Simplexa Bordetella Universal Direct

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1 REF MOL2700 Rév. F Un test de réaction en chaîne de la polymérase (PCR) en temps réel pour la détection qualitative d'adn de Bordetella pertussis et/ou de Bordetella parapertussis Pour diagnostic in vitro APPLICATION Le test Focus Diagnostics Simplexa TM Bordetella est conçu pour fonctionner sur le cycleur intégré «Integrated Cycler» de 3M pour la détection qualitative et la différenciation in vitro de Bordetella pertussis et Bordetella parapertussis dans des frottis par écouvillon nasopharyngés (ENP) chez des patients humains ayant des signes et symptômes d'infection bactérienne des voies respiratoires. Ce test constitue une aide au diagnostic différentiel des infections par Bordetella pertussis et Bordetella parapertussis. Le test au moyen du Simplexa Bordetella ne doit être effectué que si le patient satisfait les critères cliniques et épidémiologiques pour l'étude des échantillons suspects. L'identification de Bordetella pertussis et Bordetella parapertussis doit être réalisée en même temps qu'une évaluation clinique et épidémiologique. Un résultat négatif n'élimine pas l'existence d'une infection par Bordetella pertussis et Bordetella parapertussis et ne doit pas constituer l'unique base pour le traitement ou les autres décisions de prise en charge du patient. RÉSUMÉ EXPLICATIF La coqueluche est une maladie hautement contagieuse du système respiratoire causée par des bactéries de petite taille à Gram négatif : Bordetella pertussis et Bordetella parapertussis. Sur le plan clinique, elle se présente accompagnée d'une toux prolongée ; les patients atteints de coqueluche classique ont souvent des épisodes de violentes quintes de toux qui peuvent être suivies d'une inspiration bruyante et de vomissements. Dans les cas graves, observés le plus souvent chez les jeunes nourrissons, ces symptômes peuvent mener à une hypoxie, une lésion cérébrale permanente, ou un décès. Chez les enfants plus âgés et les adultes, surtout ceux qui ont été vaccinés ou qui ont été préalablement atteints, la maladie peut être plus bénigne et se présenter comme une toux prolongée. Dans la première moitié du XX e siècle, la coqueluche était très répandue et il est probable qu'elle atteignait environ 1 % de la population chaque année 1, la majorité des cas se produisant chez les jeunes enfants. L'introduction de vaccins anti-coquelucheux à germes entiers dans les années 1940 a entrainé un déclin spectaculaire de la maladie ; cependant, une faible incidence de la maladie a persisté. Depuis la fin des années 1990, le nombre de cas de coqueluche signalés dans les pays développés avec un taux élevé de vaccination a augmenté de façon marquée. En 2004, quelque cas ont été rapportés aux États-Unis, représentant l'année avec le plus grand nombre de cas rapportés depuis Des augmentations similaires ont été observées au Canada et en Europe 3. L'Organisation mondiale de la santé estime qu'il y a 50 millions de cas de coqueluche chaque année dans le monde, causant décès 4. La coqueluche peut être décelée dans toutes les tranches d'âge (par ex. nourrissons, enfants, adolescents et adultes). Bordetella pertussis est responsable d'une grande majorité des cas de coqueluche ; cependant, Bordetella parapertussis est la cause d'un faible pourcentage de tous les cas (environ 3 à 35 %), produisant une maladie similaire à la coqueluche mais plus bénigne 5, 6. Bien que la cause exacte de la résurgence de la coqueluche due à Bordetella pertussis soit peu claire, on considère généralement que l'immunité conférée par le vaccin décline après 7 à 10 ans. De ce fait, les enfants vaccinés peuvent devenir susceptibles dans l'adolescence, contracter la maladie et transmettre la bactérie aux très jeunes nourrissons dans leur famille 1, 4. Plusieurs méthodes de laboratoire, y compris culture, sérologie et PCR, sont disponibles pour le diagnostic de la coqueluche. La culture est la méthode de référence et a une spécificité de près de 100 % ; cependant, sa sensibilité est bien plus basse. La sensibilité de la culture peut atteindre 56 % dans la phase précoce de la maladie mais elle diminue au cours du temps et est plus faible chez les patients qui ont reçu un traitement antimicrobien ou un vaccin préalable. L'isolement de B. pertussis en culture nécessite des milieux spéciaux et peut prendre de 7 à 14 jours. Pour cette raison, cette méthode n'est pas nécessairement appropriée pour la prise en charge de cas aigus. La sérologie utilisant des sérums appariés de la phase aiguë et de la phase de convalescence requiert un intervalle d'au moins quatre semaines entre les prélèvements d'échantillons et n'est pas utile pour le diagnostic immédiat. Des tests sérologiques à un seul échantillon pour la détection des IgG dirigées contre la toxine coquelucheuse ont été mis au point pour la recherche, mais ils doivent être effectués au moins deux semaines après le début des

2 Page 2 symptômes. Il existe aussi des essais sérologiques pour la coqueluche utilisant des réactifs disponibles dans le commerce, mais ils n'ont pas été validés sur le plan clinique et pourraient ne pas permettre de différencier entre les infections récentes ou anciennes et la vaccination 10. PRINCIPES DE LA PROCÉDURE Ce test est un système d'amplification et de détection basé sur la réaction en chaîne de la polymérase (PCR) en temps réel utilisant une sonde-amorce fluorescente bifonctionnelle pour la détection et la différenciation d'adn de Bordetella pertussis et de Bordetella parapertussis dans des frottis par écouvillon nasopharyngés (ENP). Ce test a été validé au moyen de deux protocoles de tests différents. Le protocole par EXTRACTION utilise de l'adn extrait d'échantillons de patients, alors que le protocole DIRECT utilise des échantillons non traités. L'ADN est amplifié à l'aide d'une sonde-amorce fluorescente bifonctionnelle utilisée conjointement avec une amorce inverse pour chaque analyte et l'adn de contrôle interne. Le test fournit deux résultats : Bordetella pertussis (Bp) est identifiée dans l'échantillon en ciblant IS481, tandis que Bordetella parapertussis (Bpp) est identifiée dans l'échantillon en ciblant IS1001. Un ADN de contrôle interne est utilisé pour contrôler le processus d'extraction et pour détecter une inhibition de la PCR. MATÉRIEL FOURNI L essai Simplexa Bordetella de Focus Diagnostics contient suffisamment de matériel pour 100 réactions (contrôles inclus). Dès leur réception, conserver tous les réactifs à une température comprise entre -10 et -30 ºC (ne pas utiliser de congélateur avec dégivrage automatique). Les réactifs sont stables jusqu'à la fin du mois de péremption indiqué sur l'emballage du kit lorsqu'ils sont conservés à une température comprise entre -10 et -30 ºC. Après une première utilisation, conserver les réactifs décongelées à une température comprise entre 2 et 8 ºC pendant un maximum de 30 jours. Kit Description de l'étiquetage du kit et des composants du kit Étiquette Focus Diagnostics' Simplexa Bordetella (REF MOL2700) Composants ANGLAIS REF SYMBOLES CE Simplexa Bordetella Primer Mix MOL2701 REAG A Simplexa Master Mix MOL2000 REAG B Simplexa Extraction and Amplification Control DNA MOL9001 CONTROL IC Simplexa No Template Control MOL2001 CONTROL NTC Simplexa Bordetella Positive Control MOL0221 CONTROL + Nombre de tubes par kit Code de couleurs Étiquette Simplexa Bordetella Primer Mix (mélange d'amorces) 2 Brun REF MOL2701 Lot Expire Simplexa Master Mix (mélange maître) 2 Vert REF MOL2000 Lot Expire Simplexa Extraction and Amplification Control DNA (SEAC) (ADN de contrôle 3 Bleu REF MOL9001 Lot Expire d'extraction et d'amplification) Simplexa No Template Control (NTC) (Contrôle sans matrice) 2 Neutre REF MOL2001 Lot Expire Simplexa Bordetella Positive Control (PC) (Contrôle positif) 1 Rouge REF MOL0221 Lot Expire Composant du kit Simplexa Bordetella Primer Mix (mélange d'amorces) Réactions par kit / flacon Volume (µl) pour un flacon 100/50 50 Description des composants du kit Description du composant Amorces fluorescentes marquées spécifiques pour la détection de Bordetella pertussis, Bordetella parapertussis et pour l'adn de contrôle interne. Sonde Excitation Émission Gène Cible fluorophore (nm) (nm) ciblé Bp FAM IS481 Bpp CFR IS1001 SEAC Q S/O Simplexa Master Mix (mélange maître) Simplexa Extraction and Amplification Control 100/ ADN polymérase, tampon et dntp variable 250 ADN (amplicon) de contrôle interne

3 Page 3 (SEAC) (Contrôle d'extraction et d'amplification) Simplexa No Template Control (NTC) (Contrôle sans matrice) Simplexa Bordetella Positive Control (PC) (Contrôle positif) Simplexa Bordetella Barcode Card (Carte à code-barres) 8/4 800 Eau sans nucléase variable 50 ADN amplicon IS481 et IS1001 s/o s/o Paramètres spécifiques au test. MATÉRIEL NÉCESSAIRE MAIS NON FOURNI 1. Integrated Cycler avec le logiciel Integrated Cycler Studio version 3.0 ou plus récente 2. Universal Discs utilisables sur l'integrated Cycler 3. Sceau pour Universal Discs 4. Micropipette(s) monocanal, multicanaux et/ou à répétition ayant une plage de précision de 1 à 10 µl, 10 à 100 µl et 100 à µl 5. Congélateur (dégivrage manuel) entre -10 C et -30 C (pour stockage des composants congelés du kit) 6. Congélateur (dégivrage manuel) entre -10 C et -30 C (pour stockage des échantillons congelés) 7. Réfrigérateur à 2-8 C (pour composants du kit décongelés) 8. Enceinte de sécurité biologique (hotte à flux laminaire) pour les extractions et manipulations des échantillons 9. Microcentrifugeuse 10. Vortex 11. Embouts antiaérosols, stériles, jetables, sans ARNase/ADNase de micropipetteur. 12. Tubes de microcentrifugeuse de 1,5 ml en polypropylène et portoirs (des tubes sans ARNase/ADNase sont recommandés mais non exigés). 13. Tubes coniques de 15 ml en polypropylène et portoirs 14. Eau sans ARNase/ADNase (pour le protocole DIRECT uniquement) 15. Gants à usage unique, non poudrés 16. Portoirs de glacière pour tubes de microcentrifugeuse de 1,5 ml 17. Bloc réfrigérant pour Universal Disc MATÉRIEL NÉCESSAIRE MAIS NON FOURNI Pour le protocole par EXTRACTION 1. 1X TE (ph 8,0), sans ARNase/ADNase (pour la préparation du contrôle moléculaire à utiliser avec le protocole par EXTRACTION uniquement) 2. Système Roche MagNA Pure LC et consommables associés. 3. MagNA Pure LC Total Nucleic Acid Isolation Kit (Kit d'isolement d'acides nucléiques totaux, Roche num. cat ) DURÉE DE CONSERVATION ET MANIPULATION 1. Conserver les réactifs à une température comprise entre -10 et -30 C (ne pas utiliser de congélateur à dégivrage automatique). 2. Ne pas utiliser les kits ou les réactifs au-delà de leur date limite d'utilisation. 3. Laisser les réactifs décongeler à température ambiante (entre environ 18 et 25 C) avant utilisation. 4. Si un délai est nécessaire entre la préparation du mélange réactif et l'organisation de la PCR, conserver le mélange réactif entre 2 et 8 C jusqu'au moment de la mise en place. Utiliser le mélange réactif dans l'heure qui suit. 5. Une fois décongelés, conserver le Mélange d'amorces, le Mélange maître, le Contrôle positif, le SEAC et le Contrôle sans matrice à une température de 2 C à 8 C pendant un maximum de 30 jours. 6. Ne pas recongeler le Mélange d'amorces, le Mélange maître, le SEAC ou le contrôle positif. 7. Ne pas combiner des réactifs provenant de différents lots de kits. MISES EN GARDE ET PRÉCAUTIONS 1. Respectez les précautions habituelles. Tous les échantillons de patients et contrôles positifs doivent être considérés comme potentiellement infectieux et manipulés en conséquence. 2. Portez un équipement individuel de protection comme (mais non limité à) des gants et une blouse de laboratoire lors de la manipulation des réactifs du kit. Lavez-vous soigneusement les mains quand vous avez fini le test. 3. Ne pas pipeter à la bouche. 4. Ne pas fumer, boire, manger, manipuler des lentilles de contact ou se maquiller dans les zones où des réactifs de kits et/ou des échantillons d'origine humaine sont utilisés. 5. Éliminez les réactifs de kits non utilisés ainsi que les échantillons d'origine humaine conformément aux règlements locaux, nationaux et fédéraux.

4 Page 4 6. Dans le laboratoire, le flux de travail doit progresser dans une seule direction en commençant dans les zones de préamplification et en allant vers la zone d amplification/détection : vous trouverez ci-dessous la séquence des événements qui se déroulent depuis l'extraction de l'échantillon jusqu'à l'amplification par PCR en temps réel : Commencez par l'extraction de l'échantillon, suivie par le réglage de l'appareil de PCR en temps réel, la préparation des réactifs et, finalement, l'amplification par PCR en temps réel. N utilisez pas de fournitures et d'équipement indifféremment dans les zones dédiées à l'extraction et à la préparation des échantillons. Il n'est pas recommandé de faire des déplacements croisés entre les différentes zones. Les fournitures et l'équipement utilisés pour la préparation de l'échantillon ne doivent pas servir aux activités de préparation du réactif, ni au traitement de l'adn amplifié ou d'autres sources d'acides nucléiques cibles. Toutes les fournitures et l'équipement d'amplification doivent être conservés en permanence dans la zone de l'appareil de PCR en temps réel. L'équipement individuel de protection, comme les blouses de laboratoire et les gants jetables, doit être réservés spécifiquement à une zone de travail. 7. La contamination des échantillons de patients ou des réactifs peut aboutir à des résultats erronés. Utilisez des techniques respectant les règles d'asepsie. 8. Pipetez et manipulez les réactifs avec prudence pour éviter de mélanger les échantillons de puits contigus. 9. Utilisez des techniques de pipetage correctes et conservez le même schéma de pipetage tout au long de la procédure pour garantir l'obtention de valeurs optimales et reproductibles. 10. Ne substituez pas ou ne mélangez pas des réactifs de différents lots de kits ou avec des réactifs d'autres fabricants. 11. N'intervertissez pas les bouchons des tubes de réactifs. Cela pourrait provoquer une contamination et compromettre les résultats des tests. 12. Utilisez uniquement le protocole décrit dans cette notice. Des écarts par rapport au protocole ou l'utilisation de temps et de températures autres que ceux indiqués pourraient aboutir des résultats erronés. 13. L organisation d un test doit être effectuée sur un bloc réfrigérant pour Universal Disc (entre 18 C et 8 C, environ). Pendant le mélange des réactifs, maintenez les enzymes au froid en utilisant un bloc réfrigérant. 14. Ne réutilisez pas des Universal Discs qui ont été déjà exposés à des échantillons de patients ou à des réactifs. 15. Éliminez le disque utilisé sans détacher ou enlever l'adhésif qui le recouvre. 16. Si différents kits ou lots Simplexa sont installés sur un même disque, il est nécessaire de tester les Contrôles positifs et les Contrôles sans matrice de chaque kit. 17. Le Mélange maître contient de 1 à 10 % de glycérol, ce qui pourrait produire une irritation en cas d'inhalation ou de contact avec la peau. Les mesures de premiers secours doivent être prises en cas d'inhalation ou de contact avec la peau. 18. Il n est pas recommandé de conserver pendant une période prolongée des échantillons à une température comprise entre 2 et 8 C ; la performance du test n a pas été déterminée dans ces conditions. MODE D'EMPLOI PROTOCOLE POUR LE TEST DIRECT DES ÉCHANTILLONS (PROTOCOLE DIRECT) A. PRÉLÈVEMENT DES ÉCHANTILLONS Les types d'échantillons acceptables sont les frottis par écouvillon nasopharyngés (ENP) dans des milieux liquides de transport de virus (par ex. UTM, VCM, M4). Utiliser uniquement des écouvillons avec embout synthétique (par exemple Dacron, nylon, ou rayonne) et une tige en aluminium ou en plastique. Ne pas utiliser d'écouvillons à l'alginate de calcium, car ils peuvent contenir des substances qui empêchent l'étude par PCR. B. CONFIGURATION DE L'APPAREIL DE PCR EN TEMPS RÉEL 1. Reportez-vous au Guide de l'utilisateur de l'integrated Cycler pour plus de détails sur la façon de configurer le logiciel Integrated Cycler Studio pour ajouter une définition de tests, régler une série de tests et analyser les séries sur l'integrated Cycler. C. ZONE DE PRÉPARATION DES RÉACTIFS Zone dédiée à la préparation du mélange réactif du test Simplexa TM Bordetella. 1. Décongelez le mélange d amorces et le mélange maître à température ambiante (entre environ 18 C et 25 C). Chaque flacon de composant du kit contient suffisamment de réactifs pour 50 réactions. Avant chaque utilisation, mélangez doucement les composants du kit mélange d'amorces et mélange maître par inversion (6 à 8 fois) et centrifugez brièvement pour recueillir le contenu dans le fond du tube. 2. Préparez le volume requis du mélange réactif dans un tube de microcentrifugeuse en polypropylène de taille appropriée par pipetage du volume de chaque composant comme indiqué dans le tableau ci-dessous.

5 Page 5 Volumes du mélange réactif à utiliser pour le protocole DIRECT Réactif Mélange réactif Volume / 1 réaction 4 Mélange réactif Volume / 10 réactions Simplexa Master Mix (mélange maître) 40 Simplexa Bordetella Primer Mix (mélange d'amorces) 1 10 Eau sans nucléase 1,8 18 SEAC 0,2 2 Volume total Mélangez doucement le mélange réactif par inversion ou par pipetage (8 à 10 fois). 4. Centrifugez brièvement pour recueillir le contenu dans le fond du tube. 5. Poursuivez avec le paramétrage de la PCR. 6. Utilisez le mélange réactif dans l'heure qui suit sa préparation. Si un délai est nécessaire entre la préparation du mélange réactif et la mise en place de la PCR, conservez le mélange réactif entre 2 et 8 C jusqu'au moment de la mise en place (dans l'heure qui suit). D. ZONE D'AMPLIFICATION PAR PCR EN TEMPS RÉEL Travaillez dans une zone dédiée à la préparation de l'universal Disc à 96 puits pour le test Simplexa Bordetella. Utilisez le bloc réfrigérant pour Universal Disc au cours du chargement des échantillons et du mélange réactif. 1. Décongelez le Contrôle positif et le Contrôle sans matrice à température ambiante (à une température comprise approximativement entre 18 C et 25 C). 2. Ajoutez 7,0 µl du mélange réactif à chacun des puits. 3. Ajoutez 3,0 µl du Contrôle positif extrait dans le puits «PC» du disque. 4. Ajoutez 3,0 µl de l'extrait de l'échantillon de patient dans le puits «S» approprié du disque. 5. Ajoutez 3,0 µl du Contrôle sans matrice dans le puits «NTC» du disque. 6. Recouvrez le disque avec l'universal Disc Cover Tape. 7. Chargez l'universal Disc scellé dans l Integrated Cycler et démarrez la série. PROTOCOLE POUR LE TEST DES ÉCHANTILLONS EXTRAITS (PROTOCOLE PAR EXTRACTION) A. PRÉLÈVEMENT DES ÉCHANTILLONS Les types d'échantillons acceptables sont les frottis par écouvillon nasopharyngés (ENP) dans des milieux de transport Amies ou autres milieux liquides de transport de virus (par ex. UTM, VCM, M4). Utiliser uniquement des écouvillons avec embout synthétique (par exemple Dacron, nylon, ou rayonne) et une tige en aluminium ou en plastique. Ne pas utiliser d'écouvillons à l'alginate de calcium, car ils peuvent contenir des substances qui empêchent l'étude par PCR. B. ZONE D'EXTRACTION DES ÉCHANTILLONS Travaillez dans une zone dédiée à l'extraction des échantillons. La préparation des échantillons pour l'extraction doit être effectuée dans une enceinte de sécurité biologique. PRÉPARATION DU CONTRÔLE POSITIF Préparez le contrôle positif en ajoutant 5 µl de Contrôle positif à 195 µl de 1X TE (ph 8,0). Extraction selon la méthode Roche MagNA Pure LC 1. Les acides nucléiques sont extraits des échantillons de patients et du Contrôle sans matrice à l'aide du kit Roche MagNA Pure Total Nucleic Acid et de l'appareil Roche MagNA Pure LC Automated Nucleic Acid Extractor. Reportez-vous au mode d emploi du fabricant pour l'extraction des acides nucléiques au moyen de ce kit. 2. Dans le menu déroulant «Protocol» (Protocole) du système MagNA Pure LC, sélectionnez dans la liste «Total NA» (acides nucléiques totaux), puis «Total NA Variable_elution_volume.blk». Cela chargera les réglages appropriés pour le test. 3. Le protocole de l échantillon doit être : «Total NA Variable_elution_volume». 4. Le volume de l échantillon doit être réglé à 200 µl et le volume d élution doit être réglé à 50 µl. 5. Le volume de dilution doit être réglé à zéro pour tous les échantillons. 6. Assurez-vous que le protocole post élution est réglé sur «None» (aucun). 7. Assurez-vous que les échantillons et les contrôles sont dans le bon emplacement de la cartouche d'échantillons. 8. Passez chaque échantillon au Vortex pendant 2 à 4 secondes et centrifugez brièvement pour recueillir le contenu dans le fond des tubes.

6 Page 6 9. Pour chaque ensemble de 16 échantillons (de 1 à 16 échantillons), dispenser à l aide d une pipette 100 µl de l'adn SEAC dans un tube conique contenant 6 ml de tampon de lyse MagNA Pure. Mélangez brièvement au vortex. Ajoutez le plateau adéquat à l'appareil d'extraction MagNA Pure. Par exemple, si 32 échantillons sont extraits, dispenser à l'aide d'une pipette 200 µl de l'adn SEAC dans un tube conique contenant 12 ml de tampon de lyse MagNA Pure. Mélangez brièvement au vortex. Ajoutez le plateau adéquat à l'appareil d'extraction MagNA Pure. 10. Pipetez 200 µl de chaque échantillon, Contrôle sans matrice et Contrôle positif dans l'emplacement correspondant de la cartouche d'échantillons. 11. Vérifiez visuellement le niveau des échantillons et des contrôles dans la cartouche d'échantillons afin de vous assurer que les échantillons ont été ajoutés. 12. Transférez la cartouche d'échantillons contenant les échantillons dans le MagNA Pure LC Automated Nucleic Acid extractor et commencez la procédure d'extraction. 13. Lorsque l'extraction des acides nucléiques est terminée, la cartouche contenant les échantillons extraits peut être retirée de l'appareil MagNA Pure et scellée. Conservez l'adn à une température de 2 à 8 C avant utilisation. Une conservation prolongée des échantillons extraits à cette température n'est pas recommandée. Gardez les échantillons d'adn extrait sur un bloc réfrigérant pendant le chargement du disque. C. CONFIGURATION DE L'APPAREIL DE PCR EN TEMPS-RÉEL 1. Reportez-vous au Guide de l'utilisateur de l'integrated Cycler pour plus de détails sur la façon de configurer le logiciel Integrated Cycler Studio pour ajouter une définition de tests, régler une série de tests et analyser les séries sur l'integrated Cycler. D. ZONE DE PRÉPARATION DES RÉACTIFS Zone dédiée à la préparation du mélange réactif du test Simplexa TM Bordetella. 1. Décongelez le Mélange d amorces et le Mélange maître à température ambiante (entre environ 18 C et 25 C). Chaque flacon de composant du kit contient suffisamment de réactifs pour 50 réactions. Avant chaque utilisation, mélangez doucement les composants du kit Mélange d'amorces et Mélange maître par inversion (6 à 8 fois) et centrifugez brièvement pour recueillir le contenu dans le fond du tube. 2. Préparez le volume requis du mélange réactif dans un tube de microcentrifugeuse en polypropylène de taille appropriée par pipetage du volume de chaque composant comme indiqué dans le tableau ci-dessous. Volumes du mélange réactif à utiliser pour le protocole par EXTRACTION Réactif Mélange réactif Mélange réactif Volume / 1 réaction Volume / 10 réactions Simplexa Master Mix (mélange 4,0 µl maître) 40 µl Simplexa Bordetella Primer Mix (mélange d'amorces) 1,0 µl 10 µl Volume total 5,0 µl 50 µl 3. Mélangez doucement le mélange réactif par inversion ou par pipetage (8 à 10 fois). 4. Centrifugez brièvement pour recueillir le contenu dans le fond du tube. 5. Poursuivez avec le paramétrage de la PCR. 6. Utilisez le mélange réactif dans l'heure qui suit sa préparation. Si un délai est nécessaire entre la préparation du mélange réactif et la mise en place de la PCR, conservez le mélange réactif entre 2 et 8 C jusqu'au moment de la mise en place (dans l'heure qui suit). E. ZONE D'AMPLIFICATION PAR PCR EN TEMPS RÉEL Travaillez dans une zone dédiée à la préparation de l'universal Disc à 96 puits pour le test Simplexa Bordetella. Utilisez le bloc réfrigérant pour Universal Disc au cours du chargement des échantillons et du mélange réactif. Pour une utilisation avec le protocole par EXTRACTION 1. Ajoutez 5,0 µl du mélange réactif à chacun des puits. 2. Ajoutez 5,0 µl du Contrôle positif extrait dans le puits «PC» du disque. 3. Ajoutez 5,0 µl de l'extrait de l'échantillon de patient dans le puits «S» approprié du disque. 4. Ajoutez 5,0 µl du Contrôle sans matrice extrait dans le puits «NTC» du disque. 5. Recouvrez le disque avec l'universal Disc Cover Tape. 6. Chargez l'universal Disc scellé dans l Integrated Cycler et démarrez la série.

7 Page 7 COMPTES-RENDUS DES RÉSULTATS La création de comptes-rendus des résultats est un processus en trois étapes. 1. Examen des contrôles pour déterminer si la série de tests est valide. Le logiciel Integrated Cycler Studio supprimera l'interprétation des résultats des patients si l'un quelconque des échantillons programmés comme contrôles n'est pas valide. 2. Examen de la validité des résultats des échantillons de patients. 3. Interprétation des résultats des patients. Si les contrôles ne sont pas valides, les résultats des patients ne peuvent pas être interprétés. 1. Déterminez si la série de tests est valide en examinant le Contrôle sans matrice, le Contrôle positif Bordetella et l'adn de contrôle interne. Critères pour un contrôle valide (simplifiés)* Contrôle Ct de Bp Ct de Bpp Ct de l'adn IC Contrôle sans matrice , mais 0 Contrôle positif 40, mais 0 40, mais 0 Sans objet (S/O) * Voir les notes ci-dessous pour une description complète. a. Si le Contrôle sans matrice est : i. Positif (valeur Ct 40, mais 0 pour Bp ou Bpp) ; cela indique alors une possible contamination des échantillons préparés. Le contrôle n'est pas valide et tous les échantillons de patients doivent être de nouveau extraits et testés. ii. Négatif pour le détecteur de Bp et Bpp (Ct = 0) : ce contrôle est alors valide et acceptable. iii. Si l ADN IC n'est pas détecté dans le contrôle sans matrice, la série de tests n'est pas valide et tous les échantillons de patients doivent être testés de nouveau. iv. Si l ADN IC est détecté pour le Contrôle sans matrice, la série de tests est considérée valide et acceptable. b. Contrôle positif i. Si le résultat du Contrôle positif indique un Ct = 0 pour Bp et Bpp, la série de tests est considérée non valide et inacceptable. Tous les échantillons de patients doivent être testés à nouveau. ii. Si les valeurs Ct pour Bp et Bpp sont 40 mais 0, la série de tests est considérée valide et acceptable. 2. Examen des résultats des échantillons de patients L'examen des résultats des échantillons cliniques doit être effectué après que les contrôles positifs et sans matrice aient été examinés et jugés valides et acceptables. Les résultats pour Bp, Bpp et ADN IC doivent être examinés pour chaque échantillon de patient. a. Les graphiques d'amplification doivent être examinés pour chaque résultat comportant un message «Data Quality» (Qualité des données). Une courbe d'amplification valide présente une augmentation lisse et exponentielle. Une courbe d'amplification non valide peut être non-exponentielle ou linéaire, ou présenter des «pics» de données là où la courbe peut croiser la valeur seuil. Si la courbe est valide après examen, la valeur Ct rapportée peut servir à déterminer si les cibles Bp ou Bpp sont détectées comme indiqué dans la section 3 ci-dessous. Des exemples de courbes valides et non valides sont présentés ci-dessous. Courbe d'amplification valide Courbe d'amplification valide Courbe d'amplification non valide

8 Page 8 b. Si la courbe d'amplification est valide pour Bp ou Bpp, la détection de l'adn IC n'est pas requise pour communiquer un résultat positif. 3. Interprétation des résultats Interprétation des résultats Bp Bpp ADN IC Exemple Interprétation Valeur Ct Valeur Ct Valeur Ct , 0 Bp et Bpp non détectés 2 40, 0 0 S/O Bp détecté , 0 S/O Bpp détecté 4 40, 0 40, 0 S/O Bp et Bpp détectés Ct = seuil du cycle. Détecté : Ct 40, 0. Non détecté : Ct = 0 ; détection de l'adn de contrôle interne Simplexa n'est pas requise pour communiquer un résultat positif. LIMITES 1. Les techniciens doivent être formés et avoir l'habitude des procédures de tests et de l'interprétation des résultats avant d'effectuer le test. 2. Tous les résultats de ce test et des autres tests doivent être utilisés en combinaison avec l'histoire clinique, les données épidémiologiques et les autres données à la disposition du clinicien évaluant le patient. 3. La prévalence de l infection aura un impact sur la valeur prédictive du test. 4. Comme pour d'autres tests, des résultats négatifs n'éliminent pas la possibilité d'infection par Bp ou Bpp. 5. Il peut y avoir des résultats faux négatifs lorsque l'organisme infectant présente des mutations, des insertions, des délétions ou des réarrangements de son génome ou lorsque le test est réalisé très tôt au cours de la maladie. 6. Des résultats faux négatifs peuvent survenir si la quantité d'organismes présents dans l'échantillon est insuffisante en raison d'un prélèvement, transport ou manipulation inadéquats. 7. Comme avec d'autres tests, des résultats faux positifs peuvent survenir. Dans certains cas, une répétition du test, ou le renouvellement du test avec un autre appareil peut être indiqué. 8. Ce test est un test qualitatif et ne fournit pas de valeur quantitative pour l'organisme détecté. 9. Les performances de ce test n'ont pas été établies chez des patients ne présentant pas de symptômes d'infection par Bordetella pertussis ou Bordetella parapertussis. 10. Les performances de ce test n'ont pas été établies pour le suivi médical des traitements contre l'infection par Bordetella pertussis ou Bordetella parapertussis. 11. Les performances de ce test n'ont pas été établies pour le dépistage du sang ou des produits sanguins infectés à la recherche de Bordetella pertussis ou Bordetella parapertussis. 12. Ce test ne peut pas exclure la présence de maladies provoquées par d'autres agents pathogènes bactériens ou viraux. 13. Des infections doubles avec Bordetella pertussis et Bordetella parapertussis sont possibles 6,7, Ce test peut ne pas faire la distinction entre Bordetella pertussis et Bordetella holmesii. Ces deux organismes contiennent le gène IS481. L'incidence rapportée de Bordetella holmesii dans les échantillons cliniques est très peu élevée (< 0,5 %) et il n'est pas certain que Bordetella holmesii puisse causer une maladie respiratoire chez des individus en bonne santé Ce test peut ne pas faire la distinction entre Bordetella pertussis et Bordetella bronchiseptica. B. pertussis et certaines souches de B. bronchiseptica contiennent le gène IS481. Bien qu'elles soient rares, des infections par B. bronchiseptica ont été documentées chez des nourrissons et des individus immunodéprimés 11. CARACTÉRISTIQUES DES PERFORMANCES SENSIBILITÉ ANALYTIQUE / LIMITE DE DÉTECTION La limite de détection (LdD) est la concentration qui entraîne un taux de détection de 95 %. La LdD du test Simplexa a été établie au moyen de Bordetella pertussis A639, Bordetella pertussis ATCC 8467, Bordetella parapertussis A747 et Bordetella parapertussis E595. La LdD pour Bordetella pertussis A639 a été établie à 2,5 cfu/ml pour le protocole par EXTRACTION (20/20 détectés) et à 250 cfu/ml pour le protocole DIRECT (20/20 détectés). La LdD pour Bordetella pertussis A747 a été établie à 10 cfu/ml pour le protocole par EXTRACTION (19/20 détectés) et à 1000 cfu/ml pour le protocole DIRECT (19/20 détectés). Bordetella pertussis ATCC 8467 et Bordetella parapertussis E595 étaient toutes deux détectables à l'aide des deux protocoles.

9 Page 9 REPRODUCTIBILITÉ Deux études distinctes de reproductibilité ont été menées. L'étude de reproductibilité pour le protocole par EXTRACTION a été effectuée par deux opérateurs utilisant chacun un appareil différent. Chaque opérateur a effectué une seule extraction pour chaque échantillon du panel de reproductibilité et a procédé à deux PCR par jour pendant un total de 5 jours (n = 20 exécutions au total). Dans chaque série, trois réplicats de chaque échantillon et contrôle positif ont été testés. Reproductibilité du protocole par EXTRACTION - Bp Intra- et Inter-test Inter-appareil ID échantillon n Moyenne Ct ÉT intratest Intra-test % CV ÉT intertest % CV inter-test Moyenne Ct ÉT % CV BP-modéré 60 29,5 1,01 3,4 0,70 2,4 29,5 0,00 0,0 BP-faible 60 32,7 0,92 2,8 0,72 2,2 32,7 0,00 0,0 BPP-modéré 60 40,0 0,00 0,0 0,00 0,0 40,0 0,00 0,0 BPP-faible 60 40,0 0,00 0,0 0,00 0,0 40,0 0,00 0,0 Négatif 60 40,0 0,00 0,0 0,00 0,0 40,0 0,00 0,0 Reproductibilité du protocole par EXTRACTION - Bpp Intra- et Inter-test Inter-appareil ID échantillon n Moyenne Ct ÉT intratest % CV intra-test ÉT intertest %CV inter-test Moyenne Ct ÉT % CV BPP-modéré 60 31,1 0,43 1,4 0,28 0,9 31,1 0,41 1,3 BPP-faible 60 34,7 0,77 2,2 0,00 0,0 34,7 0,71 2,0 BP-modéré 60 39,9 0,45 1,1 0,00 0,0 39,9 0,00 0,0 BP-faible 60 40,0 0,00 0,0 0,00 0,0 40,0 0,00 0,0 Négatif 60 40,0 0,00 0,0 0,00 0,0 40,0 0,00 0,0 L'étude de reproductibilité pour le protocole DIRECT a été effectuée par deux opérateurs. Chaque opérateur a effectué une série sur trois appareils différents par jour pendant un total de 5 jours (n = 30 exécutions au total). Dans chaque série, trois réplicats de chaque échantillon et contrôle positif ont été testés. Reproductibilité du protocole DIRECT - Bp Inter-appareil Inter-opérateur Inter-série/jour Intra-série Total Échantillon N Moyenne Ct ÉT % CV ÉT % CV ÉT % CV ÉT % CV ÉT % CV Contrôle positif (PC) 90 30,0 0,58 1,9 0,05 0,2 1,40 4,7 0,37 1,2 1,55 5,2 BP positif modéré 89* 32,3 0,98 3,0 0,00 0,0 0,46 1,4 0,72 2,2 1,30 4,0 BP positif faible 90 33,2 1,16 3,5 0,00 0,0 0,24 0,7 1,11 3,3 1,63 4,9

10 Page 10 Reproductibilité du protocole DIRECT - Bpp Inter-appareil Inter-opérateur Inter-série/jour Intra-série Total Échantillon N Moyenne Ct ÉT % CV ÉT % CV ÉT % CV ÉT % CV ÉT % CV Contrôle positif (PC) 90 27,7 0,67 2,4 0,05 0,2 1,45 5,2 0,38 1,4 1,65 5,9 BPP positif modéré 89* 31,5 0,95 3,0 0,20 0,6 0,39 1,2 0,57 1,8 1,19 3,8 BPP positif faible 90 34,6 1,15 3,3 0,14 0,4 0,25 0,7 0,96 2,8 1,52 4,4 * Un réplicat d'échantillon était «non valide». RÉACTIVITÉ ANALYTIQUE / RÉACTIVITÉ CROISÉE Dix-sept (17) organismes ont été testés pour une réactivité croisée potentielle avec Bordetella pertussis et Bordetella parapertussis. Les résultats du test sont résumés dans les tableaux suivants : Réactivité analytique/ réactivité croisée - Bp Agents à réaction croisée potentielle Résultats du protocole par EXTRACTION Première analyse ; analyse de confirmation Résultats du protocole DIRECT Première analyse ; analyse de confirmation Bacillus cereus 0/3 0/3 Chlamydophila pneumoniae 0/3 0/3 Corynebacteria diptheria 2/3 ; 0/5 0/3 Haemophilus influenzae 1/3 ; 0/5 0/3 Haemophilus parainfluenzae 0/3 2/3 ; 1/5* Influenza A/Solomon Island/03/06 H1 0/3 1/3 ; 0/5 Influenza B/Florida/02/2006 0/3 0/3 Klebsiella pneumoniae 0/3 0/3 Legionella pneumophila 0/3 0/3 Moraxella catarrhalis 0/3 0/3 Mycoplasma pneumoniae 0/3 0/3 Neisseria meningitides 0/3 0/3 RSV B WV/14617/85 0/3 0/3 Staphylococcus aureus 1/3 ; 0/5 0/3 Staphylococcus epidermidis 0/3 0/3 Streptococcus pneumoniae 1/3; 3/5** 0/3 Streptococcus pyogenes 0/3 0/3 * Une analyse des séquences a indiqué qu'il n'y avait pas d'homologie significative entre les séquences de BP utilisées dans le test et le génome de H. parainfluenzae. ** Des résultats positifs pour BP obtenus avec S. pneumoniae n'ont pas pu être répliqués lors de tests ultérieurs.

11 Page 11 Réactivité analytique/ réactivité croisée - Bpp Agents à réaction croisée potentielle Résultats du protocole par EXTRACTION Première analyse ; analyse de confirmation Résultats du protocole DIRECT Première analyse ; analyse de confirmation Bacillus cereus 0/3 0/3 Chlamydophila pneumoniae 0/3 0/3 Corynebacteria diptheria 0/3 0/3 Haemophilus influenzae 0/3 0/3 Haemophilus parainfluenzae 0/3 0/3 Influenza A/Solomon Island/03/06 H1 0/3 0/3 Influenza B/Florida/02/2006 0/3 0/3 Klebsiella pneumoniae 0/3 0/3 Legionella pneumophila 0/3 0/3 Moraxella catarrhalis 0/3 0/3 Mycoplasma pneumoniae 0/3 0/3 Neisseria meningitides 0/3 0/3 VRS B WV/14617/85 0/3 0/3 Staphylococcus aureus 0/3 0/3 Staphylococcus epidermidis 0/3 0/3 Streptococcus pneumoniae 0/3 0/3 Streptococcus pyogenes 0/3 0/3 INTERFÉRENCE Quinze (15) substances endogènes et exogènes ont été ajoutées à des échantillons faiblement positifs de Bordetella pertussis et parapertussis, puis testées pour la recherche d interférences éventuelles sur la détection de Bp/Bpp. Dans le protocole par EXTRACTION, la souche Bordetella pertusiss A639 a été testée à la concentration de 25 cfu/ml et la souche de Bordetella parapertusiss A747 a été testé à la concentration de 50 cfu/ml. Dans le protocole DIRECT, la souche Bordetella pertusiss A639 a été testée à une concentration de 1250 cfu/ml et la souche Bordetella parapertusiss A747 a été testée à une concentration de cfu/ml. Les résultats de l'étude d'interférence sont résumés dans le tableau ci-dessous. Interférence Substance potentiellement interférente Concentration de la substance potentiellement interférente Résultats du protocole par EXTRACTION Protocole DIRECT Résultats Bp Bpp Bp Bpp Ampicilline 25 mg/ml 3/3 3/3 3/3 3/3 Azithromycine 25 mg/ml 3/3 3/3 3/3 3/3 Béclométasone 10 % v/v 3/3 3/3 S/O S/O Béclométasone 25 mg/ml S/O S/O 3/3 3/3 Sang 2 % v/v 3/3 3/3 3/3 3/3 Ciprofloxacine 25 mg/ml 3/3 3/3 S/O S/O Ciprofloxacine 250 µg/ml S/O S/O 3/3 3/3

12 Page 12 Substance potentiellement interférente Concentration de la substance potentiellement interférente Résultats du protocole par EXTRACTION Protocole DIRECT Résultats Bp Bpp Bp Bpp Érythromycine 25 mg/ml 3/3 3/3 3/3 3/3 Fluticasone 10 % v/v 3/3 3/3 3/3 3/3 Guaïfénésine / dextrométhorphane 10 % v/v 3/3 3/3 3/3 3/3 Mucine 60 μg/ml 3/3 3/3 3/3 3/3 Bactroban (Mupirocin) 25 mg/ml 3/3 6/8 1 3/3 3/3 Oxymétazoline 10 % v/v 3/3 3/3 3/3 3/3 Chloraseptic phénol 10 % v/v 3/3 3/3 3/3 3/3 Phényléphrine 10 % v/v 3/3 3/3 3/3 3/3 Rifampicine 25 mg/ml 3/3 7/8 2 S/O S/O Rifampicine 250 µg/ml S/O S/O 3/3 3/3 Chlorure de sodium 10 % v/v 3/3 7/8 2 3/3 3/3 1 Bpp n'a pas été détecté dans l'un de trois réplicats d'origine ; et dans l'un de cinq réplicats additionnels (utilisés pour confirmer une interférence possible). 2 Bpp n'a pas été détecté dans l'un de trois réplicats d'origine, cependant Bpp a été détecté dans cinq réplicats additionnels (utilisés pour confirmer une interférence possible). CONCORDANCE CLINIQUE Un total de 222 échantillons, comprenant des échantillons positifs (enrichis et endogènes) et négatifs de Bordetella pertussis et des échantillons positifs (enrichis et endogènes) et négatifs de Bordetella parapertussis ont été testés à l'aide du kit Focus Diagnostics Bordetella (MOL0200) et du kit Simplexa Bordetella suivant le protocole par EXTRACTION (MOL2700). Les résultats de la comparaison des méthodes sont résumés ci-dessous. Concordance clinique Prédicat (MOL0200) n Détectés Simplexa Bordetella (MOL2700) Non détectés Résultats pour Bp Indéterminés %concordance(observé/attendu) IC à 95 % Détectés Non détectés ,5 % (65/66) IC à 95 % : 91,9-99,7 % 96,8 % (151/156) IC à 95 % : 92,7-98,6 % Prédicat (MOL0200) n Détectés Résultats pour Bpp Simplexa Bordetella (MOL2700) Non détectés Indéterminés %concordance(observé/attendu) IC à 95 % Détectés Non détectés % (71/71) IC à 95 % : 94,9-100 % 100 % (148/151) IC à 95 % : 94,3-99,3 %

13 Page 13 COMPARAISON DES MÉTHODES Protocole par EXTRACTION contre protocole DIRECT Afin de démontrer la relation entre les résultats obtenus avec le protocole par EXTRACTION et le protocole DIRECT, une analyse comparative a été effectuée à partir des valeurs de Ct mesurées dans un ensemble d'échantillons positifs enrichis ou endogènes. Les valeurs de Ct des échantillons positifs selon le protocole par EXTRACTION ont été comparées aux valeurs de Ct des mêmes échantillons selon le protocole DIRECT. Pour Bordetella pertussis, la pente de la droite de régression est de 0,98 et l'intercept est de 2,89. Pour Bordetella parapertussis, la pente de la droite de régression est de 1,04 et l'intercept est de 0,56. Dans chaque cas, la pente de la droite de régression indique une bonne corrélation entre les deux protocoles. Figure 1 : Régression Passing-Bablock - Bordetella pertussis Figure 2 : Régression Passing-Bablock - Bordetella parapertussis CONTAMINATION DE L'AMPLIFICATION PAR TRANSFERT La contamination de l'amplification par transfert lors de l'utilisation de l'universal Disc et de l'universal Disc Cover Tape a été évaluée pour d'autres tests Simplexa et ne dépend pas du test.

14 Page 14 RÉFÉRENCES 1. Mattoo & Cherry. Clin Microbiol Rev : Données des Centers for Disease Control (Centres de surveillance épidémiologique des États-Unis) disponibles à : 3. National Consensus Conference on Pertussis. Disponible à : 4. Kerr et al., Eur J Clin Microbiol Infect Dis : Linneman et al., Am J Dis Child : Mertsola, J. Eur J Clin Microbiol : Hoppe, J.E. Pediatr Infect Dis : Iwatta et al. Dev Biol Stand : Loeffelholz, M.J et al. J. Clin Microbiol : Centers for Disease Control and Prevention. Morbidity Mortality Weekly Report (MMWR) 2007 Aug 24; 56: Register, J.B. and Sanden, G.N., Journal of Clinical Microbiology, Dec 2006, p L'utilisation des sondes Scorpions dans un but de diagnostic in vitro chez l'homme est couverte par une licence accordée à Focus Diagnostics, Inc. par DxS, Ltd. Les marqueurs Black Hole Quencher, CAL Fluor, Quasar sont des marques de commerce de Biosearch Technologies, Inc. («BTI»). La technologie des marqueurs Black Hole Quencher, CAL Fluor et Quasar fait l'objet d'une licence aux termes d'un accord avec BTI et ces produits sont vendus exclusivement dans un but clinique, diagnostique ou de recherche-développement. REPRÉSENTANT AUTORISÉ mdi Europa GmbH, Langenhagener Str , Langenhagen-Hannover, Allemagne RENSEIGNEMENTS POUR LES COMMANDES Téléphone : Fax : ASSISTANCE TECHNIQUE (800) (États-Unis uniquement) (562) (562) (International) PI.MOL2700.IVD.FR Rev F Date de rédaction : 18 juliette 2012 Téléphone : Fax : (800) (États-Unis uniquement) (562) Consultez notre site internet à l'adresse +1 (562) (International) Cypress, Californie États-Unis