Validation des méthodes d'analyse. Journées Qualité et Chimie 2010 Une démarche qualité au service de la chimie Autrans - 14 octobre 2010

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1 Validation des méthodes d'analyse Journées Qualité et Chimie 2010 Une démarche qualité au service de la chimie Autrans - 14 octobre 2010 Marie-Dominique Blanchin Laboratoire de Chimie Analytique

2 Référentiels ISO 5725 : Exactitude et fidélité d'une méthode de mesure ISO : Prescriptions générales concernant la compétence des laboratoires d'essai et d'étalonnage Compétences management de la qualité Compétences techniques mdb - 14 octobre

3 Référentiels/Industrie Pharmaceutique ICH : International Conférence on Harmonisation Q2(R1) 2005 : validation of analytical procedures test and methodology Pharmacopée américaine, USP33-NF28 <1225> Validation of compendial methods FDA guidance for industry. Analytical procedures and method validation Eurachem mdb - 14 octobre

4 ICH /Définitions Méthode d'analyse Document écrit "Moyen de réaliser l'analyse" "Description détaillée des différentes opérations nécessaires pour effectuer l'analyse de la substance à examiner" mdb - 14 octobre

5 ICH / Définitions Validation "Le but de la validation d'une méthode d'analyse est de démontrer qu'elle correspond à l'usage pour lequel elle est prévue" Ensemble des opérations nécessaires pour prouver que le protocole est suffisamment exacte et fiable pour avoir confiance dans les résultats fournis et ceci pour un usage déterminé mdb - 14 octobre

6 Définitions Validation Application déterminée Niveau de la validation Fonction de l'application Objectif clairement déterminé mdb - 14 octobre

7 Critères de validation Spécificité Linéarité Exactitude Fidélité Intervalle d'application Limite de détection Limite de quantification Robustesse Stabilité des solutions mdb - 14 octobre

8 Spécificité Specificity "Capacité de la méthode de permettre une évaluation non équivoque de l'analyte en présence de composants qui sont susceptibles d'être présents" Capacité de faire la discrimination analyte /substances interférentes Garantir que le résultat de l'analyse analyte Absence d'interférences mdb - 14 octobre

9 Spécificité Specificity Impuretés Ajouts dosés impuretés disponibles sur composé ou formulation Comparaison avec résultats obtenus sur des échantillons contenant des impuretés ou des produits dégradation (lumière, t, humidité, hydrolyse acide ou alcaline, oxydation) Profil impuretés mdb - 14 octobre

10 Spécificité Specificity Si méthode CLHP, vérifiée par Injection placebo analytique = matrice (dégradé, non dégradé) composés interférents potentiels, produits de décomposition, intermédiaires, précurseurs de synthèse échantillons dégradés (lumière, t, acide, alcalin, oxydant) Observation des chromatogrammes obtenus Vérification homogénéité des pics mdb - 14 octobre

11 Linéarité Linearity "Capacité dans un intervalle donné d'obtenir des résultats de dosage directement proportionnels à la concentration ou à la quantité d'analyte dans l'échantillon" Relation linéaire signal - concentration mdb - 14 octobre

12 Linéarité Linearity Exemple méthode CLHP, vérifiée par injection de solutions étalons d analyte : linéarité de la gamme d'étalonnage Solutions échantillons reconstitués concentrations d'analyte différentes : linéarité de la méthode n 5 concentrations n 3 répétitions de chaque niveau mdb - 14 octobre

13 Linéarité Linearity Intervalle de linéarité fonction de Analyte (impureté, principe actif, conservateur, ) Application (formulation, test de dissolution, ) Vérifiée : examen de la courbe, analyse de variance Exprimée : Équation de la droite avec intervalle de confiance sur pente, ordonnée à l origine, coefficient de détermination r 2 Si linéarité + ordonnée origine =0 : 1 seul point étalon en routine mdb - 14 octobre

14 Exactitude (justesse) Accuracy "Etroitesse d accord entre la valeur trouvée et la valeur acceptée soit comme valeur conventionnellement vraie soit comme valeur de référence" ISO 5725 Exactitude : étroitesse d'accord entre la résultat d'essai et la valeur de référence acceptée Justesse : étroitesse d accord entre la valeur moyenne obtenue à partir de larges séries d'essais et une valeur de référence acceptée écart d'une valeur obtenue / valeur considérée comme exacte mdb - 14 octobre

15 Exactitude (justesse) Accuracy Exact, non fidèle Inexact, non fidèle Exact, fidèle Inexact, fidèle mdb - 14 octobre

16 Exactitude (justesse) Accuracy Exactitude erreur systématique (biais) d'une valeur obtenue / valeur considérée comme exacte Vérifiée par comparaison méthode de référence préparation échantillons reconstitués (matrice + quantité connue d analyte) et étalons n 3 x 3 concentrations différentes en analyte mdb - 14 octobre

17 Exactitude (justesse) Accuracy Tracé droite qté trouvée - qté ajoutée (= théorique ou vraie) Méthode exacte si pente=1 ordonnée origine =0 Tracé droites réponse-qté ajoutée et réponsequantité étalons Méthode exacte si pente et ordonnée origine =0 identiques Taux de recouvrement ou erreur relative % mdb - 14 octobre

18 Fidélité Precision " Etroitesse d accord entre une série de mesures obtenues dans des conditions prescrites à partir de prises d essais multiples provenant d une même échantillon homogène" ou degré de dispersion des résultats ou écart aléatoire de valeurs / valeur moyenne mdb - 14 octobre

19 Fidélité Precision Fidèle, inexact Non fidèle, inexact Fidèle, exact Non fidèle, exact mdb - 14 octobre

20 Fidélité Precision Fidélité erreurs aléatoires Répétabilité Fidélité intermédiaire Reproductibilité mdb - 14 octobre

21 Fidélité, répétabilité Repeatability "La répétabilité exprime la fidélité évaluée dans des conditions opératoires identiques et dans un court intervalle de temps" Déterminée à partir d'un même échantillon, évaluée dans des conditions opératoires identiques (même analyste, même équipement, même laboratoire, ) et dans un court intervalle de temps mdb - 14 octobre

22 Fidélité, répétabilité Repeatability Répétabilité de la mesure : n 6 même échantillon Répétabilité de la méthode : n 6 ou n 3x3 mdb - 14 octobre

23 Fidélité, fidélité intermédiaire Intermediate precision "La fidélité intermédiaire exprime la variabilité intra-laboratoire : jours différents, analystes différents, équipements différents, etc " Détermination à partir d'un même échantillon bien spécifier les conditions plan expériences mdb - 14 octobre

24 Fidélité, reproductibilité Reproductibility " La reproductibilité exprime la variabilité inter laboratoires (études collaboratives) habituellement appliquées à la standardisation de la méthodologie" Déterminations à partir d un même échantillon mdb - 14 octobre

25 Fidélité, expression Precision Écart-type s (standard deviation) Variance s 2 Coefficient de variation, s/m*100 ( relative standard deviation) % mdb - 14 octobre

26 Intervalle de validité Range "Intervalle compris entre la concentration (quantité ) la plus élevée et la plus faible de l'échantillon dans lequel il a été démontré que la méthode d'analyse présente une fidélité, une exactitude et une linéarité satisfaisante." mdb - 14 octobre

27 Limite de détection Detection Limit " La limite de détection d'une méthode d'analyse est la plus petite quantité d analyte qui peut être détectée mais pas nécessairement quantifiée comme une valeur exacte" Exprimée en quantité injectée ng, µg mdb - 14 octobre

28 Limite de détection Detection Limit Évaluation visuelle Évaluation signal/bruit Évaluation pente et écart-type mdb - 14 octobre

29 Limite de détection Detection Limit Exemple méthode CLHP Masse ou concentration d analyte qui donne un rapport S/B = 3 Bruit pic à pic Vérifiée dans matrice par injection à la concentration retenue comme LD mdb - 14 octobre

30 Limite de quantification Quantification Limit "Quantité la plus faible d analyte dans un échantillon qui peut être déterminée quantitativement avec une fidélité et une exactitude appropriée" Exprimée en ng ou µg mdb - 14 octobre

31 Limite de quantification Quantification Limit Évaluation visuelle Évaluation signal/bruit Évaluation pente et écart-type mdb - 14 octobre

32 Limite de quantification Quantification Limit Évaluée : quantité ou concentration d analyte S/ B = 10 Vérifiée en injectant des solutions de conc. =LQ mdb - 14 octobre

33 Robustesse Robustness "Capacité du protocole de rester non affectée par des variations faibles mais délibérément introduites dans les paramètres de la méthode; fournit une indication sur sa fiabilité dans des conditions normales d utilisation" Variations faibles : modifications contrôlées des conditions d'application (changements délibérés mais limités facteurs indépendants) étude de l'effet de chaque facteur sur le résultat de l'analyse mdb - 14 octobre

34 Robustesse Robustness Vérifiée par approche multivariée ou univariée (plan d'expériences) Permet de fixer les limites des tests de conformité Donne une idée sur variations entre jours, entre laboratoires étape préliminaire avant de transférer les méthodes, avant les études collaboratives mdb - 14 octobre

35 Robustesse Robustness Exemples de facteurs Temps d'extraction Temps d' agitation CLHP ph de la phase mobile Composition de la phase mobile Débit Colonne Température. Permet de fixer les limites des tests de conformité mdb - 14 octobre

36 Stabilité des solutions Vérifiée sur solutions étalons et échantillons Vérifiée par comparaison des facteurs de réponse Exemple méthode CLHP Solution «vieillie» Solution «fraîche» Temps > 16h (injecteur automatique) mdb - 14 octobre

37 Conclusion Validation initiale Pas de règles Recommandations; lignes directrices Pas de protocole figé Adaptation à l'usage, aux exigences mdb - 14 octobre

38 Conclusion Routine Validation in situ : confirmation validation initiale applicable ( suivi des paramètres, CQ, ) Tests de conformité HPLC Paramètres chromatographiques Tr, Rs, N Répétabilité injections successives (n = 6) mdb - 14 octobre

39 TEST PARAMETRE CRITERE D ACCEPTATION Identification Spécificité Test garantissant l identité de l analyte Tests quantitatifs majeurs Exactitude/TR Répétabilité Fidélité intermédiaire Linéarité Spécificité 95 à 105 % qté théorique Doit être prouvée RSD 3 % R 2 0,98 ou R 0,99 Rs satisfaisante entre les pics PA et pdts de dégradation connus; évaluation de l interférence du placebo Dosage de faibles conc. (pdts de dégradation, impuretés) Robustesse Exactitude/TR Répétabilité Linéarité Spécificité LD LQ Doit être démontrée 70 à 130 % de la qté tolérée RSD 10 % R 2 0,95 ou R 0,97 Rs satisfaisante entre pics PA et pdts de dégradation connus; évaluation de l interférence du placebo Pour tests limites uniquement Doit être démontrée mdb - 14 octobre

40 Quelques livres Validation and Qualification in Analytical Laboratories L. Huber Interpharm / CRC 1999 L'assurance qualité dans les laboratoires agro-alimentaires et pharmaceutiques M. Feinberg, coordonnateur Ed TEC&DOC 2001 Analytical method validation and instrument performance verification Ed Chung Chow Chan, H. Lam, Y.C. Lee, X.M. Zhang John Wiley&Sons, 2004 Validation of chromatography data systems Meeting business and regulatory requirements R.D. McDowall Ed Royal Society of Chemistry, 2005 Method validation in pharmaceutical analysis a guide to best practice Ed J. Ermer and J.H. McB. Miller Wiley- VCH, 2005 mdb - 14 octobre