4 : MÉTHODES D ANALYSE UTILISÉES EN ÉCOLOGIE MICROBIENNE

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1 4 : MÉTHODES D ANALYSE UTILISÉES EN ÉCOLOGIE MICROBIENNE L écologie microbienne (ou étude des micro-organismes de l environnement) étudie : les relations entre les différentes populations de micro-organismes les relations entre les micro-organismes et leur environnement. Cette étude se concentre sur la biodiversité. Pour évaluer la biodiversité, il faut pouvoir identifier chaque élément qui compose une population microbienne donnée. Ce n est pas évident encore aujourd hui, car un grand nombre de bactéries de l environnement n est pas cultivable. Mais au moins, nous savons qu elles existent, ce qui n était pas le cas avant l invention du microscope. Invention du microscope On l attribue à Janssen vers 1595 (controversé). Fabricant de lentilles, il aurait inventé un appareil qui a ouvert la voie de la microscopie. Mais c est surtout un amateur passionné, Leeuwenhoek, qui a fabriqué les premiers microscopes pour examiner ses étoffes (il était drapier) (vers 1673). C étaient des instruments simples assez petits. Il n y a qu une seule lentille mais forte, ce qui donne une image nette. Il faudra attendre 150 ans pour que les microscopes composés (à plusieurs lentilles) soient aussi performants que les microscopes de Leeuwenhoek. Leeuwenhoeck Microscope de Cuff Zeiss, Jena Voigt- Hochgesang Wikipedia Les pionniers de la microbiologie Hooke vers 1700 est le premier à utiliser le mot «cellule» pour désigner des organismes ou les unités qui les composent. Mais c est Leeuwenhoeck qui fit les premières observations d organismes. C était assez incroyable pour son époque. Il avait obtenu un grossissement de 200x (une bactérie de 2 µm fait 0,4 mm! Elle doit ressembler à une fine poussière sur le fond du champ d observation). Il a observé des insectes, leurs œufs et larves, l eau des mares ou lacs, du sperme, des cellules du sang. Il a même dessiné des bactéries 1. 1 www. St2s-casteilla.net/bph/zooms/52-les permiers-microscopes.html 1

2 Antoni VanLeeuwenhoek ( ) s est opposé à la théorie de la génération spontanée qui prévalait à cette époque. Il faudra attendre presque 2 siècles pour la rejeter définitivement avec les expériences de Louis Pasteur, qui obtint en 1864 l approbation de l Académie des Sciences. Pasteur a combattu la théorie de la génération spontanée qui disait que les organismes inférieurs pouvaient naître de conditions physico-chimiques particulières. Pour lui, les microorganismes doivent naître de germes (parents). C est la naissance de la microbiologie! Pasteur eut une grande influence en médecine. Il pensait que l origine des maladies était comparable à la fermentation: elle ne pouvaient apparaître que si des germes contaminaient l organisme. Il développa avec Emile Roux le premier vaccin contre la maladie du charbon (Bacillus anthracis). C est aussi à lui que l on doit le vaccin contre la rage. Robert Koch ( ) a découvert l agent de la tuberculose: Mycobacterium tuberculosis, dit le «bacille de Koch». Il a mis au point une méthode de culture in vitro pour cette bactérie à croissance lente et assez exigeante. Il a laissé les postulats de Koch: 1) Le micro-organisme doit être présent chez les animaux malades, et absent chez ceux qui sont sains 2) Il doit être cultivé in vitro 3) Un animal sain inoculé avec cette culture doit développer la maladie (mêmes symptômes) 4) Le micro-organisme isolé de cet animal doit être semblable à celui inoculé. Aujourd hui, il faut nuancer ces affirmations : 1. Plusieurs micro-organismes peuvent causer une même maladie : par exemple, une septicémie (infection généralisée) peut être provoquée par différentes bactéries quand elles contaminent le sang 2. Certains micro-organismes pathogènes ne sont pas cultivables : par exemple, l agent de la lèpre n est pas cultivable, bien qu il s agisse d un parent du bacille de Koch. Il a besoin de sang 3. Un micro-organisme peut causer plusieurs maladies : par exemple, certaines bactéries vont provoquer des maladies différentes selon l organe contaminé 2

3 4. Un micro-organisme peut se trouver sur un porteur sain : par exemple, il y a des porteurs sains pour différentes bactéries comme les Staphylocoques multirésistants (MRSA) Néanmoins, ces pionniers de la microbiologie ont non seulement permis de voir les bactéries, mais ils ont compris le rôle qu elles pouvaient jouer comme agents pathogènes et ils ont fait progresser la médecine. Si la microbiologie médicale est née à cette époque, il faudra attendre encore longtemps pour l étude des bactéries de l environnement. Culture des micro-organismes Pour mettre en culture des micro-organismes, il faut connaître leurs besoins et les conditions environnementales dans lesquelles ils se développent. On utilise fréquemment des milieux standard, assez riches, qui permettent à différentes bactéries hétérotrophes de se développer. Mais ils ne conviennent pas aux bactéries qui n utilisent pas des substrats organiques (la majorité). Un milieu standard contient par exemple: des peptones (hydrolysat de protéines; ce sont de courtes chaînes d acides aminés) du glucose (sucre) un petit peu de NaCl (sel de cuisine) éventuellement des phosphates qui tamponnent 2 le milieu et apportent du phosphore 3 et de l eau distillée (pour éliminer tous les ions que l eau contient) Le ph est voisin de 7 (neutralité) Les micro-organismes capables de se développer dans ces conditions sont: plutôt bactériens (trop peu de sucre pour les champignons) hétérotrophes aérobies mésophiles L incubation va de 7 à 14 jours à 25 C. On estime que seulement 10% des bactéries du sol sont cultivables. En plus, nous sommes certains qu il y a un grand nombre de bactéries dont nous ne soupçonnons pas encore l existence. Culture difficile : cas des Legionelles Les Legionelles sont des bactéries, organotrophes, de l environnement ; elles contaminent volontiers les systèmes de climatisation et d eau chaude. On les inhale avec de fines gouttelettes d eau. Elles peuvent provoquer des pneumonies. Ce sont des pathogènes opportunistes. En 1976, se tient à Philadelphie un congrès des vétérans de la légion américaine. Il y a 4400 participants. A la fin du congrès plusieurs cas de pneumonie se déclarent. Bilan: 182 cas graves et 29 décès. On a mis 6 mois pour enfin isoler la bactérie des systèmes de climatisation d un des hôtels. 2 Effet tampon: il maintient le ph malgré les variations engendrées par le métabolisme bactérien. 3 Le phosphore est nécessaire pour l ADN et l ATP entre autres. 3

4 Le milieu mis au point contient des éléments inhabituels. Le charbon activé adsorbe les substances toxiques et favorise la croissance des Legionelles sur un milieu avec extraits de levures (vitamines). Le ph est de 6.9 et la température d incubation de 45 C. 3 antibiotiques sont nécessaire pour inhiber les bactéries Gram+ et la plupart des Gram-, ainsi que les levures et champignons. Cet exemple est typique des difficultés rencontrées pour isoler une espèce parmi d autres. Il suffit qu elle pousse plus lentement ou qu elle ait besoin de vitamines pour passer à côté, car la flore qui l accompagne va envahir la plaque avant qu elle ait pu se développer. Isolement d Azotobacter Cette bactérie est présente dans le sol, mais elle est en compagnie de différentes espèces. Sur un milieu standard, on ne va pas pouvoir l isoler. Isolement d Azotobacter C est une bactérie du sol. Elle fixe l azote atmosphérique. 1. Milieu sans azote: seule Azotobacter peut former des colonies. On obtient une culture pure. 3. Milieu avec azote. Ce sont les autres bactéries du sol qui poussent. Il n y a pas de colonies d Azotobacter. Culture de cyanobactéries Ces bactéries font la photosynthèse. Elles ont besoin de : lumière douce, d un milieu minéral et de CO 2. L agitation des cultures liquides assure une bonne aération et évite la formation de biofilms. 4

5 Isolement, purification Il faut réussir à isoler une espèce pour pouvoir l identifier. Les flèches désignent des colonies différentes Isolement à partir d un échantillon de terre Le cercle cible des colonies superposées Ajouter une solution saline stérile à l échantillon. Agiter vigoureusement. Laisser décanter. Étaler des aliquotes de 0,1 ml sur différents milieux. Incuber à C et observer chaque jours. Le temps d incubation est d environ 7-14j pour les organotrophes. Il peut se prolonger plusieurs semaines pour les microorganismes ayant un développement très lent. Isolement et purification d une colonie Une colonie est réétalée sur un milieu frais pour séparer les bactéries et obtenir des colonies isolées. A l origine d une colonie, une bactérie ou une chaîne de bactéries. On a isolé le micro-organisme que l on veut identifier. Identification des bactéries L identification repose en général sur des tests biochimiques qui mettent en évidence les caractéristiques métaboliques des organismes. C est une analyse indirecte du génome! Par exemple quels sucres sont utilisés par une espèce de bactéries donnée. En analyse médicale, l identification est plus simple dans la mesure où les candidats sont moins nombreux et mieux connus. De nombreux milieux spécifiques et tests ont été développés pour eux. Exemple la galerie API 20 E : Dans chaque loge se trouve un milieu spécifique. On utilise souvent des indicateurs (ph ou red/ox) qui changent de couleur selon la réaction. Les résultats sont comparés à la base de données correspondante. Dans tous les cas, il faut s appuyer sur l observation des bactéries sous le microscope et de tests biochimiques adaptés au groupe étudié. La base de données regroupe les résultats de ce type de tests pour toutes les bactéries déjà testées. Il est essentiel que la base de données soit établie avec les mêmes méthodes. On n arrive pas toujours à une identifications, car: la souche n est peut-être pas pure il y a eu des mutations et elle ne correspond plus au type standard on n a pas choisi les bons tests. 5

6 Analyse d échantillons de l environnement Ce type d analyse n est pas rentable pour l industrie, l étude des bactéries de l environnement n a que peu de moyens à disposition. Il faut inventer des techniques, des milieux adéquats. Pas de kit, pas de milieux prêts à l emploi comme pour la médicale! De plus, les micro-organismes sont parfois peu accessibles on ne sait pas toujours mettre en culture les bactéries autotrophes. Colonne de Winogradski Winogradski (1880). a mis au point des conditions de culture et un milieu de base pour recréer en éprouvette un écosystème afin de pouvoir l étudier plus facilement en laboratoire. Colonne de Winogradski Colonnes anoxiques: différentes bactéries phototrophes anoxygéniques se sont développées. Diagnostic par microscopie Colorations De nombreuses colorations ont été mises au point pour faciliter le diagnostic en médicale: Gram (parois des Gram + et -) Zetti (mise en évidence de la spore) Ziehl-Neelson (bacille de Koch, diagnostic de la tuberculose) coloration des flagelles Toutes passent par un étalement des bactéries sur une lame (frottis). Techniques modernes pour la microscopie Ces différentes techniques permettent d obtenir des renseignements sur les bactéries observées sans les cultiver. C est surtout utile pour les bactéries non cultivables et pour l observation d un échantillon mixte. Toutes ces méthodes utilisent des éléments essentiels de la cellule (= cibles). 6

7 Bactérie vue en coupe avec ses éléments essentiels fluorescence, PCR, métagénomique ARN 16S PCR sérologie (antigènes) coloration vitale Brock, Pearson Education, France Coloration DAPI : cible = ADN Le but est de rendre fluorescents les objets à observer (bactéries, cellules eucaryotes). Cette technique est souvent utilisée quand on doit compter les micro-organismes sous le microscope (sur une surface connue) ou repérer des bactéries dans un organe. On utilise un fluorochrome qui a la propriété de s insérer dans l ADN (attention : il est mutagène) (DAPI : 4-6-diaminodo2-phénylindole). Il peut être excité par des rayons U.V. et émet un rayonnement fluorescent décalé dans le bleu. Un filtre approprié permet de séparer rayonnement d excitation et émission fluorescente (voir photo couleurs). Le DAPI permet de compter les cellules sous le microscope, mais il ne dit pas si les cellules étaient vivantes avant la coloration. Coloration viable : cible = membrane cytoplasmique Elle permet de distinguer les cellules mortes des vivantes en testant l intégrité de la membrane cytoplasmique. La technique s applique aussi bien aux pro- qu aux eucaryotes. Cellule vivante Fluorochrome a toxique Cellule vivante Fluorochrome b non toxique Cellule morte Cellule morte On utilise un premier colorant (fluorochrome a rouge, cliché de gauche) qu une cellule vivante ne laissera pas passer parce que toxique (perméabilité sélective). Le deuxième 7

8 fluorochrome (b vert, cliché de droite) sera toléré et par conséquent pénétrera dans toutes les cellules. Les cellules vivantes seront vertes, les rouges sont mortes (voir photo couleurs). Utilisation d anticorps marqués (fluorescents) : cible = antigènes de la paroi Le but ici est de repérer les bactéries d une espèce parmi d autres ou de vérifier leur identité grâce à la spécificité des réactions immunologiques (diagnostic médical). Une bactérie présente à sa surface des antigènes. Les antigènes sont des molécules qui peuvent être reconnues comme étrangères par le système immunitaire des mammifères. Ils possèdent plusieurs plages appelées déterminants antigéniques ou épitopes pour lesquels des anticorps spécifiques seront produits. Notre corps réagit lors d une infection en augmentant la température pour ralentir la progression des bactéries et en stimulant le système immunitaire qui va reconnaître les sites caractéristiques et produire les anticorps correspondant aux différents déterminants antigéniques. 4 Opsonisation Réactions antigènes - anticorps Agglutination 4 WIKIbooks: 8

9 Ces anticorps vont se fixer sur les antigènes. Le résultat varie selon les cas: rendre plus facile le travail des macrophages (cellules qui phagocytent (avalent) les éléments étrangers pour les éliminer de l organisme) = opsonisation les corps infectieux sont agglutinés ou neutralisés. Phagocytose d un bacille par un macrophage a) b) e) f) bacille c) d) g) h) Vidéo : Exemple de phagocytose d une bactérie par une amibe 5. Le plus difficile est d identifier les anticorps qui seront spécifiques à une espèce bactérienne. Ensuite, il faudra les séparer et les produire in vitro (anticorps monoclonaux). La dernière étape est de les coupler à un fluorochrome. L analyse proprement dite est assez simple: il s agit d incuber dans des conditions adéquates l échantillon avec les anticorps marqués. Après lavage pour éliminer les anticorps non fixés, on observe au microscope sous U.V. (voir 2 photos couleurs). Utilisation de la biologie moléculaire pour le diagnostic par microscopie Ici, on se base sur la spécificité des séquences nucléiques pour identifier une bactérie. Mais il y a un préalable: il faut identifier une séquence spécifique sur l ADN ou l ARN bactérien. Ce qui implique d avoir déjà cultivé ce type de bactéries. Ces techniques permettent de cibler un groupe taxonomique précis. Fluorescent in situ hybridization (FISH) : cible = ribosome Le but est de cibler spécifiquement un groupe taxonomique en se basant sur la spécificité des séquences nucléiques. L hybridation «in situ» (FISH en anglais) combine les méthodes moléculaires et l observation microscopique

10 L idée est de fixer par hybridation 6 une sonde marquée avec un fluorochrome (sonde = oligonucléotide d environ 20 bases complémentaires au site choisi) directement sur l ARN des ribosomes. Incubée avec l échantillon dans de bonnes conditions, la sonde va s hybrider avec le brin d ARN ciblé. Comme les ribosomes sont nombreux, la bactérie sera fluorescente sous U.V. (voir schéma et photos en couleurs). On peut utiliser parallèlement différentes sondes marquées avec des fluorochromes différents (ils fluorescent dans le rouge, le vert, etc..), visant des groupes taxonomiques distincts. Ainsi, il est possible de localiser sur un prélèvement différentes populations (voir schéma en couleurs). Utilisation de la génomique pour identifier les populations présentes dans un environnement Les méthodes traditionnelles ne permettent pas de caractériser la totalité des microorganismes présents, pour différentes raisons: bactéries non cultivables population mixte où certaines bactéries vont se développer au détriment des autres tests d identification difficilement utilisables ou trop nombreux C est pourquoi la génomique est appliquée à ce type de recherche. PCR : polymérisation en chaîne La PCR est une méthode qui permet d amplifier (de multiplier) l ADN ou l ARN. Quelques dates marquantes à propos de la PCR (Polymerase Chain Reaction): 1953: découverte de la structure en double hélice de l ADN (Watson Crick) 1956: découverte de l ADN polymérase ADN dépendante (Kornberg) 1986: premières publications sur la PCR (Mullis) 1988: première PCR avec la Taq polymérase (Saiki) 1992: invention de la PCR en temps réel 7 (Higushi) Le but de la PCR est d amplifier (multiplier) le gène choisi de manière à avoir assez de matériel pour l analyser. Il faut disposer de: l ADN purifié (débarrassé des autres éléments cellulaires) deux amorces (= courts fragments d ADN complémentaires au début du gène concerné sur chaque brin) : elles déterminent le début de la séquence à copier l ADN polymérase (enzyme qui fabrique l ADN à partir d une matrice, ici l ADN à identifier, en réunissant les nucléotides complémentaires) (=Taq, enzyme thermophile) une réserve de nucléotides prêts à être insérés 6 L hybridation correspond à lier 2 brins d ADN ou d ARN en utilisant la capacité naturelle de ces molécules à former des ponts hydrogènes entre les bases azotées complémentaires. 7 La PCR en point final ne permet pas de connaître la quantité initiale d ADN ou d ARN cible. La PCR en temps réel permet de suivre toute la cinétique de la réaction et d en déduire la quantité initiale d ADN ou d ARN cible. 10

11 On a aussi besoin d un thermocycleur: appareil programmable pour varier la température d incubation pendant les temps désirés. Cela permet alternativement de : dénaturer l ADN (séparer les doubles brins complémentaires) ; hybrider les amorces (les lier à la zone complémentaire sur l ADN) ; synthétiser le nouveau brin d ADN complémentaire à la matrice. La durée de cette étape détermine la longueur du nouveau brin. La force de cette technique est que chaque nouvelle paire synthétisée fonctionnera comme matrice au cycle suivant. Il faut cycles pour obtenir entre 10 6 et 10 9 copies. Double chaîne d ADN Hybridation: positionnement des nucléotides complémentaires sur la chaîne de base Une chaîne après dénaturation + Mélange de nucléotides avec adénine avec thymine avec guanine avec cytosine + ADN polymérase Gènes amplifiés On peut choisir n importe quel gène, mais il y a des contraintes: il faut disposer des deux amorces correspondant au début de ce gène (brin principal et brin complémentaire) il faut qu il y ait des données sur ce gène chez différentes bactéries il faut être sûre que ce gène existe chez cette bactérie il faut que ce gène n ait pas subi trop de mutations, sinon les amorces ne le reconnaîtront pas. 11

12 On utilise souvent le gène qui code pour le rarn 16S présent dans les ribosomes bactériens (ce sont des amorces universelles). Voir schéma en couleurs et vidéo 8 Vérification sur gel d agarose Avant d exploiter le gène amplifié, il faut vérifier que sa taille corresponde bien à la séquence ciblée. On fait migrer un échantillon sur gel d agarose par électrophorèse (l ADN négativement chargé migre sous l influence du courant électrique : la migration va de la cathode (-) vers l anode (+)). En fonction de sa taille, donc de son poids moléculaire, l ADN migre plus ou moins bien. On dispose d un étalon qui indique différents poids moléculaires (voir photo couleurs). Identification La dernière étape consiste à «lire» la séquence de bases azotées sur le fragment d ADN. L opération est réalisée par une machine. C est le séquençage. La séquence obtenue : AATGGGAC. est ensuite soumise à la base de données qui va nous indiquer si elle possède des séquences semblables ou similaires. NCBI est une base de données qui regroupe les séquences connues pour l ADN, l ARN ou encore les protéines. L accès est gratuit, mais en contrepartie, les chercheurs déposent les nouvelles séquences dans la base lorsqu ils publient. Ainsi, elle s enrichit constamment. Cette technique permet d identifier: une bactérie obtenue par culture une bactérie présente dans un échantillon sans passer par la culture moyennant des opérations de clonage avant la PCR, l identification des principaux membres d une communauté. C est plus court et plus performant que les méthodes traditionnelles. Enzymes utilisées en génie génétique Les enzymes de restriction ou endonucléases sont des enzymes bactériennes qui reconnaissent et coupent des séquences spécifiques de 4 à 6 bases. Elles protègent la cellule hôte en détruisant l ADN d un bactériophage après sa pénétration. Les bactéries protègent leur propre ADN en méthylant 9 les nucléotides aux sites reconnus par les enzymes de restriction qu elles produisent. Un ADN étranger n est en général pas méthylé sur les mêmes sites et peut être détruit. Il existe 3 grands types d enzymes de restriction: deux coupent en-dehors des sites de reconnaissance, le 3e (groupe II) clive l ADN à des sites spécifiques. C est ce groupe qui est utilisé pour préparer des fragments d ADN contenant des gènes ou portions de gènes spécifiques. On a isolé une série d enzymes de ce type provenant de différentes bactéries. Ils coupent à des endroits différents. Par exemple: 8 Vidéo PCR : 9 Adjonction d un groupe chimique (méthyle) sur le site. 12

13 Prescott, 2003 Exemple : mode d action d EcoR1 : Mode d action de EcoR1 EcoR1 fait des coupures décalées sur chacun des 2 brins d ADN pour former des bouts cohésifs. Prescott,

14 Quand les deux fragments d ADN se séparent, ils possèdent des extrémités complémentaires simple-brin = bouts cohésifs. Des brins cohésifs peuvent s hybrider et se joindrent au brin d ADN grâce à une enzyme: l ADN ligase. Ces enzymes sont les outils du génie génétique. Ils permettent d insérer des brins spécifiques étrangers dans des vecteurs ADN comme un plasmide par exemple. Construction d un plasmide recombinant L ADN contenant le gène à cloner est coupé par une endonucléase de même que le vecteur. Les fragments sont mis en contact avec les plasmides choisis comme vecteurs. Il y a appariement d un fragment avec un plasmide. Les bouts cohésifs s hybrident. Les extrémités sont jointes par l ADN ligase. Le fragment fait désormais partie du plasmide. Prescott, 2003 Métagénomique La métagénomique est une approche globale pour identifier les membres d une population. Elle passe forcément par l extraction et la purification de l ADN total de l échantillon. On peut travailler directement sur cet ADN sans amplification. Dans ce cas il faut fragmenter l ADN grâce à des enzymes de restriction (qui coupent l ADN sur des séquences précises). Ensuite, il faut séquencer tous les brins. L interprétation est longue, car les séquences obtenues appartiennent à différentes bactéries et concernent différents gènes. Mais, cette méthode permet d identifier des groupes d organismes sans les isoler (bactéries, mais aussi virus et eucaryotes). Elle donne des informations comme: la variété et la quantité des espèces présentes. Si on ajoute les données minéralogiques et physiques, on a une assez bonne représentation de la population globale d un site. Ex Dry Valley (Antarctique) 10 Ces sols sont parmi les plus vieux de la Terre. Ce sont les plus froids, les plus secs et les plus oligotrophes (pauvres en matière organique) de la planète. 10 Référence de l article : On the rocks: the microbiology of Antarctic Dry Valley soils, S. Craig Cary, Ian R. McDonald, John E. Barrett and Don A. Cowan, Nature Reviews / Microbiology Vol. 8 (February 2010) ). 14

15 Les analyses microbiologiques traditionnelles n ont rien révélé. La métagénomique a montré qu il y a dans ce sol l ADN d une communauté variée. Arbre phylogénétique Arbres d autres régions à titre de comparaison Mais rien n indique que ces micro-organismes soient vivants. Ils peuvent être: morts (l ADN est facilement conservé au froid et au sec) en dormance (métaboliquement inactifs, mais vivants) vivants et actifs. Mise en évidence de l activité des micro-organismes Utilisation de microélectrodes pour mesurer les gaz ou le ph a) Représentation schématique d une microélectrode à oxygène b) Utilisation de différentes microélectrodes pour étudier un tapis bactérien. 15

16 Il est souvent important de vérifier l activité des micro-organismes dans leur environnement. Cela ne dit pas qui fait quoi, mais que cette activité existe. On peut la mettre en parallèle avec la recherche de gènes spécifiques et l identification de genres bactériens connus. Tapis microbien a) Carotte prélevée à travers un tapis microbien dans une source chaude. en vert foncé: cyanobactéries en dessous: plusieurs couches de bactéries phototrophes anoxygéniques (zone orangée) le tout fait environ 2 cm b) Microprofils pour l oxygène, l H 2 S et le ph (acidité) L oxygène est dans la couche supérieure et diminue fortement. L H 2 S est nettement en dessous (lié au métabolisme anaérobie). Le ph varie selon les populations concernées. Conclusion Les méthodes modernes ont permis de mieux explorer les bactéries de l environnement. Mais les renseignements obtenus sont souvent fragmentaires. Il est nécessaire d utiliser différentes approches complémentaires pour avoir une idée de l écologie d un biotope. 16

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