V- Purification des Protéines

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1 V- Purification des Protéines = séparation des autres constituants de la cellule Protéine assez enrichie pour que tout contaminant puisse être tenu comme valeur négligeable : «raisonnement pure» Plusieurs étapes pour éliminer les différents constituants

2 Source : -naturelle : fraction infime de la totalité des protéines - tissu : broyage + collagénase (élimination produit insoluble) - cellule en culture : + facile à traiter: protéine surexprimée * bactéries * cellules de mammifères * levures * champignons * plantes transgéniques * animaux transgéniques * virus

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4 V.1: Extraction

5 Tampon (protection contre la dénaturation de la protéine) Bis-TRIS ph = 6,46 PIPES ph = 6,76 MOPS ph = 7,20 TES ph = 7,40 HEPES ph = 7,48 Tris ph = 8,06 Glycine ph = 9,78

6 Techniques d extraction Broyage par force de frottements : mortier/pillon, presse de French, sonication Choc thermique Choc osmotique Méthodes chimiques Méthodes enzymatiques

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12 V.2 : Séparation et enrichissement

13 * Séparation différentielle au sulfate d ammonium: (SO 4 NO 3 ) Séparation en fonction de la solubilité différentielle des protéines avec la force ionique de la solution qui les con tient

14 * Précipitation différentielle par variation du ph

15 * Dialyse: changement de la concentration en sels de la solution de protéines

16 * Filtration sur membrane

17 *Sédimentation Dépend de la taille, forme, densité de la protéine

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19 La chromatographie d'échange d'ions

20 Choix du type d'échangeur d'ions en fonction du pi de la protéine à séparer et du ph du tampon Considérons une protéine de pi = 5. 1er cas : si le ph du tampon utilisé pour la chromatographie est inférieur au pi de la protéine (zone bleue), celle-ci est chargée positivement. Il faut utiliser un échangeur de cations. 2ème cas : si le ph du tampon utilisé pour la chromatographie est supérieur au pi de la protéine (zone rouge), celle-ci est chargée négativement. Il faut utiliser un échangeur d'anions.

21 Fixation au gel Dans un premier temps, la résine est équilibrée dans un tampon dont le ph est tel que le groupement porté par l'échangeur d'ions soit ionisé : dans le cas d'une base (échangeur d'anions), le ph doit être inférieur au pk a du groupement ionisable (exemple : le pk a du groupement diéthylaminoéthylammonium est 9,5) dans le cas d'un acide (échangeur de cations), le ph doit être supérieur au pk a du groupement ionisable (exemple : le pk a du groupement carboxyméthyl est 4) Les molécules à séparer sont dans le même tampon (donc au même ph) et en fonction de leur point isoélectrique ou pi, elle porte une charge nette : négative : le pi de l'albumine de sérum bovin est 4,9, cette protéine est chargée négativement à ph 7 nulle positive : le pi du cytochrome c est 10,7, cette protéine est chargée positivement à ph 7

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23 Chromatographie d'exclusion ou filtration sur gel

24 chromatographie d'exclusion = filtration sur gel ou tamisage moléculaire ou chromatographie de perméation. Séparation en fonction de la taille La phase stationnaire est constituée de billes de polysaccharides (du type "Sephadex " ou du type "Sepharose " qui est de l'agarose) gonflées dans le solvant utilisé pour l'élution :

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26 Le type de gel est choisi en fonction du domaine de fractionnement dans lequel se trouvent les molécules à séparer. Source : Gels pour chromatographie de filtration sur gel, Pharmacia

27 Vt = volume total Vo = volume mort Ve = volume d élution

28 A partir du profil d'élution des standards, on trace la droite étalon : V e / V 0 = f log (masse molaire). Dans les mêmes conditions de chromatographie que pour le mélange des standards, on détermine le volume d'élution d'une molécule inconnue. On reporte la valeur du rapport V e / V 0 de la molécule inconnue sur la droite étalon et ainsi on détermine sa masse molaire.

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30 Applications de la chromatographie d'exclusion : - séparation ou l'élimination de sels ou de petites molécules dans les solutions protéiques : DESSALAGE, ECHANGE de TAMPONS... - FRACTIONNEMENT de MELANGES de MACROMOLECULES et à la DETERMINATION (approximative) de la MASSE MOLAIRE des protéines.

31 CHROMATOGRAPHIE SUR COUCHES MINCES (CCM) Les supports utilisés sont variés : silice, cellulose, support imprégné ou greffé (phase inverse) échangeurs d'ions, micro-supports (HPTLC)

32 L'analyse est qualitative ou quantitative. Dans le cas de solutés incolores, il est nécessaire de visualiser les spots par une réaction colorée (qui peut être générale ou spécifique) ou par fluorescence; c'est la révélation. L'identification des constituants du mélange se fait par comparaison avec des témoins, en calculant le Rf (rapport au front) de chaque soluté, ou encore le Rt (rapport à un témoin) lorsque le solvant a dépassé le niveau supérieur de la plaque. Résultats obtenus après développement et révélation Calcul du rapport au front (R f ou "réference front")

33 Techniques électrophorétiques L'électrophorèse permet la séparation de molécules chargées dans un champ électrique: protéines, peptides, acides aminés, acides nucléiques et nucléotides.

34 Séparation des protéines sériques sur acétate de cellulose La révélation des fractions peut être globale (rouge Ponceau, Amido-schwartz, vert de lissamine, bleu de Coomassie) ou spécifique (révélation des lipoprotéines avec un colorant des lipides, révélation d'une activité enzymatique...). La lecture peut se faire à l'oeil nu (analyse qualitative) ou par densitométrie (enregistrement de l'absorbance en fonction de la distance de migration) ; dans ce cas, l'intégration des pics permet une analyse quantitative des fractions; ou encore le dosage peut être effectué après élution des fractions. Tracé densitométrique du protéinogramme d'un sérum humain normal

35 Electrophorèse en gel de polyacrylamide (PAGE) La polyacrylamide est un gel finement réticulé, que l'on fabrique au moment de l'emploi en mélangeant de l'acrylamide (CH 2 =CH-CO-NH 2 ), qui polymérise en donnant des chaînes linéaires, et du bis-acrylamide (CH 2 =CH-CO-NH-CO-CH=CH 2 ) qui forme des ponts entre les chaînes; on obtient ainsi un réseau, dont les mailles sont de taille variable en fonction des proportions d'acrylamide et de bis-acrylamide utilisées; le gel obtenu se comporte donc comme un tamis moléculaire (les macromolécules migrent d'autant moins vite qu'elles sont plus grosses).

36 En présence de Sodium dodécylsulfate (SDS), détergent anionique qui défait la structure spatiale et se fixe sur les protéines, toutes les molécules sont chargées de la même façon, et la séparation est alors uniquement fonction de la masse molaire : (SDS : CH 3 - (CH 2 ) 10 - CH 2 - O - SO 3-, Na + ), N.B : pour dénaturer les protéines, on utilise à la fois un détergent comme le SDS et un agent réducteur qui coupera les ponts disulfure, comme le b- mercaptoéthanol.

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38 Electrophorèse bidimensionnelle On sépare selon le phi dans une dimension (IEF) et selon la masse molaire dans l'autre dimension (PAGE-SDS); on sépare ainsi environ 1000 protéines dans le sérum! On peut établir de cette manière la "carte d'identité protéique" des principaux tissus et organes humains. La lecture nécessite alors un système informatisé d'analyse d'images.

39 V.3: Dosages et suivi de purification

40 Savoir à chaque étape où est la protéine : Vérification de la présence et de l activité de la protéine Dosage : - Méthode au UV à 280 nm - Méthode colorimétrique : Bradford, Folin lowry, Biuret Mesure activité enzymatique

41 Expressions de l'activité enzymatique Unité officielle: katal (kat), quantité d'enzyme qui catalyse la transformation de 1 mole de substrat par seconde. L activité enzymatique (A) en "unité internationale" (IU, International Unit) : quantité d'enzyme qui catalyse la transformation de 1 µmole de substrat par minute. 60 IU valent donc 1 µkat L'activité molaire est le nombre de moles de substrat transformé par mole d'enzyme par minute. L'activité spécifique (AS) de l enzyme, protéine. elle est donnée en IU/mg

42 Rendement = Activité au stade i Activité au stade initial X 100 Facteur de purification (enrichissement) = AS au stade i AS au stade initial

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