SOMMAIRE 1. Rappel des objectifs : Méthodologies : Animaux Expositions contrôlées Extraction des ARN totaux...

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1 Programme Seine-Aval 2 Rapport Annuel 2003 Thème 1 : Analyses des risques chimiques et microbiens DETERMINATION ET COMPARAISON DE NOEC «MATRICIELLES» A L AIDE DE PUCES A ADN CHEZ DREISSENA POLYMORPHA ET MYTILUS EDULIS Juin 2004 Université du havre - Laboratoire d Ecotoxicologie Milieux Aquatiques Réalisation : Danger JM / Masson R

2 SOMMAIRE 1. Rappel des objectifs : Méthodologies : Animaux Expositions contrôlées Extraction des ARN totaux Extraction des ARN messagers Construction de banques soustractives par SSH Synthèse des ADN complémentaires Digestion par Rsa I Ligation des adaptateurs Hybridations Première hybridation Amplification par PCR Analyse des produits PCR Ligation des produits PCR dans le vecteur pgemt Transformation Séquençage Purification des ADN plasmidiques Réaction de séquençage (DYEnamic et Terminator cycle sequencing Kit US81050 Amersham) Analyse bioinformatique Re-construction des stocks glycérol des clones Contrôle des inserts Construction et analyse des puces à ADN Amplification par PCR des inserts Purification du produit PCR (Kit Geneclean, Q Biogene catalogue ) Construction des puces Construction des sondes radioactives Amplification PCR Purification Digestions Purification Marquage par multiamorçage aléatoire Hybridation des puces Analyse des données RT PCR quantitative en temps réel Standard d ADN Amplification PCR Choix des amorces Echantillons Courbes standard Resultats Construction de banques soustractives chez mytilus edulis après exposition à l atrazine Traitement des animaux Extraction et purification des ARN messagers SSH Analyse bioinformatique des séquences Machinerie de traduction Protéines des sous unités ribosomales Facteurs d élongation de la traduction Régulation de la traduction : l adenosylhomocysteinase Protéines impliquées dans la transcription «Heterogeneous nuclear RiboNucleoProteins (hnrnp)» Chaperonnes et catabolisme des protéines... 20

3 «Heat Shock Protein» Protéine du protéasome Protéases Protéines du cytosquellette et de la matrice extracellulaire Actines Protéine de la matrice extracellulaire Protéines impliquées dans la chaîne respiratoire mitochondriale Protéines impliquées dans des fonctions physiologiques diverses Transport du glutamate Protéines de signalisation hormonale Protéine à activité enzymatique Protéine de régulation de la phosphorylation Protéines cryptiques Protéines non identifiées Reconstruction des stocks glycérol des clones Construction et utilisation de puces à ADN Construction de puces Hybridation des macropuces Analyse des puces Analyse mathématique des données Gènes différentiellement régulés chez la dreissène en réponse à une contamination Aroclor 1254 / 3-méthylcholantrène Gènes dirérentiellement régulés chez la dreissène en réponse à une contamination à l atrazine Gènes différentiellement régulés chez la dreissène en réponse à une contamination au chrysène RT-PCR quantitative en temps réel Courbes de fusion Courbes standard Atrado ARN 18S ARN 28S Cinétiques de régulation de l expression génique Effets doses Profils tissulaires de l expression... 40

4 1. Rappel des objectifs : Au cours des années précédentes nous nous étions attachés à comparer les gènes transcrits chez des moules témoins versus des individus contaminées par «Subtractive PCR Suppression Hybridization» (SSH). Cette démarche avait comme objectif de dégager des gènes spécifiquement stimulés ou inhibés par les polluants chimiques. Cette stratégie nous a permis de caractériser plusieurs centaines de gènes candidats comme nouveaux biomarqeurs et de compléter la connaissance scientifique sur le génome de Dreissena qui était très peu exploré. Les clones correspondant aux gènes potentiellement différentiellement exprimés ont été déposés sur des puces à ADN. Elles rassemblent plusieurs centaines de gènes isolés par SSH à la fois chez la dreissène et chez la moule bleue. Les objectifs spécifiques étaient les suivants : 1 Mesurer les cinétiques d activation ou d inhibition génique ; 2 Déterminer les courbes dose réponse donnant le degré d activation ou d inhibition génique en fonction de la dose de contaminants ; 3 Calculer des NOEC ; 4 Construire des banques soustractives chez la moule bleue après traitement à l atrazine. 2. Méthodologies : 2.1. Animaux Les dreissènes proviennent de la ballastière d Yville. Les animaux sont sélectionnés suivant leur taille (2,5 à 3,1 cm de longueur) puis soumis à une période de dépuration de 15 jours dans de l eau de source avant d être exposés en conditions contrôlées en Laboratoire. Les moules bleues proviennent d un mytiliculteur de la baie de somme. Les animaux sont sélectionnés suivant leur taille puis également soumis à une période de dépuration de 15 jours dans de l eau de mer synthétique avant d être exposés en conditions contrôlées en Laboratoire Expositions contrôlées Les animaux, moules zébrées et moules bleues, ont été soumis à une exposition à l atrazine (1 µg.l-1) pendant des temps variables s échelonnant de 2 à 72 pour les dreissènes et pendant 24 heures pour les moules bleues. Les expositions ont été

5 réalisées à 18 C dans des cristallisoirs en verre sous oxygénation constante. Après exposition, les animaux ont été disséqués (branchies, manteaux, masse viscérale) et les tissus aussitôt déposés sur glace carbonique avant d être conservés à - 80 C avant utilisation pour l extraction et la purification des ARN totaux Extraction des ARN totaux Les ARN totaux sont isolés selon une méthode dérivée de celle développée par Chomczynski et Sacchi, (1987). Les tissus sont broyés dans un potter Elvejeim avec du Tri (Sigma, France) à raison de 1 ml pour 100 mg de tissu. L homogénat, complété par 0,2 volumes de chloroforme, est ensuite centrifugé ( g, 15 min, 4 C). La phase aqueuse est récupérée dans un tube neuf et elle est additionnée de 0,5 volumes de propanol-2. Les ARN totaux sont précipités par centrifugation ( g, 10 min, 4 C). Le culot d ARN obtenu est lavé à l éthanol 75 %, puis rapidement séché sous vide. Les ARN sont dissous dans 100 µl de TE préalablement traité au diéthylpyrocarbonate à 0,1 % (DEPC, Sigma, France) Extraction des ARN messagers La technique d extraction des ARNm est réalisée avec le kit «PolyATtract mrna isolation system I» (Promega, France). Elle consiste sur l utilisation d un oligo-d(t) complémentaire de la séquence polya des ARNm. L isolement des ARNm à partir des ARN totaux est effectué grâce à des particules aimantées. La solution d ARN totaux (5 µg) dilués dans 2,43 ml d eau «RNase Free» est chauffes à 65 C pendant 10 minutes dans un bain marie à sec. A cette solution, sont additionnés 10 µl d oligo-d(t) 18 biotinilylé ainsi que 60 µl de 20 x SSC. Les «particules paramagnétiques de streptavidine» sont soumises à 3 lavages successifs au 0,5 x SSC à raison de 1,5 ml par lavage en utilisant des portoirs magnétiques. A chaque lavage, le surnageant est éliminé et les particules remises en solution dans du 0,5 x SSC. A l issue du dernier lavage, les particules sont resuspendues dans 0,5 ml de 0,5 x SSC et le mélange ARN/oligo-d(T) est ajouté. Le mélange se fait de manière régulière par inversion pendant 10 minutes à température ambiante. Le complexe ARNmessagers/oligo-d(T) lié aux «particules paramagnétiques de streptavidine» est fixé sur les parois du tube grâce au champ magnétique exercé par le portoir. A la suite de quatre lavages successifs au 0,1 x SSC, les ARN messagers sont élués par l ajout de 1 ml d H 2 O-DEPC et transférés dans des tubes neufs. Les messagers sont précipités pendant 12 heures à -80 C, par 0,1 volumes d acétate de sodium (3 M) et 1 volume de propanol-2. Après centrifugation, le culot de messagers est séché et dissous dans un volume de 5 µl d H 2 O DEPC. La concentration et la qualité des messagers sont estimées par mesure des absorbances à 260 et 280 nm.

6 2.5. Construction de banques soustractives par SSH Synthèse des ADN complémentaires Synthèse du premier brin Les ARN messagers des gonades de myes témoins et exposées sont soumises à une transcription inverse grâce à l action de la «reverse transcriptase». Les 2 µg de messagers sont hybridés avec 4 µl d amorce de synthèse d ADNc (10 µm, 5 - TTTTGTACAAGCTT30N1N - 3 ) pendant 2 minutes à 70 C puis refroidis sur glace pendant 2 minutes. Sont ajoutés 2 µl de tampon de synthèse de 1ier brin 5 x (Tris-HCl, 250 mm, ph 8,5 ; MgCl 2, 40 mm ; KCl, 150 mm ; DTT, 5 mm), 1 µl de dntp (chacun à 10 mm), 1 µl d H2O-DEPC et 1 µl d AMV reverse transcriptase (20 U.µL -1 ). La solution est incubée pendant 1 heure 30 minutes à 42 C puis est arrêtée en plaçant les tubes sur glace. La synthèse du second brin d ADNc est réalisée immédiatement Synthèse du second brin Aux produits de synthèse du premier brin sont ajoutées 48,4 µl d H20, 16 µl de «tampon de synthèse du second brin» 5 x (KCl, 500 mm ; sulfate d ammonium, 50 mm ; MgCl 2, 25 mm ; β NAD, 0,75 mm ; Tris-HCl, 100 mm, ph 7,5 ; BSA, 0,25 mg.ml -1 ) et 4 µl de mélange enzymatique 20 x (ADN polymérase I, 6 U.µL -1 ; Rnase H, 0,25 U.µL -1 ; ADN ligase d E. coli, 1,2 U.µL -1 ). La solution est incubée à 16 C pendant 2 heures et 2 µl de T4 DNA polymérase (6 U) sont alors additionnées. L incubation à 16 C est poursuivie pendant 30 minutes. 4 µl de mélange EDTA-glycogène 20 x (EDTA, 0,2 M ; glycogène, 1 mg.ml -1 ) ont été ajoutés pour permettre l arrêt de la réaction. Une extraction au phénol/chloroforme est réalisée à l issue de laquelle les ADNc doubles brins sont repris dans 50 µl d H 2 O. Un échantillon de 6 µl de chaque population d ADNc est prélevé et stocké à -20 C pour vérification par électrophorèse sur gel d agarose Digestion par Rsa I Pour chaque population d ADNc, 43,5 µl de solution d ADNc doubles brins sont prélevés et 5 µl de tampon de Rsa I 10 x (bis-tris-propane-hcl, 100 mm, ph 7,0, MgCl 2, 100 mm ; DTT, 1 mm) ainsi que 100 U de Rsa I sont ajoutés. La digestion est effectuée pendant 1 heure 30 minutes à 37 C puis l addition de 2,5 µl de mélange EDTA-glycogène permet d arrêter la réaction enzymatique. Un échantillon de 5 µl de chaque digestion est prélevé et stocké à -20 C pour analyse. Les ADNc digérés sont isolés par une extraction au phénol/chloroforme et repris dans un volume de 5,5 µl d H 2 O. Ils sont conservés à -20 C jusqu aux étapes d hybridation Ligation des adaptateurs Les populations de fragments d ADNc issues de la digestion seront ligasées aux

7 adaptateurs 1 et 2R. 5 µl d H 2 O sont ajoutés aux 1 µl d ADNc digéré par Rsa I. Le mélange de ligation renferme 15 µl d H 2 O, 10 µl de tampon de ligation 5 x (Tris-HCl, 250mM, ph 7,8 ; MgCl2, 50 mm ; DTT, 10 mm ; BSA, 0,25 mg.ml-1) et 5 µl de T4 DNA ligase (400 U.µL-1, avec 3 mm d ATP). Aux 2 µl d ADNc dilué dans 6 µl de mélange de digestion sont ajoutés 2 µl d adaptateur 1 (10 µm) ou d adaptateur 2 R (10 µm). Les produits de ligations sont incubés à 16 C pendant 12 heures et la réaction est arrêtée par l ajout de 1 µl de mélange EDTA/glycogène. Enfin, les solutions sont chauffées pendant 5 minutes à 72 C. Les échantillons sont ensuite conservés à -20 C pour l étape d hybridation Hybridations Première hybridation Au cours de cette étape, les ADNc drivers sont hybridés avec les ADNc testeurs ayant subi la ligation. A 1,5 µl d ADNc driver sont ajoutés 1,5 µl d ADNc testeur adaptateur 1 ou d ADNc testeur-adaptateur 2R. A chaque tube, 4 µl de tampon d hybridation (composition non précisée par le fabriquant du Kit) sont additionnés. L hybridation est effectuée à 98 C pendant 1 heure 30 minutes puis à 68 C pendant 8 heures dans un thermocycleur (PCR Sprint, Hybaid, France). A l issue de cette incubation, la seconde hybridation est immédiatement réalisée Seconde hybridation Il s agit de mélanger les deux échantillons de l étape précédente avec un excès d ADNc driver. Un mélange d hybridation contenant 1 µl d ADNc driver, 1 µl de tampon d hybridation 4 x et 4 µl d H2O est préparé et 1 µl de cette préparation est chauffé pendant 1 minute 30 secondes à 98 C dans un thermocycleur. La totalité des mélanges ADNc driver-adaptateur 1 et ADNc driver-adaptateur 2R (4 µl chacun) sont alors ajoutés au tube contenant l ADNc driver. La seconde hybridation est immédiatement débutée (68 C, 12 h). Cette incubation terminée, 200 µl de tampon de dilution (HEPES- HCl, 20 mm, ph 8,3 ; NaCl, 50 mm ; d EDTA, 0,2 mm, ph 8) sont additionnés et les échantillons chauffés à 68 C pendant 7 minutes. Les préparations obtenues sont conservées à -20 C Amplification par PCR Première PCR Cette première PCR repose sur l utilisation de l amorce PCR primer 1 dont la séquence est complémentaire à la fois d une portion de l adaptateur 1 et d une région de l adaptateur 2R. Chaque PCR comporte 1 µl de matrice et 24 µl de mélange réactionnel comprenant 19,5 µl d H 2 O, 2,5 µl de tampon de réaction 10 x (Tricine-KOH, 400 mm, ph 8 ; KCl, 160 mm ; MgCl2, 45 mm ; BSA, 37,5 µg.ml -1 ), 0,5 µl de mélange de dntp à 10 mm chacun, 1 µl d amorce P1 (10 µm) et 0,5 µl de mélange de Advantage cdna polymérase 50 x (Clontech, France). Après une période de 5 minutes

8 à 75 C permettant l élongation des adaptateurs, l amplification PCR est effectuée. Cette PCR comporte 27 cycles (dénaturation 94 C, 30 secondes ; hybridation 66 C, 30 secondes ; élongation 72 C, 90 secondes). Systématiquement, 8 µl de chaque PCR sont prélevés à des fins de contrôle Seconde PCR Cette amplification utilise comme matrice 1 µl d une dilution au 10 ème de la PCR de premier rang et, comme amorces, les oligonuléotides «nested PCR primer 1» et «nested PCR primer 2R» spécifiques respectivement de l adaptateur 1 et de l adaptateur 2R. Le mélange réactionnel d un volume de 24 µl comporte 18,5 µl d H 2 O, 2,5 µl de tampon de réaction, 1 µl d amorce «nested PCR primer 1» (10 µm), 1 µl d amorce nested PCR primer 2R» (10 µm) ainsi que 0,5 µl de dntp (10 mm) et 0,5 µl de 50 x Advantage cdna polymérase. Douze cycles sont effectués (dénaturation 94 C, 30 secondes ; hybridation 68 C, 30 secondes ; élongation 72 C, 90 secondes). Comme précédemment, 8 µl de chaque amplification par PCR sont prélevés pour analyse Analyse des produits PCR L analyse des produits des deux PCR successives est réalisée sur gel d agarose à 2 % dans du tampon TAE (Tris-acétate, 40 mm ; EDTA, 1 mm) contenant 2 µl de bromure d éthidium pour 60 ml de gel. Chaque échantillon est additionné de 2 µl de tampon de charge Ligation des produits PCR dans le vecteur pgemt Les produits PCR sont intégrés dans un vecteur pgem-t (Promega, France). 5 µl de tampon de ligation 2 x (Tris-HCl, 60 mm, ph 7,8 ; MgCl2, 20 mm ; DTT, 20 mm ; ATP, 2 mm ; polyéthylène glycol, 10 %) et 1 µl de T4 DNA ligase ont été ajoutés à 3µL du produit de la PCR. La réaction de ligation se déroule à 4 C durant toute la nuit Transformation 5 µl de produit de ligation sont ajoutés à 600 µl de Bactéries thermocompétentes. Le mélange est refroidi sur glace pendant 30 minutes. Les bactéries avec le vecteur sont ensuite incubées exactement 90 secondes à 42 C puis refroidies sur glace pendant 2 minutes pour subir le choc thermique. 1 ml de LB (2%) (Lennox L Broth Base, Sigma, France) est ajouté et le mélange est ensuite incubé à 37 C à 250 tours par minute. Après 1 heure d incubation, la préparation est centrifugée à 4000 g pendant 4 minutes et le surnageant est supprimé. Le culot est re-suspendu dans 100 L de LB puis étalé sur des boîtes de Pétri LAIX (Pétri LA sur lesquels ont été étalés 20 µl d IPTG (10 mg.ml -1 ) et 20 µl d X-gal (10 mg.ml -1 dans du DMSO)). Les boîtes de Petri sont finalement placées dans un incubateur à 37 C pendant 12 heures. Chaque colonie est prélevée et mise en culture individuellement dans un milieu de culture liquide LA. Après une incubation de 12 heures à 37 C et 250 rpm, des stocks dans du glycérol 80 % sont réalisés et conservés à -80 C.

9 Séquençage Purification des ADN plasmidiques Les ADN ont été purifiés sur colonne Quiagen. Brièvement, un volume de 1,5 ml de culture bactérienne est centrifugé (4 000 g, 4 min). Le culot de bactéries est repris dans 250 µl de tampon P1, puis 250 µl de tampon P2 sont ajoutés. Les tubes sont mélangés par inversion et la lyse des cellules est conduite pendant au moins 5 minutes. Sont ensuite ajoutés 350 µl de tampon N3 et l ensemble est rapidement homogénéisé par inversion des microtubes. Les débris cellulaires sont enlevés par centrifugation (10000 g, 10 min) et le surnageant est déposé sur les colonnes QIAprep. Une centrifugation brève ( g, 30 à 60 s) permet d éliminer l effluent, les plasmides restant fixés sur le gel de silice. Un lavage avec 0,75 ml de tampon PE est ensuite effectué, suivi d une nouvelle centrifugation ( g, 30 à 60 s). Cette centrifugation est renouvelée après élimination de l effluent et l ADN plasmidique est élué dans du tampon EB (Tris-HCl, 10 mm, ph 8,5) grâce à une dernière centrifugation ( g, 1 min) Réaction de séquençage (DYEnamic et Terminator cycle sequencing Kit US81050 Amersham) Pour les réactions de séquençage, 3 µl d agent Premix sont combinés avec 6 µl de matrice purifiée et 1 µl d amorce Sp6. La réaction de séquençage comporte 25 cycles (dénaturation 95 C, 20 secondes ; hybridation 50 C, 15 secondes ; élongation 60 C, 60 secondes). Les produits de réaction sont précipités avec 1 µl de acétate de sodium et 50 µl d éthanol 95%. Après centrifugation (12000 g, 15 minutes), le culot est lavé avec de l éthanol 70%. Après séchage, le culot est resuspendu dans 10 µl de tampon de charge «Megabase loading solution» (Amersham) Analyse bioinformatique La recherche d homologies de séquence est effectuée à l aide des programmes Blastn et Fastx sur les banques GenBank, EMBL et Swissprot à l aide du programme SRS version 5 ( Re-construction des stocks glycérol des clones Suite à un grave accident électrique consécutif à l inondation des sous sols de la Faculté des Sciences, les stocks glycérol de l ensemble des clones bactériens (soit environs 1200) ont du être refaits. Pour cela un aliquot de 2 à 30 µl des stocks glycérols

10 décongelés a été étalé sur un Petri LB agar additionné d ampicilline. Sur chaque Petri, une colonie individualisée a été prélevée et un nouveau stock glycérol préparé comme décrit précédemment Contrôle des inserts Pour chacun des clones pour lesquels un stock glycérol a été refait, une amplification PCR a été effectuée afin de vérifier par électrophorèse sur gel d agarose que la taille de l insert amplifié correspond bien à celle déterminée à l issue de la construction des banques soustractives. Pour les détails méthodologiques, se reporter aux paragraphes précédents Construction et analyse des puces à ADN Amplification par PCR des inserts Les inserts de l ensemble des clones obtenus par SSH ont été amplifiés par PCR à l aide des amorces T7 et Sp6 situées de part et d autre du polylinker du vecteur pgem- T. L amplification a été réalisée dans un milieu réactionnel de 50 µl à partir de 5 µl des stocks glycerols des différents clones bactériens obtenus par SSH. Les conditions de PCR utilisées sont usuelles tant en ce qui concerne les concentrations en amorces, en nucléotides et en magnésium. Le tampon est le même que celui décrit précédemment Purification du produit PCR (Kit Geneclean, Q Biogene catalogue ) Le mélange réactionnel comporte 3 µl de matrice issue des stocks de glycérol, 25 µl de mélange réactionnel (Promega, France), 1 µl de chaque amorce Sp6 (10 µm) et T7 (10 µm) et 20 µl d eau. Après une période de dénaturation de 3 minutes à 92 C, l amplification PCR est effectuée. Cette PCR comporte 30 cycles (dénaturation 94 C, 30 secondes ; hybridation 48 C, 30 secondes ; élongation 72 C, 90 secondes). La procédure de purification des produits PCR consiste par une fixation des molécules d ADN sur la matrice de silice (Glassmilk) en milieu riche en sels. Au 20 µl de matrice, sont ajoutés 30 µl d eau distillée, 150 µl de produit NaI et 3 µl d une solution de Glassmilk. Après centrifugation (14000 g, 5 minutes), le culot est soumis à trois lavages successifs avec 500 µl de tampon de lavage. Le culot est resuspendu dans 20 µl de solution d élution. L éluât est récupéré après centrifugation (14000 g, 1 minute).

11 Construction des puces Ce procédé consiste à déposer et à fixer de façon covalente des acides nucléiques sur des membranes de nylon à l aide d un «spotteur» d ADN (Eurogenetec, prototype). Les membranes sont tout d abord humectées dans un bain de soude. Les échantillons à «spotter» sont transférés dans des plaques à 384 puits et le robot assure le dépôt des échantillons avec une géométrie programmée. L appareil muni d une tête de 384 pointes prélève environ 1 nl de chacun des 384 échantillons et les dépose en une fois sur les membranes. Après avoir répété cette opération avec tous les échantillons sur toutes les membranes, celles-ci sont plongées dans un bain d eau pendant 4 minutes puis dans un bain de tampon phosphate 40 mm pendant la même durée afin de fixer l ADN qui a été déposé, puis séchées à l air libre pendant environ 1 heure Construction des sondes radioactives Amplification PCR Une PCR est réalisée avec pour matrice 2 µl du produit de la première PCR de l étape présentée plus haut lors de la description de la construction de banques soustractives. Cette amplification est la même que celle de la deuxième PCR de cette étape, le volume final étant toutefois de 50 µl Purification Le produit obtenu est alors purifié (Kit Qiagen) par ajout de 5 volumes de tampon PB. Le mélange est alors déposé sur colonne et centrifugé 1 min à g, l éluât est jeté. Un volume de 750 µl de tampon PE est alors placé sur la colonne, puis après centrifugation 1 minute à g, l éluât est jeté. L opération est répétée et un tube neuf est placé sous la colonne. 50 µl de tampon EB sont alors laissés 1 minute sur la colonne pour permettre à l ADN de se resuspendre dans celui-ci, puis après une dernière centrifugation 1 min à g, le tube contenant l ADN en solution peut être stocké à 4 C. Un volume de 1 µl est alors analysé au spectrophotomètre pour déterminer la concentration d ADN présente dans l échantillon, sachant que pour l étape suivante, il faut placer 1,5 µg d ADN dans un volume final de 28 µl Digestions A ce stade, 3 µl de l échantillon sont mis de côté à 4 C pour une électrophorèse ultérieure. Aux 25 µl d échantillon restants, sont ajoutés 3 µl de tampon C et 1,5 µl d enzyme Rsa I. La digestion a lieu pendant 1 heure à 37 C. Là encore, 3 µl sont prélevés. Les échantillons digérés et non digérés sont soumis à une électrophorèse de contrôle sur gel d agarose.

12 Une deuxième digestion est ensuite effectuée par ajout de 0,8 µl de NaCl 5 M et de 1 µl de Bst ZI. Le tube est placé 1 heure à 50 C, puis est dilué au dixième par ajout de 254,7 µl d eau. Enfin, une troisième digestion est préparée. Elle nécessite l ajout de 25,47 µl de tampon I et 1 µl d enzyme Sma I et dure 1 heure à 25 C Purification La purification est effectuée grâce au Kit Qiagen comme vu précédemment Marquage par multiamorçage aléatoire Les ADNc digérés sont marqués par multiamorçage aléatoire ou «random priming» comme indiqué au paragraphe Le radio-isotope utilisé dans ce cas est le 33P. Les sondes ainsi obtenues subissent une dernière étape de purification sur colonne Qiagen Hybridation des puces La préhybridation est conduite dans un four à hybridation rotatif (Bioblock Scientific, France) pendant 4 heures à 60 C dans 10 à 15 ml d une solution contenant du 6 x SSC, du Denhardt 3 x, du tampon de phosphate sodique (0,04 M, ph 7), du SDS (0,1 %) du pyrophosphate de sodium (0,1 %), de l EDTA (1 mm), de l ADN de sperme de saumon dénaturé (0,1 mg.ml -1 ) et du sulfate de dextran. L hybridation est effectuée pendant 16 heures à 60 C dans la même solution (la concentration de l ADN de sperme de saumon étant réduite à 0,05 mg.ml -1 ) additionnée de la sonde dénaturée. Les filtres de nylon sont alors lavés une fois à température ambiante dans du tampon (2 x SSC ; SDS, 1 % ; pyrophosphate de Na, 0,1 % ; EDTA, 1 mm) puis une autre fois dans le même tampon à 72 C pendant 30 minutes à 60 C. Quatre lavages successifs (SSC 0,4 x ; SDS, 1 % ; EDTA, 1 mm) sont effectués à 60 C pendant 15 minutes. Les puces à ADN sont alors séchées et exposées à l aide d un phospore-imageur (Storm870, Amersham Biotech) Analyse des données La préparation des images obtenues par le phosphore-imageur a été effectuée grâce au logiciel Photoshop Elements (Adobe, USA). L analyse densitométrique et statistique a été réalisée grâce au logiciel Xdot Reader (Cose, USA).

13 2.8. RT PCR quantitative en temps réel Standard d ADN Des dilutions en cascade de raison 10 ont été faites à partir de l ADN plasmidique des clones à analyser. La concentration et le nombre de copie de plamisde a été mesurée par spectrophotométrie à 260 nm Amplification PCR Choix des amorces Les amorces PCR ont été calculées à l aide du logiciel Beacon Designer pour obtenir des amplimer d une taille d environ 150 pb et des températures d hybridation de l ordre de 55 C Echantillons Les échantillons traités pas RT-PCR quantitative en temps réel proviennent d animaux exposés (voir paragraphe plus haut). La transcription inverse a été réalisée à l aide de la superscript II (In vitrogen) sur une quantité de 5 µg d ARN totaux préalablement traités à la DNase I. Les conditions réactionnelles sont comparables à celles indiquées précédemment et répondent aux spécifications données par le manufacturier du Kit. Les ADNc ont été débarrassés des ARN restant par traitement à la RNase H pendant 20 min à 37 C Courbes standard Les amplifications PCR ont été réalisées sur plaques 96 puits sur des volumes réactionnels de 15µL. Les conditions utilisées sont les suivantes : 1 µl de matrice, 2 µl d amorces (10 mm), 7,5 µl de mélange PCR contenant du SYBR Green (PCR-IQ SYBR Green supermix, BIORAD) et de l eau ultrapure pour un volume total de 15 µl..l amplification a été effectuée sur 50 cycles et des courbes de dénaturation ont été systématiquement réalisées afin de déterminer le degré de pureté de l amplimer.les efficacités d amplification utilisées sont supérieures à 98%. Les courbes standard ainsi que les nombres de copies dans les échantillons ont été calculées à l aide du logiciel Biorad. Les marqueurs internes, ARN 18 et 28 S ont été choisis.

14 3. Resultats 3.1. Construction de banques soustractives chez mytilus edulis après exposition à l atrazine Traitement des animaux Aucune mortalité n a été constatée pendant la période d exposition. De même, aucune différence concernant l aspect global des organes n a pu être observée entre animaux témoins et animaux contaminés. A l issue de l exposition, les animaux témoins et traités semblaient également fixés aux parois des bacs d expérimentation Extraction et purification des ARN messagers L extraction des ARN totaux a été réalisée selon une méthode dérivée de celle élaborée par Chomczyski et Sacchi (1987) sur les tissus prélevés à partir 25 animaux. La quantité d ARN totaux a été estimée par mesure d absorbance à 260 nm (Tableau 1). Tissus Quantité d ARNs Ratio DO 260/280 totaux (mg) Branchies 3,79 1,72 Manteau 5,93 1,65 Glande digestive 12,10 1,70 Branchies 3,32 1,76 Manteau 5,60 1,69 Glande digestive 11,26 1,90 Tableau 1 : Quantités d ARNs totaux obtenus à partir des tissus prélevés sur des moules témoins ou contaminées. Le profil de migration des ARN présente deux bandes correspondant aux ARN ribosomaux, attestant de la bonne conservation des acides nucléiques. Une estimation de la quantité et de la qualité des ARNm a été obtenue par mesure au spectrophotomètre de l absorbance à 260 nm et 280 nm SSH Afin d éliminer toute contamination des messagers par de l ADN génomique, les ARNm ont tout d abord subi un traitement à la DNase I. La synthèse du 1 er brin d ADNc a été conduite sur 2 µg d ARN polya+ en présence de transcriptase inverse. Une fois la synthèse du second brin réalisée, les ADNc bicaténaires obtenus ont été fractionnés par l action de l enzyme de restriction Rsa I. Les profils de digestion obtenus sont présentés dans la figure 2. L apparition d un «smear» plus marqué dans les tranches de tailles inférieures dans les lignes «digérées» atteste de l action de l enzyme de restriction Rsa I. La ligation des adaptateurs ainsi que les deux hybridations successives ont été effectuées

15 suivant des procédures en tous points identiques à ceux du fournisseur du Kit. Les ADNc issus des deux soustractions ont ensuite été amplifiés par PCR suppressive, réalisée en deux étapes. Une première PCR permet d amplifier, à l aide d une amorce commune aux deux adaptateurs utilisés, l ensemble de toutes les espèces d acides nucléiques munies d adaptateurs. La seconde PCR, est réalisée avec un couple d amorces qui n autorise l amplification exponentielle que des seules espèces d acides nucléiques munies d adaptateurs différents à chacune de leurs extrémités. Les profils de migration sur gel d agarose de ces réactions de PCR sont représentés en figure 3. Down Up Moff Mon M N D N D pb 500 pb 200 pb Figure 1 : Fractionnement des ADNc bicaténaires par l enzyme de restriction Rsa I. Electrophorèse sur gel d agarose avant (N) et après (D) action de l enzyme. M, marqueur de taille (kb ladder Promega) ; Moff, ADNc témoins isolés à partir de manteaux ; Mon, ADNc traités isolés à partir de manteaux. La photographie a été inversée. Figure 2 : Isolement par PCR suppressive des ADNc correspondant aux gènes régulés en réponse à l exposition à l atrazine dans les manteaux. Up, gènes positivement régulés, Down, gènes négativement régulés, M, marqueur de taille.

16 Les produits des PCR suppressives ont ensuite été clonés. Pour cela, les amplimers ont été ligasés dans le vecteur plasmidique p-gemt par «T/A cloning» sous l action de l ADN ligase du bactériphage T4. La transformation des produits de ligation a été assurée par électroporation de bactéries de la souche Xl1-Blue. Les colonies bactériennes ont été prélevées une à une et remises en culture dans du milieu LB additionné d ampicilline. Deux banques d ADNc ont ainsi pu être construites pour la glande digestive, contenant respectivement, pour la banque des clones régulés positivement et négativement, 290 et 253 clones isolés. L ADN inséré dans le vecteur à été amplifié par PCR en s appuyant sur les amorces T7 et Sp6 situées de part et d autre du site de clonage multiple de pgem-t, puis soumis à une électrophorèse sur gel d agarose. Une partie des profils de migration électrophorétique est représentée sur la Figure 5. Parmi ces acides nucléiques, 100 ont été soumis à séquençage (Eurogentech, Belgique). Le choix de ce panel de clones a été établit en maximisant la diversité de taille des inserts, dans le but de limiter la redondance des résultats obtenus. M 2000 pb 1000 pb Figure 3 : Exemple de profils de migration électrophorétiques des produits d amplification par PCR d inserts des banques soustractives. M : marqueur de taille, les bandes à 1000 et 2000 pb du marqueur de tailles sont indiquées.

17 Analyse bioinformatique des séquences A l issu du séquençage, les séquences nucléotidiques obtenues étaient encore pourvues d une portion du polylinker de pgem-t et des adaptateurs 1 et 2R utilisés lors des PCR suppressives. Afin d éliminer ces séquences conservées chez tous les clones, des alignements multiples ont été réalisés grâce au programme ClustalW. Cette étape a de plus permis de dégager les séquences redondantes dans les banques. Les clones positivement régulés sont notés «glu», tandis que ceux inhibés sont notés avec le suffixe «gld». Une recherche d homologie sur la base de données PIR par le programme Fastx a été systématiquement effectuée sur chacune des séquences nucléotidiques afin d identifier la nature des transcrits isolés. Ce logiciel permet de comparer l ensemble des séquences peptidiques recensées sur la banque PIR avec celles obtenues par traduction dans les six cadres de lecture possibles des différents clones. Les clones ont été artificiellement regroupés en différentes catégories fonctionnelles comme, par exemple, les protéines impliquées dans la machinerie de traduction ou de transcription Machinerie de traduction Protéines des sous unités ribosomales Plusieurs clones isolés présentent des homologies fortes avec des protéines appartenant à la petite sous unité du ribosome. Il s agit des clones gld3, gld113, gld165 et gld119 qui correspondent tous à des messagers régulés négativement et présentent des homologies respectivement avec les protéines S2, S6, S13 et S16 de la petite sous unité (Tableau 1). Protéine espèce indice de similarité S2 Rattus norvegicus 79,0% N Pir R3RTS2 Alignement des séquences peptidiques DAPAAAPAGGRGG---GDRGGFRGGFGSGERGRGRGRGRGRGRGRGRGRGNKDGDKEWMP : : : : DAGAAGGPGGPGGPGLGGRGGFRGGFGSGLRGRGRGRGRGRGRGRG-ARGGKAEDKEWIP VTKLGRLVKDMKIKSLEEIYLFSLPIKECEIIDFFFPSTL : :: VTKLGRLVKDMKIKSLEEIYLFSLPIKESEIIDFFLGASL S6 Drosophila melanogaster 87,6% S30194 RLLLSKGHSCFRPRRTGERRRKSVRGCIVDSNLSVLALVVVKKGEKDIPGLTDTTIPRRL : : : : : : RLLLKKGHSCYRPRRTGERKRKSVRGCIVDANMSVLALVVLKKGEKDIPGLTDTTIPRRL GPKRASKIRKLFNLSKEDDVRQYVVRRPLAVKEGKKAQSKAPKIQRLLTPIV : :: : :: : : GPKRASKIRKLYNLSKEDDVRRFVVRRPLPAKDNKKATSKAPKIQRLITPVV

18 S13 Homo sapiens 90,5% S34109 MGRMHNPGXGISQSALPYRRSVPTWLKLTSEDVQEQIFKLAKKGLTPSQIGVILRDSHGV : : : : MGRMHAPGKGLSQSALPYRRSVPTWLKLTSDDVKEQIYKLAKKGLTPSQIGVILRDSHGV AQVRFVTGNKILRILKAKGLAPDLPEDLYHLIKKAVSIRKHMERNRKDRDSKFRLILVES : :: : : : : AQVRFVTGNKILRILKSKGLAPDLPEDLYHLIKKAVAVRKHLERNRKDKDAKFRLILIES S16 Homo sapiens 87,7% R3HU16 MPPKGPLQSVQVYGRKKTATAVAHCKRGTGLIKVNGRPLDLLEPQVLRYKLQEPVLLLGK : : ::: :: : MPSKGPLQSVQVFGRKKTATAVAHCKRGNGLIKVNGRPLEMIEPRTLQYKLLEPVLLLGK EKFAGVDIRVRVKGGGHIAQIYAIRQAISKSLVAYYQKYVDEASKKEIKDMLISYDRTLL : : : : : : ERFAGVDIRVRVKGGGHVAQIYAIRQSISKALVAYYQKYVDEASKKEIKDILIQYDRTLL VADPRRCEPKKFGGPGPRARYQKSYR VADPRRCESKKFGGPGARARYQKSYR Tableau 2 : Orthologues identifiés par Fastx dans la banque de donnée PIR. La première colonne indique le nom de la protéine et l espèce avec laquelle la séquence protéique hypothétique présente la plus forte homologie. L indice de similarité traduit le pourcentage d identité entre les deux séquences alignées. La deuxième colonne fournit le numéro d accès correspondant à la base de donnée PIR. Enfin, dans la troisième colonne figure l alignement entre, au dessus, la séquence peptidique identifiée chez la moule bleue, et au dessous, la séquence indiquée par Fastx. La présence de ces transcrits codant pour des protéines ribosomales laisse à penser que la machinerie de traduction pourrait être régulée par l atrazine. Il convient toutefois de rester prudent quant à l interprétation de ce résultat. En effet, les protéines ribosomales représentent une catégorie de protéines particulièrement abondantes dans les cellules. Il ne peut être exclu que le caractère différentiel de leur expression ne soit qu un artefact généré par la SSH. Cependant un ensemble de travaux récents suggèrent que ces protéines présentent d autres fonctions pouvant être régulés par différents facteurs. Ainsi, à titre d exemple, la protéine S2 apparaît comme étant surexprimée dans différentes lignées tumorales et dans des cellules exprimant un allèle oncogénique de p53 (Loging et Reisman, 1999). D autres recherches font également état de la régulation de l expression de S13 durant le développement sexuel (Jeong et al., 2001) Facteurs d élongation de la traduction Ces facteurs sont impliquées dans la synthèse des protéines et, tout comme les protéines ribosomales, sont fortement représentés dans la cellule. En fait, eef-1 qui est l équivalent de EF-Tu des procaryotes est probablement la protéine la plus abondante dans la cellule (Merrick et Hershey, 1996). La présence du facteur eef-1 dans la banque des clones régulés positivement et négativement confirme le fait que la SSH est capable de générer des artefacts. Il est donc peu probable que les transcrits qui codent ces entités protéiques soient différentiellement exprimés. Les similitudes relevées à partir des clones gld140, glu172, gld78 sont présentées dans le Tableau 3.

19 «Translation elongation factor eef-1» Japanese medaka 99,O% T51991 MGKEKIHINIVVIGHVDSGKSTSTGHLIYKCGGIDKRTIEKFEKEAAEMGKGSFKYAWVL MGKEKIHINIVVIGHVDSGKSTSTGHLIYKCGGIDKRTIEKFEKEAAEMGKGSFKYAWVL DKLKAERERGITIDIALWKFETTKYYVTIIDAPGHRDFIKNMITG : DKLKAERERGITIDIALWKFETSKYYVTIIDAPGHRDFIKNMITG «Translation elongation factor eef- 1 beta chain» Oryctolagus cuniculus 56,4% S62693 AARAGTKKDINSYGSEAPAASNGDA-----DEDDFDLFGSDDEEEVEKEK---QKRLQQY : :: :: :: : : : :: ASLPGIKKALGRYGPADVEDTTGSGATDSKDDDDIDLFGSDDEEESEEAKRLREERLAQY AEKKAKKPALIAKSSIVLDVKPWDDETDMVAMEK : : : : ESKKAKKPALVAKSSILLDVKPWDDETDMVKLEE «Translation elongation factor eef-2» Rattus norvegicus 73,5% EFRT2 QYLNEIKDSAIAGFQWATKEGVLCEENVRGVRYNIHDVTLHADAIHRGGGQIIPTTRRVL :: : : ::: : QYLNEIKDSVVAGFQWATKEGALCEENMRGVRFDVHDVTLHADAIHRGGGQIIPTARRCL YACQLTAKPKIMEPVFLVEIQCPEQAVGGIYSCLNKRRGQVFDNQQIGNTPQFIVKSYLP : :: :: : : :: : ::: ::: : : : YASVLTAQPRLMEPIYLVEIQCPEQVVGGIYGVLNRKRGHVFEESQVAGTPMFVVKAYLP VNESFGFTGDLRSSTGGQAFPQCVFDHWAVMPGDPFDSTSAATTLI : : :: :: : :: VNESFGFTADLRSNTGGQAFPQCVFDHWQILPGDPFDNSSRPSQVV Tableau 3: Orthologues identifiés par Fastx dans la banque de donnée PIR. Pour les détails se reporter à la légende du tableau Régulation de la traduction : l adenosylhomocysteinase Le clone glu61 (Tableau 7) présente une forte analogie avec le transcrit codant pour l adenosylhomocysteinase (SAHH). Cette enzyme, abondante dans les cellules présentant un fort taux de transcription, est chargée de clivée l adenosylhomocysteine. Une inhibition de cette hydrolase se traduit par une accumulation des «heterogeneous nuclear ribonucleoprotein» (hnrnp) et empêche la formation de la coiffe des transcrits primaires. Le lien fonctionnel entre la méthylation de la coiffe et la SAHH est apporté par sa capacité à s associer avec la «mrna(guanine-7-)méthyltransferase» (Radomski et al., 2002). Il est donc possible que la SSAH intervienne dans la régulation de la traduction en régulant l accès des transcrits aux ribosomes. «Adenosylhomocysteinase» (EC ) Xenopus laevis 84,9% JC2480 KPTYKVADIGLADWGRKCIEIAENEMPGLMQMRKMYGESKPLKGARITGCLHMTTQTAVL : : : : :: : KLSYKVADISLADWGRKAIEIAENEMPGLMKMREMHSESKPLKGARIAGCLHMTLQTAVL IETLTALGAQVQWSSCNIFSTQDFAAAAIAKTGVPVYAWKGETDEEYIWCIEQTLVFPDG : : IETLTALGAEVQWSSCNIFSTQDHAAAAIAKTGVPVYAWKGETDEEYIWCIEQTIYFKDG QPLNLILDDGGDLTNLVHERFPQYLPGIAGLSEETTTGV : : :: : KPLNMILDDGGDLTNLVHSKYPQLLKGIKGISEETTTGV Tableau 4 : Orthologue avec glu61 identifié par Fastx dans la banque de donnée PIR. Pour les détails se reporter à la légende du tableau 2.

20 Protéines impliquées dans la transcription Le fait d identifier des protéines impliquées dans la machinerie de transcription ou dans sa régulation comme différentiellement exprimés confirme l adaptation de la production de messager de la cellule à la présence de xénobiotiques. La littérature ne permet cependant pas de déterminer quels sont les répercutions exactes de la variation de la transcription de ces deux gènes sur le reste du transcriptome. En effet, le facteur de transcription AP-2 est capable de se lier à des éléments de réponse localisés dans les régions régulatrices de nombreux gènes et le rôle précis de alr2769 est mal perçu ; il présente cependant des similitudes avec des facteurs de régulations bactériens impliqués dans le contrôle transcriptionnel de gènes codants pour des enzymes extracellulaires. Les similitudes relevées avec gld150 et gld206 sont montrées dans le tableau suivant. «Transcription factor AP-2» Xenopus laevis 28,1% «Transcription regulator alr2769» Nostoc sp 27,0% S34449 AB2152 RDYIPNGYNVPNPCVSPGVWNAVGHYNPLHHTLIKNKFGRDFTSASNFWSLSLCRMD : : : : : : : : : : : : : : : : QDRSPLGNSRPNPILEPGIQSCLTHFNLISHGFGSPAVCAAITALQNYLTEALKAMD LNSTFVTGVXDGTLHPTSFGQYVIQDAIYCLEVSKSFEGAWSRQSDGT-LKTF--LEYEM : : : : : : : :: :::: ::: : : LEHPFVQGIGNGSLEEQKFAYYVGQDAFFLAAFARAYSIAAAKSPDWIGFTTFHNLAGGV TLYKSLGDSLAIKWHVRNASAIVVGPACQSYIDHHLNVSLNEDPIYTVISSIPCERLWPW : :: : :: : :: : : : : : LAEMRLHESYAVQWGV-DLHSVQPGVATRRYTDFLLATAWGGDVGLTAAAMSPCMRLYAF LGMEINSQTHXYGPYADWINKSFSPLYTGYT-KLEAFVNDAYAKGQVDKDKALQIYSKSM :: :: : : : :: :: ::: ::: : LGEQLAKNGIPNHQYADWIRTYCSADFLPLVQQLESLVEN-YATANTLTSST---YRYAM EAEAAFFNS :: LCEQEFFQA Tableau 5 : Similitudes avec respectivement gld150 et gld206 identifiés par Fastx dans la banque de donnée PIR. Pour les détails se reporter à la légende du tableau «Heterogeneous nuclear RiboNucleoProteins (hnrnp)» Bien que l étendue exacte de leurs fonctions ne soit pas encore parfaitement définie, l implication de hnrnp dans l épissage et dans le transport des messagers a pu être établie. Ce constat peut à la fois traduire une augmentation des besoins d épissage donc de l activité transcriptionnelle en générale, mais aussi d une modification de l épissage alternatif (Bultelle, 2002). Enfin, des travaux récents ont mis en évidence leur capacité à influer sur l expression de certains gènes, notamment le gène codant pour le facteur de différentiation egr-1 et le protooncogène c-myc (Ostrowski et al., 2003). Le tableau suivant illustre les similtudes relevées avec respectivement glu100 et glu65. Ces deux clones sont potentiellement stimulés par l atrazine. «Heterogeneous nuclear RNP protein» Homo sapiens 64,3% T02673 SFITYCDRDGANEAVKQLDNYEIKSGKRLKVNISVANQRLFVGNIPKSKSKEEILEEFSK : : ::: : : : : : : : : : AFITFCGKEAAQEAVKLCDSYEIRPGKHLGVCISVANNRLFVGSIPKNKTKENILEEFSK KTEGLIDVIIYRSADKENQKNRGFAFLEYDSHKSASTAKRKLSSGRSKVWNCDVIVDWAD : : :: ::: :: : : : : : : VTEGLVDVILYHQPD-DKKKNRGFCFLEYEDHKSAAQARRRLMSGKVKVWGNVVTVEWAD

21 Tableau 6 : Orthologues identifiés par Fastx dans la banque de donnée PIR. Pour les détails se reporter à la légende du tableau Chaperonnes et catabolisme des protéines «Heat Shock Protein» Les clones gld15, gld122 et gld177 présentent des homologies intéressantes avec des protéines de chocs thermiques ou Heat shock protein (Hsp) (Tableau 7). Ces protéines ubiquitaires possèdent de nombreuses fonctions partiellement connues et sont relativement bien conservées chez les eucaryotes, ce qui suggère qu elles jouent un rôle important au sein de la cellule. Les Hsp70 jouent un rôle crucial dans la translocation et la bonne conformation des protéines (Martin et Hartl, 1994). De nombreuses études font état d une corrélation entre ces protéines et la régulation de l apoptose, sans pour autant proposer de mécanismes d action. Paradoxalement, il existe un certains nombre de publications mettant en évidence un effet suppresseur de l apoptose (Samali et Orrenius, 1998; Jaattela, 1999), alors que dans certaines conditions, les Hsp70 pourraient exercer un effet proapoptotique (Liossis et al., 1997). Par ailleurs, leur régulation par de nombreux facteurs tels que des expositions à des xénobiotiques, des radiations ou le stress oxydant a notamment été démontrée chez Mytilus edulis (Lyons et al., 2003) et constitue désormais un sujet de recherche en expansion. «Heat shock cognate protein 70» Drosophila melanogaster 59,6% A36333 ISESDKKEIMDKCDEIIKWLDAXNLXEKEXFXHXQKXPXGVCNXIIT : : : : : : : ISDSDRTTILDKCNETIKWLDANQLADKEEYEHRQKELEGVCNPIIT «Heat shock cognate protein 70» Homo sapiens 87,4% A27077 QDLLLLDVTPLSLGIETAGGVMTALIKRNTTIPTKQTQTFTTYSDNQPGVLIQVYEGERV : : QDLLLLDVTPLSLGIETAGGVMTVLIKRNTTIPTKQTQTFTTYSDNQPGVLIQVYEGERA MTKDNNLLGKFELTGIPPAPRGVPQIEVTFDIDANGILNVSAVDKSTGKENKITITNDKG MTKDNNLLGKFELTGIPPAPRGVPQIEVTFDIDANGILNVSAVDKSTGKENKITITNDKG RLSKEEIERMVNDAEKYKAEDEQQKDRITAKNSLESYSFNMKQTVEDEKLKDKISESDKK : :: : : :::: : : :: : RLSKEDIERMVQEAEKYKAEDEKQRDKVSSKNSLESYAFNMKATVEDEKLQGKINDEDKQ EIMDKCDEIIKW\LDANNLA\EKEEFEHKQKELEGVCNPIITKLY : : : : : : KILDKCNEIINW-LDKNQTA-EKEEFEHQQKELEKVCNPIITKLY

22 «Heat shock cognate protein 70» Chinese hamster 84,0% A35922 LLLDVTPLSL\GIETAGGVMTALIKRNTT\IPTKQTQTFT\TYS\DNQPGVLIQVYEGER : LLLDVTPLSL-GIETAGGVMTVLIKRNTT-IPTKQTQTFT-TYS-DNQPGVLIQVYEGER AMTKDTXCLESLNLPGIPPAPRGVPQIEVTFDIDANGILNVSAVDKSTGKENKITITNDK : ::: AMTKDNNLLGKFELTGIPPAPRGVPQIEVTFDIDANGILNVSAVDKSTGKENKITITNDK GRLSKEEIERMVNDAEKYKAEDEQQKDRITAKNSLESYSFNMKQTVEDEKLKDKISESDK : :: : : :::: : : :: GRLSKEDIERMVQEAEKYKAEDEKQRDKVSSKNSLESYAFNMKATVEDEKLQGKINDEDK KEIMDKCDEIIKWLDANNLAEKEEFEHKQKELEGVCNPIITKL :: : : : : : QKILDKCNEIISWLDKNQTAEKEEFEHQQKELEKVCNPIITKL Tableau 7 : Orthologues identifiés par Fastx dans la banque de donnée PIR. Pour les détails se reporter à la légende du tableau Protéine du protéasome Le clone glu45 code pour une protéine présentant une similitude avec une protéine régulatrice du protéasome 26S (Tableau 8). Ce complexe enzymatique est chargé de la dégradation des protéines greffées d ubiquitine (Tanahashi et al.,1993). Capable d hydrolyser l ATP, la protéine identifiée est également chargée de recycler l ubiquitine. Une augmentation de l expression du gène codant cette protéine pourrait signifier que l atrazine provoque des dommages aux constituants cellulaires qui sont suffisants pour induire une augmentation de la synthèse de ce complexe afin de dégrader les protéines affectées. 26S proteasome regulatory complex chain p31 Homo sapiens 69,8% S56108 LYQTLKREWDKKPQNLDRCGELLIKLKIALTGVTFLPTDDTAPTKQELLVARDILEIGAQ : : :: :: : :: :: : :: MYEQLKGEWNRKSPNLSKCGEELGRLKLVLLELNFLPTTGTKLTKQQLILARDILEIGAQ WAIAKKDTTAFERYMAQLKCYYMDYKENLPESTYKYQLLGLNLLCLLAQNRVAEFHTELE : : : : : : : : WSILRKDIPSFERYMAQLKCYYFDYKEQLPESAYMHQLLGLNLLFLLSQNRVAEFHTELE LLPVKELQNNIYIKHPVSM\EQYLMEGS/FNKVFLAKGNVP : :: : : : : : RLPAKDIQTNVYIKHPVSL-EQYLMEGS-YNKVFLAKGNIP Tableau 8 : Orthologues identifiés par Fastx dans la banque de donnée PIR. Pour les détails se reporter à la légende du tableau Protéases Les clones gld8, gld229, gld69 et gld156 présentent des homologies significatives avec des protéases. Un ensemble de protéines impliquées dans des phénomènes de dégradation des protéines figurent donc comme candidats à l expression différentielle chez la moule en réponse à la contamination chimique par l atrazine. De façon générale, les processus de protéolyse sont impliqués dans des mécanismes physiopathologiques extrêmement variés. Cependant, le fait d identifier de telles protéines ou appartenant au protéasome laisse à penser que les dommages cellulaires infligés par les contaminants sont susceptibles de modifier les niveaux d expression de composantes importantes du système protéolytique et donc sa capacité à détruire les protéines altérées.

23 «Trypsin-like proteinase (EC )» Drosophila melanogaster 44,0% TRFF EGRIVGGVDTTISQHPHQVSLQRSNSHICGGAIVNADWIVTAAHCVDSSRPQDYRIRAGS : : : : : : : :: : :: DGRIVGGSATTISSFPWQISLQRSGSHSCGGSIYSANIIVTAAHCLQSVSASVLQVRAGS SAHASGGTTRSIELIVSHENYNSGSGTFPNDIALMKMSSSLSLT\GSISXITLATGSPDE : : :: :: : : : :: : :::: :: : : : : : TYWSSGGVVAKVSSFKNHEGYNAN--TMVNDIAVIRLSSSLSFS-SSIKAISLATYNPAN FAGQTCEITGWG-RTCGTCGLPTNLKSLSMQVLRNSEC--RNYWTGNNIIDGHICIFQGS : :: :: : :: :: : :::::: : : : :: : : --GASAAVSGWGTQSSGSSSIPSQLQYVNVNIVSQSQCASSTYGYGSQIRNTMICA-AAS \GYGACNGDSGGPMV : : --GKDACQGDSGGPLV «Trypsin I (EC )» Astacus astacus 41,3% TRCY1 STNEANQRAYTVSQINSHNNYNSRTFDNDIAIMLLAGTVTENDDVSPICVTSLPTSDFFN : ::::: : : :: : ::: : :: :: : : : : SVNEGSEQTITVSKIILHENFDYDLLDNDISLLKLSGSLTFNNNVAPIALPAQGHTATGN QECVVTGWGTTSEGGSTSDRLQEVYKPVLSDAACTLPGRPLEITSAAAC : : : :: :: --VIVTGWGTTSEGGNTPDVLQKVTVPLVSDAECRDDYGADEIFDSMIC «Meprin A (EC ) alpha chain» Homo sapiens 23,7% HYHUMA FKSPFDYNSVTFFYPFAYAKDPSRPTMQAKYE--GEVFPWSVSLSDFDIENVRAGYGCGR ::: : : : : :: : : : :: ::: : : : : LNTPYDYESLMHYQPFSFNKNASVPTITAKIPEFNSIIGQRLDFSAIDLERLNRMYNCTT VGDVIHRQNLLSGAVKCSFEN-DICKWSQDSLNDFDFVRNNGPTKSNGTGPAFDYSNGIG : :: : : : : : : :::::: :: : : THTLLDH CTFEKANICGMIQGTRDDTDWAHQDSAQAGEVDHTLLGQCTGAG YY-ALAEAHGHHNQKARLVSPEL--AAGTYXLRFYYYMSGKDVNRATVNIR----VGSVT : :: : :: : : : : : : : : : YFMQFSTSSGSAEEAALLESRILYPKRKQQCLQFFYKMTGSPSDRLVVWVRRDDSTGNVR K--EFKALEGEQANQWNVFNDEFTVGQNFQVVLEAAMG--QSDLGDIALDDV : :::: :: :: :: : : : : ::::: :: : KLVKVQTFQGDDDHNWKIAHVVLKEEQKFRYLFQGTKGDPQNSTGGIYLDDI «Pancreatic elastase II (EC )» Homo sapiens 35,5% B26823 ARPGRYPWQVSLQLRNSGSWYHICGGSIINNKWVVTAAHCVDGSATNNLRIAAGTTQLSD : : :: : : : : ::: : :: : ::: ARPNSWPWQVSLQYSSNGKWYHTCGGSLIANSWVLTAAHCISSSRTYRVGLGRHNLYVAE TSRTVRTLSRVIMHPSYSGSAAGYPNDIALLELSQSLSLGGNMAAIAVPSTQDFTGSR-- :: : :: :::: ::::: : : :: : :: : : : : SGSLAVSVSKIVVHKDWNSNQISKGNDIALLKLANPVSLTDKIQLACLPPAGTILPNNYP CFLSGWGRLSGSGSSPNVLQDVEMTVISNSEC ::: : : : : : :: :: : CYVTGWGRLQTNGAVPDVLQQGRLLVVDYATC Tableau 9: Orthologues identifiés par Fastx dans la banque de donnée PIR. Pour les détails se reporter à la légende du tableau 2.