Etude ancillaire au protocole clinique OS2006 : Analyse des paramètres osseux chez les patients atteints d ostéosarcome traités par le zometa.

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1 Etude ancillaire au protocole clinique OS2006 : Analyse des paramètres osseux chez les patients atteints d ostéosarcome traités par le zometa. Projet déposé par REDINI Françoise (Directeur de Recherche INSERM), INSERM UMR957, Faculté de Médecine, Nantes I. Rationnel L ostéosarcome représente la plus fréquente des tumeurs osseuses primitives et touche plus généralement une population jeune, avec 75% des ostéosarcomes diagnostiqués entre 8 et 25 ans (médiane d âge de 18 ans). Le site préférentiel du développement de l ostéosarcome se situe au niveau des os longs tels que ceux des membres supérieurs et inférieurs avec une localisation métaphysaire, au niveau des plaques de croissance. Cette localisation ainsi que l âge de survenue de l ostéosarcome suggère un lien entre la croissance osseuse et l initiation de la tumeur. L ostéosarcome est défini par l Organisation Mondiale de la Santé (OMS) comme une tumeur maligne caractérisée par l élaboration d os ou de substance ostéoïde par les cellules tumorales qui dérivent donc, de près ou de loin, de la lignée ostéoblastique. Les signes cliniques des tumeurs osseuses primitives n ont aucune spécificité, la douleur étant le symptôme initial le plus fréquent. La survenue de cette douleur est la conséquence d une atteinte osseuse pouvant aller jusqu à la fracture. On assiste donc dans cette pathologie à un dérèglement complet du remodelage osseux avec à la fois une production anarchique de substance ostéoïde par les cellules tumorales et des atteintes osseuses ostéolytiques, la cellule tumorale venant dérégler l équilibre apposition/résorption osseuse. Il est maintenant bien admis que le développement tumoral en site osseux repose sur l existence d un cercle vicieux entre les cellules tumorales et les ostéoclastes, cellules responsables de la résorption osseuse. Associer au traitement conventionnel (chimiothérapie pré et postopératoire / chirurgie) un agent antirésorption osseuse tel que l acide zolédronique (zometa ) se trouve ainsi justifié pour bloquer ce cercle vicieux. Des études précliniques réalisées dans un modèle d ostéosarcome chez le rat ont permis de faire la preuve de concept du bénéfice de cette association au niveau de la prévention de la rechute, de la qualité du tissu résiduel ainsi que de l inhibition de la formation de métastases pulmonaires (Heymann et al, Bone 2005 ; Ory et al, Cancer 2005). L expertise du laboratoire repose sur une meilleure connaissance des paramètres de la résorption osseuse associée au développement tumoral en site osseux. Le développement de telles approches nécessite une cartographie la plus exhaustive possible des paramètres cellulaires et moléculaires associés à ces tumeurs. Dans une étude préliminaire (71 biopsies de patients atteints de 1

2 pathologies ostéolytiques), il a été montré que le rapport RANKL (Receptor Activator of NFkB Ligand)/OPG (Ostéoprotégérine) était significativement augmenté chez les patients atteints d ostéolyses tumorales sévères, tant au niveau des transcrits que des dosages sériques (Grimaud et al, Am J Pathol 2003). Ce travail soulève la question de l intérêt du rapport RANKL/OPG comme marqueur pronostic des pathologies ostéolytiques tumorales comme cela vient d être envisagé pour le myélome. II. Objectifs Grâce à la disponibilité de matériels biologiques (sérum, acides nucléiques) issus des patients inclus dans le protocole de phase III multicentrique OS2006 (8 bras : avec/sans zometa ; < ou > à 18 ans, bons ou mauvais répondeurs à la chimiothérapie néoadjuvante ; 480 patients inclus au total), nous pourrons suivre l évolution des marqueurs du remodelage osseux dans cette pathologie ainsi qu au cours du traitement (prélèvements au diagnostic, à la chirurgie, à la fin du traitement, 1 an après la fin du traitement). Ces données nous permettront: de corréler la réponse des patients avec une signature «osseuse», d estimer d éventuels facteurs de prédisposition liés à la qualité osseuse, d analyser l impact des traitements (et notamment du zometa ) sur les paramètres du remodelage osseux afin d anticiper d éventuelles interférences avec la croissance osseuse, notamment pour les patients pédiatriques. 2

3 III. Méthodologies 1. étude de l expression de gènes cibles à partir de matériel extrait de biopsies/pièces opératoires (analyse réalisée en collaboration avec le service des études transcriptomiques à l IGR, Villejuif : service du Pr V. Lazar) L expression des différents marqueurs (notamment le rapport RANKL/OPG) sera corrélée aux données cliniques : agressivité de la tumeur, réponse aux bisphosphonates, réponse histologique des patients aux différents traitements de chimiothérapie. Un premier criblage sera réalisé par des puces microarray (analyse transcriptomique) à Villejuif, puis nous confirmerons au laboratoire les modifications d expression par RTqPCR puis au niveau protéique. Nous nous intéresserons plus particulièrement: aux facteurs impliqués dans la régulation de la résorption osseuse : cytokines de la famille du TNF et leurs récepteurs [ostéoprotégérine (OPG)/Receptor Activator of NFkappa B (RANK)/RANK Ligand (RANKL)], cytokines de la famille de l Interleukine (IL)6 et ses récepteurs [oncosatine M (OSM), gp130, Leukemia Inhibitory Factor(LIF), IL6, IL11 ]. à la balance de l expression des protéases impliquées dans la résorption osseuse (cathepsine K, MMP2, MMP9, TACE ) et de leurs inhibiteurs (TIMPs, cytostatines), corrélée au diagnostic des patients (présence de métastases pulmonaires, survie). au statut de la protéine p53 (forme mutée et sauvage) corrélée avec l agressivité de la tumeur. aux homéogènes des familles Dlx et Msx, impliqués dans le développement et dans certaines pathologies osseuses. Rien n étant actuellement connu sur leur rôle ou implication éventuelle dans les tumeurs osseuses, leur expression sera donc étudiée dans la pathogénie des ostéosarcomes. à l expression des facteurs de résistance : gène MDR, récepteurs activateurs/compétiteurs de TRAIL (TNF Related Apoptosis Inducing Ligand), FLIP [FLICE (FADDlike Interleukin 1 beta Converting Enzyme) Inhibitory Protein] 2. Dosages biologiques sériques à partir de prélèvements réalisés au diagnostic, à la chirurgie, à la fin du traitement et 1 an après la fin du traitement (analyses réalisées dans le laboratoire INSERM UMR957, Nantes):. dosage de cytokines régulatrices du remodelage osseux : ostéoprotégérine (OPG)/Receptor Activator of NFkappa B Ligand (RANKL) par kits ELISA 3

4 . dosage des paramètres du remodelage osseux : NTX, ostéocalcine, activité TRAP, ostéocalcine, phosphatase alcaline, IV. Analyse et population : Afin d établir des tests statistiques les plus significatifs possibles, l analyse réalisée en collaboration avec l oncopédiatre biostatisticienne MarieCécile Le Deley (IGR, Villejuif) sera effectuée à partir d une population maximale inclue dans le protocole, soit au minimum 1020 patients par bras (minimum patients au total), afin de valider les marqueurs de façon indépendante. Pour être complète, l analyse devra porter sur 4 prélèvements par patient (voir ci- dessus). L idéal serait d avoir un maximum de patients pédiatriques, car les constances osseuses varient beaucoup pendant la croissance. V. Besoins et Coût global pour 160 patients : Besoins : deux séries nous intéressent plus particulièrement : o Avec ou sans zometa o Bons ou mauvais répondeurs Et à chaque fois différencier : patients adultes et pédiatriques (car les paramètres du remodelage osseux varient avec l âge), donc 8 sousgroupes qui correspondent aux 8 bras du protocole. Il nous faut un minimum de 20 patients par sousgroupe et des séries complètes dans tous les cas (soit 160 prélèvements au minimum) Quantité de matériels : minimum 1 ml de sérum pour les dosages ELISA des paramètres osseux et Justification du coût : besoins en volume BAP: 435 HT/plaque (40 échantillons en duplicat, soit 10 patients) 20 µl ostéocalcine : 338 HT /plaque 25 µl NTX : 450 HT/plaque TRAP5b : 446 HT/plaque 50 µl 50 µl 4

5 OPG : 450 HT/plaque amplisrankl : 450 HT/plaque 100 µl (ou dilué) 100µL Au minimum, nous aurons besoin de 16 plaques / paramètre dosé ; En effet, nous pourrons analyser 40 échantillons en duplicat sur une plaque, soit 10 patients (4 prélèvements /patient en cinétique : diagnostic, chirurgie, fin du traitement et 1 an après la fin du traitement) pour un total minimal de 160 patients. Nos besoins seront donc d environ 2 plaques pour chaque paramètre par an, pour un total de 5130 /an (soit environ pour les 8 ans). Nos besoins financiers sont de HT pour l'ensemble des analyses sériques sur les 8 ans d inclusions + analyses du protocole. Nous avons déjà initié des dosages depuis 3 ans sur les 25 premières séries complètes de sérums (4 prélèvements / patient). Nous avons bénéficié de fonds de la Ligue Contre le Cancer en année 1 qui avaient été obtenus par pour l ensemble des analyses ancillaires, mais insuffisants pour nos expérimentations (environ 4000 ). Les analyses en année 2 et 3 ont été financées sur les fonds propres de notre laboratoire (environ 6000 ), mais les budgets ayant été diminués cette année, nous ne pourrons pas poursuivre sans financement complémentaire. Il nous reste donc à trouver pour continuer à analyser ces sérums. 5

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