Les LDL petites et denses : une nouvelle dimension dans l évaluation du risque cardiovasculaire

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1 L. Lagrost 6/02/03 16:40 Page 106 Les LDL petites et denses : une nouvelle dimension dans l évaluation du risque cardiovasculaire L. Lagrost*, M.J. Chapman** P O I N T S F O R T S Chez l homme, les lipoprotéines de basse densité (LDL) représentent la principale voie de transport du cholestérol, qui est essentiellement présent sous sa forme estérifiée dans l espace intravasculaire. L augmentation de la concentration des particules LDL dans le plasma, associée à une élévation du risque cardiovasculaire, peut être liée soit à un défaut de leur catabolisme par la voie des récepteurs ApoB/E, soit à une surproduction hépatique de leurs précurseurs (les lipoprotéines de très basse densité [VLDL]). En fait, les LDL constituent un ensemble hétérogène de particules qui varient dans leur densité, leur taille et leur composition. Des anomalies qualitatives dans la distribution des LDL plasmatiques pourraient être en fait plus prédictives du risque cardiovasculaire que ne le sont les paramètres classiquement mesurés tels que le cholestérol LDL ou l apolipoprotéine B. En d autres termes, la détermination de l hétérogénéité des LDL, et en particulier la quantification des LDL petites et denses, semblent constituer une approche prometteuse dans l évaluation du risque cardiovasculaire. Le présent dossier fait le point sur les avancées les plus récentes dans le domaine de la structure des LDL, de leur dynamique, et de leur rôle dans l athérogenèse. Détermination de l hétérogénéité structurale des LDL Tout comme les autres classes de lipoprotéines, les particules LDL peuvent être analysées selon divers critères physiques, chimiques et immunologiques en utilisant différents procédés. Ainsi, les LDL peuvent être fractionnées selon leur densité hydratée * INSERM U498, hôpital du Bocage, Dijon. ** INSERM U321, hôpital de la Pitié- Salpêtrière, Paris. en utilisant l ultracentrifugation, leur charge électrostatique en utilisant l électrophorèse sur gel d agarose, leur contenu en apolipoprotéines en utilisant l immunoprécipitation ou la chromatographie d immunoaffinité, ou leur taille en utilisant l électrophorèse sur gel de polyacrylamide en gradient ou la chromatographie de filtration sur gel. Au cours des dernières années, essentiellement deux méthodes complémentaires ont été utilisées pour étudier l hétérogénéité des LDL : l ultracentrifugation en gradient de densité et l électrophorèse sur gel de polyacrylamide en gradient en conditions nondénaturantes. L ultracentrifugation en gradient de densité, à l échelle analytique ou préparative, présente l avantage de permettre un fractionnement reproductible des LDL plasmatiques en plusieurs sous-populations, à partir desquelles on peut ensuite conduire des analyses physiques, chimiques ou fonctionnelles. Cependant, cette technique n est pas accessible à l ensemble des laboratoires et nécessite l utilisation d un matériel spécifique et coûteux. L électrophorèse sur gel de polyacrylamide en gradient, quant à elle, permet une analyse fine et reproductible des souspopulations de particules LDL à partir d un échantillon plasmatique de faible volume. Cependant, contrairement à l ultracentrifugation en gradient de densité, l électrophorèse sur gel de polyacrylamide en gradient est essentiellement analytique, et elle ne permet que très difficilement d aborder des études fonctionnelles à partir de chacune des sous-populations LDL identifiées. Cette dernière approche requiert, en outre, l utilisation de gels parfaitement reproductibles et hautement résolutifs, délicats à obtenir. Fractionnement des LDL par ultracentrifugation en gradient de densité Les méthodes proposées pour la séparation préparative du spectre de particules LDL distribuées entre les limites de densité de 1,019 et 1,063 g/ml (S f 0-12) sont, pour la plupart, basées sur l ultracentrifugation en gradient de densité (1-3). Dans les méthodes de type isopycnique, les différentes fractions lipoprotéiniques s immobilisent lorsque la densité de la solution saline correspond à leur propre densité hydratée (1, 3). La densité hydratée de chaque particule reflète directement les proportions de lipides et de protéines qu elle contient, puisque la densité de ces deux types de composés est respectivement d environ 0,90 g/ml et de 1,35 g/ml. Dans le cas du spectre des particules LDL, la proportion des lipides varie de 70 à 79 % du poids total, et le contenu apolipoprotéinique de 21 à 30 % (3) ; pourtant, chaque espèce de particule LDL ne contient qu une seule copie d ApoB100 (3). Pour obtenir une séparation des souspopulations de LDL, l échantillon (plasma 106

2 L. Lagrost 6/02/03 16:40 Page 107 ou LDL totales préalablement isolées) est soumis à ultracentrifugation dans un gradient de densité discontinu, c est-à-dire constitué de plusieurs couches distinctes de solutions salines de densités différentes (1-3). Lors de l ultracentrifugation, un profil de densité de forme curvilinéaire est créé (1, 3). Les avantages d une telle approche sont multiples. En effet, ce type de méthodologie, hautement reproductible, permet une résolution fine entre particules dont les densités hydratées sont peu différentes (par exemple 0,002 g/ml) (3), et il peut éliminer une éventuelle contamination par des protéines plasmatiques (1,3). De plus, l isolement en gradient de densité permet de concentrer plusieurs fois chaque fraction lipoprotéinique (1, 3). Enfin, les effets dénaturants dus au contact avec les parois des tubes lors de la séparation sont minimisés par l utilisation d un rotor de centrifugation en titane à godet mobile. Dans l ensemble, les méthodes d ultracentrifugation en gradient de densité sont nettement supérieures à celles de type séquentiel, aussi bien en ce qui concerne le fractionnement des LDL que d autres classes de lipoprotéines, telles que les HDL (1). Le fractionnement des LDL à partir d une fraction de LDL totales préalablement isolées (3) permet d obtenir une résolution nettement supérieure entre les souspopulations, avec un moindre degré de chevauchement entre fractions voisines. Dans tous les cas (plasma ou LDL totales), l échantillon à analyser, d un volume minimum de 0,5 ml, est déposé au sein d un gradient de densité constitué de plusieurs couches (jusqu à 6 ou 7) de solutions de KBr et/ou de NaCl. La densité de telles solutions doit être précalibrée et ajustée avec précision (jusqu à la 4 e décimale) à la même température que celle de la centrifugation ellemême. Dans ce cas, il est possible d éviter les effets dus à l expansivité thermique différentielle des lipoprotéines par rapport aux solutions salines (4). La reproductibilité de la construction des gradients de densité peut être assurée par l utilisation d un appareil de type Densiflow (Buchler/Searle) (1, 3) qui évite toute perturbation mécanique grâce à une sonde mobile qui se positionne de façon dynamique à la surface du ménisque du tube d ultracentrifugation. À l issue de l ultracentrifugation, les diverses fractions du gradient peuvent être prélevées soit par aspiration manuelle, soit avec l aide d un appareil de fractionnement. Bien que divers systèmes soient mentionnés dans la littérature, le principe de déplacement ascendant par une solution synthétique de densité élevée est le plus souvent retenu (1-4). Cette dernière méthode a notamment l avantage d éviter des contaminations éventuelles avec les protéines sériques localisées dans le fond du tube. Au cours du fractionnement, le contenu protéique des fractions éluées peut être suivi en continu à 280 nm lors du passage à travers un détecteur couplé à un collecteur de fractions (3). Un profil de distribution typique est présenté en figure 1. Le procédé de haute résolution de fractionnement du spectre de particules LDL peut fournir une quinzaine de sous-populations LDL distinctes qui présentent des propriétés physicochimiques spécifiques (tableau I, p. 108) (5). Dans ce dernier cas, la population des LDL petites et denses se distribue entre les fractions 10 et 14 correspondant à un intervalle de densité allant de 1,041 à 1,066 g/ml (3, 5). Dans la mesure où cette technique permet le fractionnement d une quantité de LDL élevée (~ 15 mg de protéines LDL par tube), des études d activité biologique peuvent ensuite être effectuées. Masse de LDL (%) Sous-fraction LDL (n ) En pratique, et dans le cadre d un laboratoire de biologie clinique, une technologie très résolutive de séparation de particules LDL est peu adaptée à l évaluation simple du taux des LDL denses. Dans ce cas, il semble plus approprié de mettre en œuvre une technique plus simple de gradient de densité isopycnique ou non-isopycnique, basée de préférence sur des échantillons de plasma de faible volume (< 3,5 ml). Une telle méthodologie permet la séparation de l ensemble des particules LDL en trois, quatre ou cinq sous-populations (1, 2). À l heure actuelle, il est généralement accepté que le profil des LDL peut se réduire essentiellement à trois sous-classes majeures : les LDL légères (d. = 1,020-1,030 g/ml), les LDL intermédiaires (d. = 1,030-1,040 g/ml) et les LDL denses (d. = 1,040-1,063 g/ml) (2, 5-7). La distribution de la masse des sous-fractions, isolées en fonction de leur densité, peut être estimée par l absorption à 280 nm (2), ou quantifiée de façon directe et précise par analyse chimique des composants lipidiques et protéiniques (1). Typiquement, chez les sujets normolipidémiques, la masse des LDL denses représente environ 30 à 40 % des LDL totales ( mg/dl), la distribution Absorbance 280 nm Figure 1. Distribution chez un sujet normolipidémique des sous-fractions de LDL obtenues par ultracentrifugation en gradient de densité. L abondance relative de chaque sous-fraction est exprimée en pourcentage de la masse totale déposée sur le gradient de densité. L insert montre le profil d absorbance à 280 nm du même échantillon obtenu lors d un fractionnement automatique en continu Élution 107

3 L. Lagrost 6/02/03 16:40 Page 108 Tableau I. Mobilité électrophorétique et diamètre moyen des LDL totales et des sous-fractions LDL obtenues par gradient de densité à partir de plasmas de sujets normolipidémiques. Fraction Densité a Diamètre b Mobilité n électrophorétique c (g/ml) (A) (-µm s -1 cm V -1 ) 3 1, ± 2 0,55 ± 0,02 4 1, ± 6 0,52 ± 0,03 5 1, ± 2 0,49 ± 0,03 6 1, ± 3 0,43 ± 0,03 7 1, ± 2 0,31 ± 0,07 8 1, ± 2 0,30 ± 0,05 9 1, ± 2 0,36 ± 0, , ± 2 0,39 ± 0, , ± 2 0,44 ± 0, , ± 3 0,42 ± 0, , ± 6 0,44 ± 0, , ± 3 0,45 ± 0,04 LDL 1,024-1, ± 5 0,31 ± 0,04 a. Valeurs publiées dans la référence (3). b. Les diamètres moyens ont été déterminés dans les gels de polyacrylamide (gradient de 2 à 16 %) (3). c. Mobilité électrophorétique mesurée à ph 8,6 (5). Masse des LDL Densité Type A 1,040 Figure 2. Représentation schématique des profils de LDL obtenus par ultracentrifugation en gradient de densité. Le type A est caractérisé par la prédominance de LDL légères et le type B par la prédominance de LDL denses. Le point de séparation entre les LDL légères et les LDL denses se situe approximativement à la densité 1,040 g/ml. des LDL est quasi-symétrique, et les LDL intermédiaires prédominent ( mg/dl) (figure 2) (1-3). Cette distribution se distingue nettement de celle qui caractérise les patients présentant une hyperlipidémie combinée ( mixte ) ou une hypertriglycéridémie, chez qui les LDL denses dominent de manière caractéristique (7, 8). À noter que, Type non-a, non-b Type B LDL légères LDL intermédiaires LDL denses 1,019 1,03 1,04 1,06 chez les patients hypercholestérolémiques, des taux élevés de LDL denses sont également fréquemment retrouvés, en association avec une élévation des LDL légères et intermédiaires (9). Austin et Krauss (10) ont proposé que les distributions de LDL dominées par la sous-classe dense soient définies en tant que phénotype B et ceci indépendamment du taux absolu des LDL (voir figure 2 et paragraphe ci-dessous). L utilisation de l ultracentrifugation en gradient de densité constitue donc un outil très performant pour l évaluation précise du taux des LDL denses. Ce dernier paramètre peut aider de façon significative le clinicien dans son évaluation du risque cardiovasculaire et dans sa décision thérapeutique (voir article de Giral et coll., p. 112). Séparation des LDL par électrophorèse sur gel de polyacrylamide en gradient L ensemble des lipoprotéines plasmatiques, et en particulier les LDL, peut être séparé selon un critère de taille après migration électrophorétique dans un gel de polyacrylamide en gradient. L échantillon à analyser est appliqué à la surface d un gel vertical, dont la concentration croissante en polyacrylamide permet de créer un réseau dont le maillage est de plus en plus serré. Lors de la migration électrophorétique, les particules lipoprotéiniques de grande taille sont bloquées très tôt, tandis que les particules de plus faible diamètre pénètrent plus avant dans le gel. Il en résulte que la distance de migration de chacune des sous-populations lipoprotéiniques est inversement proportionnelle à son diamètre apparent. La séparation électrophorétique permet donc : d identifier les diverses sous-populations lipoprotéiniques en présence ; de déterminer leur quantité relative ; de calculer leur diamètre moyen par comparaison avec un mélange calibrateur qui migre dans un puits adjacent. En bref, une des approches adaptée à l étude de la distribution en taille des lipoprotéines plasmatiques consiste à séparer la fraction plasmatique de densité inférieure à 1,21 g/ml sur un gel de polyacrylamide en gradient 1,5-25,0 % qui présente l avantage de permettre l analyse simultanée des souspopulations LDL et HDL en une seule étape. À l issue de la migration électrophorétique, les lipoprotéines sont révélées par le bleu de Coomassie qui se fixe sur la fraction protéinique. Dans le cas des LDL, l analyse d image permet de déterminer le diamètre apparent de chacune des sous-populations lipoprotéiniques en se référant à la distance de migration de billes de latex carboxylées (38,0 nm), de la thyroglobuline (17,0 nm) et de la ferritine (12,2 nm). Cette technique permet en général de visualiser deux à trois sous-populations de LDL au sein d un même échantillon plasmatique (figure 3). Très schématiquement, il est possible de faire la distinction entre deux types de profils selon que la sous-population LDL majoritaire présente un diamètre supérieur ou égal à 25,5 nm (profil A) ou inférieur à cette valeur (profil B) (10). Il faut noter également que, dans le profil de type A, la population LDL majoritaire de grande taille est généralement associée à une ou plusieurs sous-populations minoritaires de plus faible diamètre, alors qu à l inverse, dans le profil de type B, la population LDL majoritaire de petite taille est associée à une ou plusieurs sous-populations de plus grand diamètre (figure 3). Cette subdivision présente un intérêt potentiel en pratique clinique, puisque le profil LDL de type B est associé à un risque trois fois plus élevé d infarctus du myocarde que le profil LDL de type A, et cela indépendamment de la concentration totale en LDL (11). Mécanismes moléculaires de formation des LDL petites et denses Chaque particule LDL est constituée d une molécule d apolipoprotéine B100 à laquelle 108

4 L. Lagrost 6/02/03 16:40 Page 109 Absorbance (633 nm) Profil A 26,0 24,3 Profil B 23,6 24,7 26,0 LDL grandes et légères Transferts de lipides neutres CETP Lipoprotéines riches en triglycérides (VLDL) Hydrolyse des triglycérides LDL DG petites et denses MG AGNE Figure 4. Mécanismes moléculaires de formation des LDL petites et denses. AGNE : acides gras non estérifiés ; CETP : cholesteryl ester transfer protein ; DG : diglycérides ; : esters de cholestérol ; HL : lipase hépatique ; LDL : lipoprotéines de basse densité ; MG : monoglycérides ; : triglycérides ; VLDL : lipoprotéines de très basse densité. HL Diamètre des particules (nm) Figure 3. Profils de distribution des LDL plasmatiques obtenues après migration électrophorétique sur gel polyacrylamide en gradient. Profil A : femme ; 41 ans ; cholestérol total : 2,06 g/l ; triglycérides : 0,50 g/l ; cholestérol HDL : 0,63 g/l. Profil B : homme ; 22 ans ; cholestérol total : 1,79 g/l ; triglycérides : 1,34 g/l ; cholestérol HDL : 0,39 g/l. sont associés des lipides de surface (cholestérol non-estérifié et phospholipides) et des lipides du cœur (esters de cholestérol et triglycérides). Certaines sous-fractions LDL contiennent également des apolipoprotéines mineures telles que l ApoAI et l ApoE. À noter enfin que les LDL transportent également des composés antioxydants lipophiles (ubiquinol, α-tocophérol, β-carotène...). In vivo, les LDL sont produites à partir des lipoprotéines de très basse densité (VLDL) qui subissent l action des lipases endothéliales (lipoprotéine lipase [LPL] ; lipase hépatique [HL]), qui vont progressivement réduire le cœur lipidique hydrophobe des particules, permettant ainsi la transformation des VLDL en lipoprotéines de densité intermédiaire (IDL), puis en LDL. Des études récentes ont démontré que l hétérogénéité des LDL est directement liée à la structure et au métabolisme des VLDL (8). Ainsi, les VLDL 1, de grande taille, les plus riches en triglycérides, pourraient conduire au bout de la cascade de délipidation à des LDL petites et denses, tandis que les VLDL 2, de plus petite taille, permettraient plutôt l émergence de LDL plus grandes et plus légères (8). En ce qui concerne les lipides neutres du cœur, il existe une différence fondamentale, d un point de vue métabolique, entre les esters de cholestérol et les triglycérides. En effet, alors que les esters de cholestérol sont non-hydrolysables dans le compartiment intravasculaire, les triglycérides peuvent, eux, subir l action des lipases endothéliales (principalement la HL en ce qui concerne les IDL et les LDL). L hydrolyse des triglycérides s accompagne de la formation de diglycérides, monoglycérides et acides gras non-estérifiés qui quittent rapidement l édifice lipoprotéinique, conduisant ainsi à la réduction du cœur hydrophobe, et donc de la taille, des particules. Ainsi, comme cela a pu être démontré pour les HDL, l action combinée de la protéine de transfert des esters de cholestérol (CETP) (qui procède au remplacement des esters de cholestérol des LDL par des triglycérides en provenance des VLDL) et de la HL (qui catalyse l hydrolyse des triglycérides des LDL) conduit progressivement à l appauvrissement du cœur hydrophobe des LDL et à l émergence de particules LDL petites et denses (figure 4). L implication du cycle enrichissement/hydrolyse des triglycérides dans la formation de LDL petites et denses a pu être démontré in vitro (12). De plus, des études cinétiques ont permis de construire un modèle selon lequel la formation des LDL petites et denses est effectivement fonction : du taux de transfert des molécules de triglycérides dans les LDL (elles-mêmes dépendantes de la présence de CETP et de la concentration des lipoprotéines riches en triglycérides) ; du taux d hydrolyse des triglycérides par la HL (7, 8). En fait, il apparaît que l équilibre relatif des substrats lipoprotéiniques donneurs ou accepteurs de lipides neutres dans la réaction de transfert catalysée par la CETP, en particulier la quantité de lipoprotéines riches en triglycérides, est un déterminant majeur de l apparition des LDL petites et denses (7). Ainsi, chez l homme, une relation directe entre la concentration plasmatique des lipoprotéines riches en triglycérides et le taux de LDL petites et denses apparaît dès que les concentrations plasmatiques en triglycérides sont supérieures à 1,5 mmol/l (13). Propriétés métaboliques et athérogénicité des LDL petites et denses Le nombre de molécules d esters de cholestérol décroît progressivement, tandis que celui des triglycérides augmente le long du 109

5 L. Lagrost 6/02/03 16:40 Page 110 spectre des LDL plasmatiques lorsque l on passe des particules les plus légères aux particules les plus denses (3). Ces changements de composition du cœur et de la taille des LDL s accompagnent de changements conformationnels de l ApoB. Cependant, il est à noter que le déterminant principal de la structure de l ApoB des LDL fait encore l objet de controverses, et les changements conformationnels de l ApoB pourraient être liés, selon les auteurs, soit directement à la taille des particules (14), soit plutôt à leur contenu en triglycérides (15, 16). Il reste néanmoins que les changements de composition et de structure des LDL sont susceptibles d affecter significativement la conformation de l ApoB des LDL et, dans un deuxième temps, leur capacité à se lier à leur récepteur cellulaire. Ainsi, la faculté des LDL de densité intermédiaire à se lier à leur récepteur cellulaire et à être dégradées est significativement supérieure à ce qui est observé avec les LDL de plus grande ou de plus petite taille (6). Les études les plus récentes ont en fait démontré que la conformation de l ApoB dans les LDL de densité intermédiaire est associée à une charge électrostatique optimale des particules, leur conférant ainsi une affinité élevée pour leur récepteur cellulaire (5) (tableau II). En plus de la prolongation de leur temps de résidence dans le plasma, les LDL petites et denses Tableau II. Caractéristiques principales de la liaison au récepteur LDL des sous-fractions de LDL isolées par gradient de densité. Fraction K d G liaison n (nm) a (-) (Kcal/mol) b 5 8,35 ± 0,40 10,20 ± 0,03 6 5,71 ± 0,20 10,41 ± 0,06 7 5,24 ± 0,60 10,46 ± 0,06 8 4,57 ± 0,50 10,52 ± 0,06 9 7,20 ± 0,70 10,29 ± 0, ,87 ± 0,03 10,31 ± 0,01 a. Constantes de dissociation à l équilibre (K d ) de chaque sous-fraction de LDL. b. Les énergies libres de liaison ont été calculées à partir des valeurs de K d (5). sont plus oxydables (17), ce qui contribue encore à une plus forte athérogénicité de ces lipoprotéines par rapport à leurs homologues de diamètre plus élevé. Enfin, par rapport aux LDL de grande taille, les LDL petites et denses sont susceptibles de pénétrer plus aisément dans l espace sous-endothélial où elles peuvent interagir avec une plus haute affinité avec les protéoglycanes matricielles de la paroi artérielle (7, 8, 17). Conclusion Il est apparu, au cours de la dernière décennie, que les LDL petites et denses constituent un déterminant important de l athérogénicité des dyslipidémies. L augmentation de la concentration et de l oxydabilité des lipoprotéines contenant l apolipoprotéine B (VLDL et LDL), en particulier des LDL petites et denses, peut, dans certains cas, être normalisée par des traitements hypolipémiants impliquant des statines ou des fibrates. La mise en place de protocoles cliniques intégrant la détermination de la taille et de la densité des souspopulations LDL devrait conduire, dans un avenir proche, à une approche thérapeutique plus ciblée et plus efficace. Références 1. Chapman M.J., Goldstein S., Lagrange D., Laplaud P.M. A density gradient ultracentrifugation procedure for the isolation of the major lipoprotein classes from human serum. J Lipid Res 1981 ; 22 : Griffin B.A., Caslake M.J., Yip B., Tait G.W., Packard C.J., Shepherd J. Rapid isolation of low density lipoprotein (LDL) subfractions from plasma by density gradient ultracentrifugation. 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