Résumé. Introduction

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1 Résumé Dans cette expérience, nous nous sommes familiarisées avec la spectrophotométrie d absorption moléculaire (UV-Visible) à l aide de la molécule de pyridoxine. Introduction La première partie de cette expérience consiste à déterminer les paramètres analytiques λ et ε. Ensuite, la deuxième partie consiste à déterminer la constante d équilibre acide base K ab de la pyridoxine dans l équilibre ci-dessous : OH OH OH HO N + H OH Kab -O N + H OH O N OH Forme acide Forme neutre Forme basique Finalement, la dernière partie consiste à déterminer la quantité de pyridoxine dans un échantillon pharmaceutique de vitamine B 6. Page

2 Méthodologie Détermination de la constante d'acidité: 7 solutions tampons ont été préparées de la manière suivante : Solutions tampons Volume total préparé [ml] Volume de Na 2 HPO 4 0.2M [ml] Volume d acide citrique 0.M [ml] Page 2

3 Nous avons ensuite préparer des solutions de 50 ml de pyridoxine d une concentration de 0-4 M dans chacun des tampons ci-dessus. V pyridoxine 3 0 M = 0 4 M 50 ml=5ml 0 3. M Le volume de tampon est donc égal à : 50 ml- 5 ml= 45 ml. Au moyen du -mètre correctement étalonné, nous avons alors contrôlé le exact de chacune des solutions. La solution tampon de 4.4 a été utilisée comme blanc puis les absorbances des solutions et 7 ont été mesurées afin de déterminer les longueurs d onde analytiques λ et λ2 correspondant au maximum d absorbance de la forme acide et de la forme neutre de la pyridoxine. Nous allons donc pouvoir déterminer les coefficients d extinctions molaires grâce aux spectres du le plus faible et du le plus fort. En effet, au le plus faible réside la forme acide de la pyridoxine et au le plus fort réside la forme neutre de cette molécule. Dosage quantitatif de la pyridoxine dans une préparation pharmaceutique : 6 solutions étalons de 25mL contenant des concentrations croissantes de pyridoxine ont été préparées : 0-5, 2.0-5, 4.0-5, 6.0-5, 8.0-5, 0-4. Les absorbances ont été ainsi mesurées. 3 tablettes de vitamine B6 préalablement pesées ont été broyées puis dissoutes chacune dans 50mL de tampon. Après filtration, les solutions ont été complétées à 250mL avec le tampon. Les absorbances de ces solutions ont été mesurées. tablette Masse de la pastille entière [g] Masse de la pastille broyée [g] A B C Page 3

4 Résultats Détermination des paramètres analytiques : Solution,55 2 2,5 3 3,6 4 3,97 5 4,64 6 5,24 7 6,4 A l aide du spectre d absorption des solutions de.55 et 6.6, on a pu déterminer les longueurs d onde judicieuses pour déterminer la constante d équilibre K. La loi de Lambert-Beer sous sa forme additive s écrit : A λ λ λ = l( ε C + ε 2 ) 2 C Avec ε le coefficient d extinction molaire de l espèce i [l.cm - mol - ] Ci la concentration [mol/l] On considère qu à.55, il y a 00% de forme acide, on va donc calculer le coefficient d extinction molaire de la forme acide (ε RH2+ ) d après l absorbance mesurer. Page 4

5 À 6.6, il y a 00% de la forme neutre. λ nm A(acide) A(neutre) ε(acide) ε(neutre) 29 0,82 0, , On calcul ε avec la formule : ε = A/(l*C) Sur le spectre d absorption, on peut voir les deux points isobestiques, il s agit des intersections. A ces points l absorbance des deux espèces est la même et ne dépend pas du de la solution. Détermination de la constante acide- base K ab : Méthode D après la loi de Lambert-Beer : A29 =l ε 29 acide C acide A 324 =l ε 324 acide C acide ε neutre C neutre ε neutre 324 C neutre On trouve [ Neutre ]= A324 ε 29 Acide A 29 ε 324 Neutre [ Acide ] A 29 ε 324 neutre A 324 ε 29 neutre Loi d action de masse de K ab : = [ neutre ][ H ] [ acide ] K ab [ neutre ]0 = [ acide ] K ab = A324 ε 29 Acide A 29 ε 324 Neutre 0 A 29 ε 324 neutre A 324 ε 29 neutre Page 5

6 On calcul K ab pour chaque solution : Absorbance 29nm Absorbance 324nm [RH] M [RH2] M Kab [H+] M pka 2,5 0,8352 0,095 2,6E-06 9,78E-05 6,98E-05 3,6E-03 4,6 3,6 0,8094 0,03 3,83E-06 9,62E-05 2,76E-05 6,92E-04 4,56 3,97 0,6963 0,522 2,3E-05 7,87E-05 2,90E-05,07E-04 4,54 4,64 0,4972 0,346 4,93E-05 5,07E-05 2,23E-05 2,29E-05 4,65 5,24 0,3438 0,5464 7,82E-05 2,8E-05 2,06E-05 5,75E-06 4,69 Moyenne 4,52 Ecart type 0,2 Méthode Bilan de masse : = [ AH ] + [ AH ] + [ A ] c tot Si on considère que [A - + ] est négligeable, on a c tot = [ AH ] + [ AH ] 2 L équation de Henderson-Hasselbalch donne : = pka log [ AH ] [ AH 2 ] log [ AH ] [ AH 2 ] =log A A AH 2 A AH A Avec le graphique du A AAH 2+ log en fonction du, on peut trouver la pka. A A AH Page 6

7 Pour λ=324nm Absorbanc e 324nm log((a-a acide / (A neutre -A)) 2,5 0,095 -,655 3,6 0,03 -,40 3,97 0,522-0,568 4,64 0,346-0,03 5,24 0,5464 0,554,55 0,0045 6,4 0,6979. nm. log a =-. ±. b =. ± Page 7

8 pka 4,6409 Erreur 0,4204 Ka 2,286E-05 Pour λ=29nm Absorbanc e 29nm log((a-a acide / (A neutre -A)) 2,5 0,82 -, ,6 0,8094 -, ,97 0,6963-0, ,64 0,4972 0, ,24 0,3438 0, ,55 0,8453 6,4 0, nm 0.0 log a = ± b =0.748 ± Page 8

9 pka Erreur Ka 4, , ,79434E-05 On constate que l erreur est grande, cela vient du fait qu à 29nm on ne peut pas considérer que la forme neutre n absorbe pas. Méthode 3 Cette méthode est graphique, on fait un diagramme de spéciation. nm Absorbance... nm. On trouve pka est environ égal à Cette méthode est la plus rapide mais il y a une imprécision à cause de la lecture graphique du résultat. La valeur théorique de pka est de Donc toute les valeurs trouver sont proches, les trois méthode sont donc efficaces. Page 9

10 Dosage quantitatif de la pyridoxine dans une préparation pharmaceutique : Courbe de calibrage :.. Absorption.... Coefficient values ± one standard deviation a =. ±. b =. ± Concentration M x - A partir de l équation de la régression linéaire, on peut déterminer la concentration de pyridoxine. Il s agit d un étalonnage externe. Echantillon Masse g Absorbanc e Concentratio n M masse pyridoxyne g m pyridoxyne/mass e tablette 0,943 0,76 0, ,968 0,682 0, ,99 0,667 0, , , , , , , L intervalle de confiance (μ) à 95% se calcul d après la formule : µ = X ± 2σ( X ) Page 0

11 Moyenne g 0,0352 Ecart type 0,0033 Intervalle de confiance à 95% 0,0053 Théorique 40mg La valeur expérimentale est un peu en dessous de la valeur théorique. Mais l intervalle de confiance et l écart type sont bas. Nos résultats sont convenables. Méthode des additions connus (étalonnage interne): Delta Absorption Echantillon 3 a = ± b = ± Echantillon a = ± b = ± 5.4e-005 Echantillon 2 a = ± b = ± 7.e Volume pyridoxyne ajouté ml Grâce aux absorbance on a pu tracer la droite d étalonnage interne. On a déterminé le volume V correspondant à une absorbance de 0. Puis, en prenant en compte les dilutions, nous avons pu calculer la masse de pyridoxine dans la tablette. Page

12 Volume L Mole Masse g Echantillon 5,32E-07,90E-04 3,90E-02 Echantillon2 5,26E-07,88E-04 3,86E-02 Echantillon3 2,99E-07,07E-04 2,9E-02 Il y a eu probablement un problème avec le dernier échantillon car la courbe n est pas linéaire (grande erreur). Donc nous avons fait la moyenne sur les deux premières mesures, on trouve 38.8mg. Moyenne g 3,88E-02 Ecart type 0, Intervalle de confianc e 0, La valeur théorique est plus proche de 38.8 mg que 35mg, on en déduit que l étalonnage interne est plus précis. De plus l intervalle et l écart type sont plus petits pour l étalonnage interne. Conclusion Dans cette expérience nous avons pu déterminer le pk de la pyridoxine selon différentes méthodes. La première méthode consiste à déterminer les concentrations de la forme acide et celles de la forme neutre en partant de la loi de Lambeer-Beer. Ceci est très pratique et permet d'accéder à la concentration de l'inconnue avec très peu de calculs. La deuxième méthode consiste à tracer un graphique de l absorbance en fonction du pour les deux longueurs d ondes maximale et minimale. Ceci est moins Page 2

13 évidente à première vue, il faut se méfier des volumes ajoutés car une petite erreur sur ces derniers se répercute directement sur les résultats. Par la suite la concentration de la pyridoxine a été déterminée par une droite de calibration externe puis interne (méthode des additions connus). Ce travail pratique nous a donc montré quelques intérêts de l'absorption UV Visible et les modes d utilisations de cette méthode. Annexes [] M. Borkovec. Lab journal of analytical chemistry II : Spectrophotométrie d'absorption moléculaire. Etude et dosage de la vitamine B6, 2008 Page 3

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