Optique & Microscopie. microscopie en lumière directe. 3 - Microscopie en lumière blanche & par fluorescence. Spectroscopie

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1 Optique & Microscopie 3 - Microscopie en lumière blanche & par fluorescence Spectroscopie microscopie en lumière directe 1

2 Trajet optique d illumination & de détection - illumination de Köhler un myocyte illumination de Köhler Réglage optimal de lampe + collecteur diaphragmes condenseur objectif oculaires 5 µm Principe: eclairage rasant Fond clair vs fond noir visualisation des bords 2

3 Contraste de phase image d'un objet microscopique transparent = image directe issue des parties uniformes de l'objet + diffraction due aux irrégularités. Contraste de phase illumination ordinaire contraste de phase Zernike a donc eu l'idée de produire artificiellement un décalage de phase entre ces deux images en apportant grâce à une lame de phase une avance de la phase de la première image qui se transforme en image d'amplitude. Il faut un diaphragme annulaire sous le condenseur dont l'image se superpose exactement à un deuxième situé dans la partie arrière de l'objectif. Contraste Interférentiel Différentiel lampe polariseur Wollaston condenseur échantillon objectif Wollaston analyseur image Le prisme de Wollaston sépare les polarisations perpendiculaires et parallèles. Lorsqu elles sont recombinées par l analyseur, elles donnent une lumière grise si le trajet optique a été le même, et blanche ou noir s il a été différent, donnant l illusion d un éclairage rasant. 3) recombine 2) add an additional phase shift 1) split into perpendicular components DIC contrast Contraste de Normaski Differential Interference Contrast Informations sur l objectif Illumination ordinaire DIC 3

4 Microcopie à fluorescence Filtres de fluorescence Imagerie par fluorescence marquage spécifique Marquage spécifique avec plusieurs couleurs canal rouge canal vert image fusionnée (+bleu) Image 3 couleurs : -Bactéries GFP en vert -Actine en rouge -Golgi en bleu Colocalisation??? 4

5 Image 3 couleurs : Microscopie en fluorescence : Bactéries GFP en vert Actine en rouge Golgi en bleu fluorochrome FITC 490 nm 520 nm Longueur d onde Intensité fluorescnece Le fluorochrome Trajet de la lumière dans le microscope : Choix du Fluorochrome Ex: FITC bleaches beaucoup plus rapidement que d autres fluorochromes comme Alexa 488. Observateur Lampe blanche Echantillon La longueur d onde d excitation n affecte pas le spectre d émission mais uniquement l intensité de l émission de fluorescence. L intensité de l émission correspond à l amplitude du spectre d absorption. Cube observation Lampe fluorescente Sources de lumière pour la fluorescence : Cube simple pour la fluorescence : Rhodamine HBO 50 W (lampe arc à vapeur de mercure) Cube simple LongPass 5

6 Cube double pour la fluorescence : FITC/TxRed TxRed Protéines autofluorescentes Cube double GFP Ala 72 Structure et photophysique de la eyfp N-terminal Leu 68 Tyr 203 C-terminal fluorophore: Gly65,Tyr66, Gly acides amines λ abs,max = 514 nm λ em,max = 527 nm extinction (cm -1 M -1 ) 8 ecfp egfp eyfp 6 DsRed flavin x Spectres de protéines autofluorescentes fluorescence x QE (ebfp) ecfp egfp eyfp DsRed flavin wavelength (nm) 11 feuillets β organises en tonneau une helice α centrale 4 nm wavelength (nm) eyfp Transfection noyau membrane plasmique cytoplasme Imagerie par fluorescence sondes environnementales plasmide: brin d ADN circulaire mélange & incubation AND enrobe de lipides protéine eyfp produite agent de transfection ex: lipides spéciaux (poly-cations) Signal dépendant de l environnement local: potentiel, ph, [Ca] 6

7 Autres microscopies Microscope Fluorescent Arc Lamp Excitation Diaphragm Excitation Filter Ocular Microscope Confocal Laser Excitation Pinhole Excitation Filter PMT Confocal, électronique ( ) Objective Emission Filter Objective Emission Filter Emission Pinhole Trajet de la lumière dans un microscope à epi- fluorescence classique : Trajet de la lumière dans un microscope confocal : Microscopie conventionnelle Emission filter Microscopie à balayage laser Emission filter Lamp HBO Excitation filter Beamsplitter (dichroic mirror) laser Monochromatic light no excitation filter necessary Beamsplitter (dichroic mirror) Sample Sample conventionnel confocal Epi-fluorescence Vs. Confocal : Coupes 3D du noyau non confocal confocal Les photons hors focus sont stoppés par le diaphragme => image plus nette 7

8 Microscopie électronique à transmission Synapse Microscopie électronique à balayage Cellule cilliée Avec V = 100 kv, λ électron = nm En théorie, résolution ~ nm 10,000 X microscope optique Mais avec les aberrations des lentilles électroniques, + difficiles a corriger Résolution exp. ~ 0.1 nm Traitement de l image amélioration Intensité Contraste Sigma Lissage Soustraction du bruit de fond quantification Seuillage Comptage Surface Colocalisation Spectroscopie: Généralités Spectroscopie ou quand la lumière rencontre les molécules... Une science qui utilise la lumière pour analyser les propriétés des atomes, des molécules et matériaux. Elle repose sur deux concepts clefs: 1. la nature et les propriétés de la lumière 2. les principes fondamentaux de la mécanique quantique et de ses applications pour décrire les atomes et molécules. Un peu d histoire L analyse spectrale qualitative et quantitative repose sur les deux propriétés suivantes: - portée à un certain niveau d énergie, la matière est capable de la libérer sous forme de radiations spécifiques; - dans des conditions données, l intensité de l émission est proportionnelle au nombre de particules émettrices. Ces deux propriétés résultent d un long travail de recherche scientifique mené par des expérimentateurs et des théoriciens. Newton montre que la lumière solaire est un "mélange" de toutes les couleurs que le prisme dévie (1666). Young ( ): l expérience des franges lumineuses d interférence permet d affirmer que la lumière est une onde. Kirchhoff et Bunsen réalisent le premier spectroscope en Maxwell ( ) étudie les ondes électromagnétiques. Sa théorie combine les propriétés électriques et magnétiques de la lumière (rayonnement électro-magnétique). Hertz ( ) reprend ces travaux et met en place un dispositif qui rend manifeste l existence des ondes électromagnétiques. Il observe également l effet photoélectrique. Einstein ( ) propose qu un faisceau de lumière consiste en paquets d énergie les grains de lumière qui ont chacun une énergie définie: E = hν. Planck, à la même époque, introduit la constante h = 6,62 x Js qui permet de modéliser la distribution des longueurs d onde émises par le rayonnement du corps noir chauffé à différentes températures. Cette constante introduit la quantification de l énergie. La notion de photon (aspect corpusculaire de la lumière) est née. Parallèlement à ces théoriciens, des expérimentateurs font progresser ce domaine de la science: Perrin ( ) met en évidence l électron Roentgen ( ) découvre les RX Michelson élabore l interféromètre à deux ondes. Rutherford ( ) montre l existence du noyau atomique Bohr propose un modèle de l atome en Balmer et Rydberg expliquent les raies du spectre d émission de l hydrogène vers De Broglie (1924) trouve une corrélation entre les deux aspects, corpusculaire et ondulatoire, de la lumière: c= λν. Le rayonnement électromagnétique 2 composantes : un champ électrique (E) et un champ magnétique (H). La composante électrique du rayonnement est un champ électrique oscillant et la composante magnétique, un champ magnétique oscillant. L aspect ondulatoire de la lumière. La lumière assimilée à une onde sinusoïdale progressive qui se propage dans l espace est définie par les grandeurs suivantes: ν: fréquence de la lumière, λ: longueur d onde de la lumière. 8

9 Principe de mesure spectroscopique Quelle que soit la transition à étudier (translation, rotation, vibration, transition électronique), le principe de mesure est toujours le même. Il s'agit de mesurer l'absorption d'un rayonnement électromagnétique incident (un photon). The Bohr condition Ε (molecule) = Ε (photon) Si l'énergie du photon incident est exactement égale à la différence d'énergie entre l'état fondamental et un des états excités, la molécule absorbe l'énergie du photon et passe à un état excité. Après un court moment (le plus souvent 10-6 à 10-9 s), la molécule excitée cède son excès d'énergie sous forme de chaleur et revient à son état fondamental. Ce phénomène de relaxation entraîne une légère augmentation de température du milieu. M + hυ M* M* M + chaleur PHOTON BEFORE DURING AFTER ENERGY Molecular Vibrations Stretching Frequencies Covalent bonds vibrate at only certain allowable frequencies. Frequency decreases with increasing atomic weight. Frequency increases with increasing bond energy. Vibrational Modes Nonlinear molecule with n atoms usually has 3n - 6 fundamental vibrational modes. Énergies relatives des transitions Il existe donc au moins 4 manières distinctes à une molécule pour stoker de l'énergie: i) translations (3 au total); ii) rotations (2 ou 3 au total) (spectroscopie micro-ondes); iii) vibrations (3N-5 ou 3N-6) (spectroscopie infra-rouge); iv) transitions électroniques (spectroscopie UV-visible). Toutes ces formes d'énergies sont quantiques, c'est-à-dire qu'il existe des niveaux d'énergie discrets (plutôt qu'un continuum d énergie tel qu'on l'observe dans le monde macroscopique). 9

10 Niveaux énergétiques Principales méthodes spectroscopiques Principe de la spectrophotométrie d absorption UV-vis Beer-Lambert Law sample concentration, C I 0 I T pathlength, l At a fixed temperature and a single wavelength the intensity of light, I T, transmitted through a sample depends upon: the pathlength or sample thickness, l the concentration of the absorbing species, C the incident light intensity, I 0 Beer Lambert Law I T = I 0 10 { ε l C} at constant T and single λ ε molar absorptivity, l pathlength, C concentration of absorbing species log(i T ) = log(i 0 ) ε l C log(i 0 /I T ) = ε l C absorbance, A = log(i 0 /I T ) (optical density, OD) A = ε l C I 0 l C I T Les méthodes spectroscopiques sont couramment utilisées pour l analyse quantitative de substances (industrie chimique, pharmacochimique, biomédicale,.). L analyse quantitative repose sur la loi de Beer-Lambert. La fraction de radiation absorbée par une substance ne dépend pas de l intensité de la radiation incidente. Chaque couche d épaisseur dx absorbe une fraction -di/i de l intensité de la radiation: di = bdx I I di l = b I dx 0 I 0 lni + Analyse quantitative b: constante l: pas optique I 0 : intensité de la lumière incidente Io ln = bl I = bl lni0 bl I = Ioe I T La transmittance (T) sera définie comme: I0 1 log 10 = A T I0 bl log10 = = A I 2, 303 A: absorbance 10

11 La concentration d une solution a un effet sur son absorbance. Elle est en théorie proportionnelle à l absorbance. ε: coefficient d extinction molaire I0 en m = A = εlc 3 mol -1 cm -1 l: pas optique log 10 I Limite à la linéarité de la loi de Beer-Lambert. La non-linéarité provient de la lumière parasite d une longueur d onde différente de λ qui arrive au détecteur et qui provoque une courbure vers les fortes absorbances. Par exemple, une lumière parasite d intensité égale à 1% de l intensité à la longueur d onde λ limite l absorbance à 2. Le spectromètre en spectroscopie optique source monochromateur solvant échantillon détecteur amplificateur IR => Fingerprint of Molecule Whole-molecule vibrations and bending vibrations are also quantitized. No two molecules will give exactly the same IR spectrum (except enantiomers). Simple stretching: cm -1. Complex vibrations: cm -1, called the fingerprint region. Les composantes de base d un spectrophotomètre. ordinateur Ex: An Alkane IR Spectrum UV Absorption of Biomolecules Proteins Protein cromophores can be conveniently divided into two classes: the peptide bond itself, and the aminoacid sidechain. Additional contributions can derive from a prosthetic group, if present. The UV spectrum of the peptide bond consists essentially of two bands: - a strong band at ~ 190 nm (ε max ~ 7000) - a weak (forbidden) band at ~ nm (ε max ~ 100) UV Absorption of Biomolecules Proteins Some of the sidechains absorb UV radiation in the same region as the peptide bond (Asp, Glu, Asn, Gln, Arg and His). More interesting are the aromatic sidechains (Trp, Phe, Tyr, His) which absorb in the region 230nm 300nm (near UV) and therefore do not overlap with the strong peptide absorption band. Tryptophan Histidine Tyrosine Phenilalanine UV Absorption of Biomolecules In the absence of prosthetic groups, an average protein has maximum absorption in the near UV at approx. 280 nm. If the extinction coefficient ε 280 of the protein is known, it is possible to derive the protein concentration from a measurement of the UV absorbance at this wavelength. Proteins Histidine Tryptophan Tyrosine 11

12 UV Absorption of Biomolecules Nucleic Acids The near UV absorption spectrum of both RNA and DNA is largely dominated by the aromatic purine and pyrimidine bases. UV Absorption of Biomolecules Nucleic Acids Despite their rather simple appearance, these four bands result from a number of different electronic transitions taking place in the four aromatic rings. Usually in a DNA or RNA fragments their spectra merge into a single band with λ max at ~260 nm so that it is not easy to separate the different contributions. Since ε 280 ~10000 on Guanine Cytidine average, accurate measurement of the UV Adenine spectra at concentrations as low as few µg ml -1 are Thymine possible. Spectroscopy - Summary Map of the energy states of a compound or molecule In principle, each spectrum is unique Spectrum is a molecular fingerprint The tool for qualitative analysis Also ideal for quantitative analysis via the Beer-Lambert Law 12