration Mouvement Autofluorescence, transferts d énergie excitation BI-PHOTON IR MONO-PHOTON UV Argon Fluorochromes émission CFSE 7-cétocholesterol FRET Nile Red Europium, SNARF, Q-dots Texas Red Remerciements Centre Commun de Quantimétrie, Université Lyon-1, Lyon Plateau Technique et Equipe INSERM EPI 13, Centre Hayem, Hôpital St-Louis, Paris Mécanique et Ingénieurie Cellulaire, Faculté de Médecine, Vandoeuvre les Nancy INSERM U498, Hôpital du Bocage, Dijon

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