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1 PII: S (98) Wat. Res. Vol. 33, No. 6, pp. 1523±1533, 1999 # 1999 Elsevier Science Ltd. All rights reserved Printed in Great Britain /99/$ - see front matter FLUORESCENCE 3D DE LA MATIEÁ RE ORGANIQUE DISSOUTE DU FLEUVE AMAZONE (THREE- DIMENSIONAL FLUORESCENCE OF THE DISSOLVED ORGANIC CARBON IN THE AMAZON RIVER) S. MOUNIER*, N. PATEL, L. QUILICI, J. Y. BENAIM and C. BENAMOU Laboratoire RCMO, Universite de Toulon et du Var, BP 132, La Garde Cedex, France (First received July 1997; accepted in revised form July 1998) Re sumeâ ÐLes eaux de euve, fractionneâ es par ultra ltration tangentielle seâ quentielle (UFTS), sont analyseâ es par des matrices d'excitation et d'eâ mission de uorescence (MEEF). Les substances humiques uorescentes provenant des eaux du bassin amazonien, sont caracteâ riseâ es par les longueurs d'onde d'excitation et d'eâ mission des intensiteâ s de uorescence maximum sur des diagrammes 3D (l ex /l em )etdu rapport des intensiteâ s de uorescence (r a,c =I a /I c ) de deux uorophores (type humique A et C) dans les eaux naturelles. Les reâ sultats obtenus montrent que: (i) des espeá ces uorescentes provenant d'eaux riches en mateâ riel humique (eaux noires) sont preâ feâ rentiellement retenues par le seuil de coupure de 5 kda (type humique C). Ces composeâ s de type C ont une masse moleâ culaire plus eâ leveâ e que les composeâ s uorescents de type humique A. (ii) Les reâ actions de complexation avec les ions cuivriques (Cu 2+ )seâ parent les composeâ s humiques de type C en deux cateâ gories: l'une ne variant pas, l'autre eâ largissant le domaine des longueurs d'onde d'excitation e caces de 20 nm. La photolyse produit des e ets similaires sur les composeâ s humiques de type C. A partir des donneâ es spectroscopiques et des masses moleâ culaires, une tentative d'identi cation est proposeâ e pour les uorophores A (l 260 /l 445 )etc(l 350 / l 445 ). Les composeâ s de type A et C manifestent des caracteâ ristiques qui les rapprochent respectivement des acides fulviques et des acides humiques. # 1999 Elsevier Science Ltd. All rights reserved Mot cleâfsð uorescence, MEEF, substances humiques, ultra ltration, photochimie, complexation AbstractÐNatural organic matter is an important pool that is not yet totally described. Two types of compounds are found: some chemically well characterised molecules (biopolymers) and uncharacterised humic substances (geopolymers). The spectroscopic properties of this pool of organic matter have recently been advanced by the excitation emission uorescence matrix (EEFM) [Coble, G. P. (1996) Characterization of marine and terrestrial DOM in seawater using excitation-emission matrix spectroscopy. Marine Chemistry 51, 325±346.]. Three types of uorophores are described by their excitation/emission wavelength at maximum intensity (l ex /l em ) max : the tyrosin and tryptophan like structures, not examined here, and the humic like uorescent structures of type A (l 260 /l 445 ) and type C(l 330 /l 445 ). The EEFM applied to sequential tangential ultra ltered (UFTS) amazonian fresh waters give spectroscopic information on the uorescent properties of particulate (>0.22 mm), colloidal and dissolved (<5 kda) organic matter. Chromophores A and C are present in all sized fraction samples. Their (l ex /l em ) max are in the same domains as those of terrestrial humic substances [Seritti, A., Morelli, E., Nannicini, L. and Del Vecchio, R. (1994) Production of hydrophobic uorescent organic matter by marine diation Pheodactylum tricornutum. Chemosphere 28(1), 117±129; Coble, G. P. (1996) Characterization of marine and terrestrial DOM in seawater using excitation-emission matrix spectroscopy. Marine Chemistry 51, 325±346.]. Di erentiation of the type A and type C peaks in 3D diagrams are based on their (l ex /l em ) max position and the I a /I c ratio. Di erences are observed between humic material extracted by hydrophobic resins or concentrated sample from tangential sequential ultra ltration (UFTS). Spectroscopic properties of the humic material are not modi ed by the ultra ltration process. A particular attention is given on the di erentiation between black water (Rio Negro River) and white water (Rio SolimoÄ es and Rio Madeira River). Black waters are generally known as humic rich and low mineral content waters. EEFM analysis on these two types of water lead to the following conclusions: (i) the humic like uorescent compounds of type C are preferentially retained by membranes with 5 kda cut o. These compounds have the larger molecular weight. (ii) In the presence of copper cation, the type C compounds are divided in two groups according to their (l ex /l em ) max : the rst one is invariant, the other one expands (20 nm) its e cient excitation wavelength domain. (iii) Photochemical reactions induced by UV irradiation also lead to a 20 nm expansion of the e cient excitation wavelength domain. From these spectroscopic and molecular weight complementary data, it is proposed that A type uorophores are close to fulvic acids while C uorophores seems to be more related to humic acid. # 1999 Elsevier Science Ltd. All rights reserved Key wordsð uorescence, EEFM, humic substances, ultra ltration, photochemistry, complexation, uorescence, MEEF, substances humiques, ultra ltration, photochimie, complexation *Author to whom all correspondence should be addressed. [Tel.: ; Fax: ;

2 1524 S. Mounier et al. INTRODUCTION La matieá re organique dans les eaux de euve repreâ - sente 20 aá 30% des apports de carbone aux oceâ ans (Sigg et al., 1992). Les substances humiques repreâ - sentent 50 aá 80% de la matieá re organique totale (Cathalifaud et al., 1997). Les structures des substances humiques font l'objet d'une attention particulieá re dans le domaine de l'environnement comme eâ tant une signature possible de leur processus de formation (Sihombing et al., 1996). Le roã le de ces moleâ cules complexes dans la chimie des sols et des eaux est principalement duã aá leur capaciteâ complexante des meâ taux et aá leurs proprieâ teâ s amphiphiles (Van Den Berg, 1995). L'utilisation des proprieâ teâ s de uorescence de cette matieá re organique permet d'obtenir des informations utiles sur la structure et les proprieâ teâ sgeâ neâ rales de ces composeâ s. Les spectres d'eâ mission de uorescence conventionnels, en raison de leur largeur et des positions des maxima, fournissent des informations limiteâ es. Des informations plus compleá tes peuvent eã tre obtenues en utilisant des matrices d'excitation et d'eâ mission de uorescence. Dans ce type d'analyse, les proprieâ teâ s spectroscopiques de uorescence sont caracteâ riseâ es par des mesures d'intensiteâ aá des longueurs d'onde d'excitation et d'eâ mission particulieá res (Benamou et al., 1994; De Souza-Sierra et al., 1994; Coble, 1996). Divers sites de complexation peuvent eã tre observeâ s par l'addition d'un meâ tal (Cu, Al, Fe,...) qui induit des variations d'intensiteâ de uorescence dans di eâ rents domaines de longueurs d'onde d'excitation et d'eâ mission (Cabaniss, 1992). Les ions cuivriques diminuent l'intensiteâ de uorescence alors que les ions aluminium l'exaltent (Plankey and Patterson, 1987). Les substances humiques peuvent eã tre extraites suivant diverses meâ thodes: reâ sine hydrophobe (Slauenwhite and Wangersky, 1996), ultra ltration tangentielle (Martin-Mousset et al., 1997), osmose (Saar and Weber, 1982). La concentration par ultra- ltration est une meâ thode avantageuse, modi ant peu la chimie des substances humiques. Cette technique est employeâ e par de nombreux auteurs pour seâ parer le mateâ riel humique (Powell et al., 1996). Dans ce travail, la seâ paration sur le terrain des substances organiques dissoutes est faite suivant le criteá re de taille par ultra ltration tangentielle (Bu e et al., 1978; Buesseler et al., 1996). Cette meâ thode permet de traiter des volumes de l'ordre de 50 l. Les seuils de coupures (0,22 mm et 5 kda) seâ parent trois domaines: le particulaire, le colloõè dal et le dissous. Le seuil 100 kda permet de seâ parer le domaine colloõè dal en deux fractions: les colloõè des retenus entre 0,22 mm et 100 kda (colloõè des 100 kda) et ceux retenus entre 100 et 5 kda (colloõè des 5 kda). Les eâ chantillons eâ tudieâ s proviennent de l'amazone et de ses a uents, pour lesquels les bassins versants sont distincts et bien deâ nis. Les eaux noires provenant de la percolation au travers des sols podzoliques riches en humus, sont concentreâ es en geâ opolymeá res (464 aá 620 mmol l 1 de C) et contiennent peu de matieá re mineâ rale (concentration de Na, K, Mg, Ca <20 mmol l 1 ). Les eaux blanches riches en matieá res mineâ rales (concentration de Na, K, Mg, Ca >100 mmol l 1 ), contiennent une matieá re organique reâ cente provenant du lessivage direct des sols (Furch, 1984). L'utilisation des matrices d'excitation et d'eâ mission de uorescence (MEEF) sur les di eâ rentes fractions ultra ltreâ es permet d'obtenir plusieurs informations et de mieux di eâ rencier la matieá re organique preâ sente dans les eaux de euves tropicaux. Dans les preâ ceâ dents travaux sur la uorescence des substances humiques naturelles, trois types de uorophores ont eâ teâ distingueâ s.. Deux types di eâ rents sont distingueâ s par Coble (1996) pour des eaux naturelles non concentreâ es. Le premier type posseá de des proprieâ teâ s spectroscopiques proches des acides amineâ s uorescents (type tryptophane ou tyrosine). Le deuxieá me est composeâ de substances humiques comportant deux types de uorophores A (l ex =260 nm/ l em =445 nm) et C (l ex =330 nm/l em =445 nm).. Un uorophore ayant une longueur d'onde d'eâ mission indeâ pendante de la longueur d'onde d'excitation (l em =520 nm) (Seritti et al., 1994a; Seritti et al., 1994b) a eâ teâ eâ tudieâ sur des matieá res organiques naturelles concentreâ es sur reâ sine hydrophobe. Dans ce travail, un compleâ ment aá l'eâ tude de ces di eâ rents chromophores est proposeâ en introduisant un criteá re suppleâ mentaire, le criteá re de taille, a n de cerner le plus possible l'origine et la structure des composeâ s uorescents de type humique. L'e et des rayonnements UV-Visible sur ces chromophores sera une piste pour essayer de comprendre la formation de ces chromophores en milieux naturels. ME THODES Les sites de preâleávement Les eaux eâ tudieâ es ont eâ teâ preâ leveâ es dans l'amazone et ses principaux a uents (Rio Negro, Rio Madeira et Rio SolimoÄ es) durant les peâ riodes d'eâ tiage et de crue de 1995 aá 1996 (Fig. 1). Ces preâ leá vements ont eâ teâ e ectueâ s lors du Programme d'etude de la Ge ospheá re Intertropicale (PEGI: ORSTOM/INSU/DNAEE). Fractionnement par ultra ltration tangentielle seâquentielle (UFTS) Le module de ltration tangentielle utiliseâ est le modeá le Ultrasart Mini (Sartorius); les seuils de coupure sont 0,22 mm, 100 et 5 kda. Lors des manipulations de concentration, la pression en entreâ e de module est maintenue aux environs de 2 bar a n de conserver les conditions de ltration constantes ( ux, diameá tre de pores). La matieá re organique des preâ leá vements, seâ pareâ e par UFTS, est ainsi fractionneâ e en quatre domaines: particulaire (C 1 ), colloõè dal 100 kda (C 2 ), colloõè dal 5 kda (C 3 ) et dissous (P 3 ). Ce mateâ riel organique est concentreâ par un facteur variant de 1,2 aá 10 suivant les sites.

3 Fluorescence 3D de la matieá re organique 1525 Fig. 1. Carte de situation des eâ chantillons. (Map of sampling sites for all samples in this study.) DeÂtermination du carbone organique total (COT) Le COT est mesureâ avec un Dohrmann DC 80, par oxydation au persulfate de potassium en preâ sence de rayonnement UV. L'e talonnage est e ectueâ avec du phtalate acide de potassium. Les eâ chantillons (15 ml) sont acidi eâ s avec 100 ml d'acide nitrique supra pur (Fluka), et deâ gazeâ s avec de l'azote exempt de dioxyde de carbone, a n d'eâ liminer les carbonates. Le carbone organique oxydeâ en CO 2 est alors analyseâ par un deâ tecteur infrarouge non dispersif (NDIR). IntensiteÂs de uorescence Les mesures sont e ectueâ es avec un spectro uorimeá tre LS 50B, Perkin Elmer. Dans ce type d'appareil, les longueurs d'onde d'eâ mission et d'excitation sont seâ lectionneâ es par des reâ seaux de di raction. Les variations du faisceau incident, mesureâ es par un photomultiplicateur, sont utiliseâ es pour corriger systeâ matiquement les mesures d'intensiteâ d'eâ mission de uorescence. Les matrices de uorescence sont obtenues en reliant les spectres d'eâ mission de uorescence pour des longueurs d'onde d'excitation variant de 200 aá 450 nm par pas de 10 nm. Les matrices d'excitation et d'eâ mission de uorescence (MEEF) sont analyseâ es en faisant les rapports des intensiteâ s de uorescence des uorophores A et C deâ crits preâ ceâ demment (Coble, 1996; Klinkhammer et al., 1997). Les composeâ s A preâ sentent un maximum d'intensiteâ de uorescence (I a ) pour un couple (l ex /l em ) max =240/445 nm, alors que les composeâ s C preâ - sentent un maximum d'intensiteâ de uorescence (I c ) pour un couple (l ex /l em ) max =320/445 nm (Fig. 2). Les chromophores de type tryptophane ou tyrosine ne sont pas observeâ s dans les conditions de mesures car un ltre eâ limine toutes les longueurs d'onde d'eâ mission infeâ rieures aá 390 nm, permettant de s'a ranchir des perturbations dues aá la di usion Rayleigh. Les bandes passantes en excitation et eâ mission sont de 15 nm. L'intensite de uorescence est observeâ e pour des longueurs d'onde d'eâ mission allant de 390 aá 600 nm avec un pas de 0,5 nm. Les eâ chantillons sont ameneâ s aá ph = 5 par des ajouts de HNO 3 ou NaOH, 0,01 M et deâ gazeâ s avec de l'azote a n d'eâ liminer l'oxygeá ne preâ sent. DeÂtermination de la capaciteâ complexante Les mesures de capaciteâ complexante ont eâ teâ faites par l'extinction de uorescence avec des ions cuivriques (Cu 2+ ). Elles sont obtenues par addition de microvolumes de solution de cuivre de concentrations connues (41,6 ou 8,3 mmol de Cu l 1 ) toutes les 20 min. Elles sont e ectueâ es aux longueurs d'onde d'excitation et d'eâ mission respectivement de 366 et 450 nm. Les valeurs des capaciteâ s complexantes sont obtenues en cherchant le minimum des erreurs quadratiques entre les valeurs expeâ rimentales et theâ oriques d'un modeá le de complexation 1:1 entre la matieá re organique et le meâ tal (Hart, 1981; Ryan and Weber, 1982). Cette meâ thode donne des valeurs reproductibles aá 5%. Les mesures sont e ectueâ es aá ph = 5, ph intermeâ diaire entre les eaux noires (ph = 4) et les eaux blanches (ph = 6±7). Les solutions d'ajout sont eâ galement aá un ph = 5 (Ryan and Weber, 1982). Irradiations UV Les manipulations d'irradiation sont faites avec une lampe Hanovia aá vapeur de mercure moyenne pression de 450 W. L'ensemble est refroidi par circulation d'eau aá une tempeâ rature comprise entre 18 et 208C. Le ux photonique est deâ termineâ par actinomeâ trie chimique a n d'avoir une relation entre le temps d'exposition en laboratoire et le temps d'exposition dans le milieu naturel. Le ferrioxalate de potassium est choisi comme actinomeá tre chimique standard (Hatchard and Parker, 1956). Sa preâ paration est e ectueâ eaá partir de cristaux de ferrioxalate de potassium [K 3 Fe(C 2 O 4 ) 3 3H 2 O] suivant la meâ thode de (Hatchard and Parker, 1956), qui sont puri eâ s par recristallisation. La reâ action photochimique principale conduit aá la reâ - duction des ions ferriques en ions ferreux: 2Fe 3 C 2 O 2 4 4h 2Fe 2 2CO 2 Le rendement quantique de production des ions ferreux est de 1,25 aá 253,7 nm et varie treá s peu entre 200 et 400 nm ((Hatchard and Parker, 1956). Les ions ferreux libeâ reâ s sont doseâ s en absorption UV-Visible (Secomam S750) avec la meâ thode de complexation par l'ortho- Phe nanthroline (OP) aá 510 nm (Bowman and Demas,

4 1526 S. Mounier et al. Fig. 2. MEEF pour les uorophores A et C (Echantillon Rio Negro N 1 C 3 ). EEM contour plot for uorophore A and C (Rio Negro River sample).) 1976). A cette longueur d'onde, le coe cient d'absorption molaire du complexe Fe(II)-OP est eâ gal aá l mol 1 cm 1 (preâ cision du dosage =24%). Durant toute l'irradiation, le calcul du ux photonique est reâ aliseâ aá partir de la relation simpli eâ e valable, dans le cas du ferrioxalate de potassium, de 200 aá 400 nm (Braun et al., 1986): C Š C 0 Šˆf V P 0t [C] = concentration de Fe 2+ au temps t (mol l 1 ); [C 0 ] = concentration de Fe 2+ au temps t = 0 (mol l 1 ); f = rendement quantique de photolyse du composeâ CaÁ la longueur d'onde d'irradiation; P 0 = ux photonique absorbeâ par la solution irradieâ e (Einstein s 1 ) (1 Einstein = 1 mol de photons); V = volume de solution irradieâ e. La lampe utiliseâ e dans ce travail deâ veloppe un ux photonique de 6650 me s 1 m 2 pour un reâ acteur de 25 ml en quartz cylindrique de diameá tre 50 mm. Cette valeur peut eã tre relieâ eaá la valeur du ux photonique solaire dans la reâ gion de 200 aá 400 nm qui est de 200 me s 1 m 2 (Kuma et al., 1992). Les intensiteâ s de uorescence des eaux naturelles fractionneâ es sont observeâ es avant et apreá s irradiation, en preâ - sence ou non de meâ tal. L'ensemble des reâ actifs utiliseâ s est de qualiteâ analytique, et les solutions et dilutions sont faites avec de l'eau milliq (Millipore system). RE SULTATS ET DISCUSSIONS Etude des positions des maxima sur les matrices d'excitation et d'eâmission de uorescence Les positions des maxima de uorescence (Fig. 3) pour les di eâ rents types d'eau du bassin amazonien con rment les valeurs reâ pertorieâ es dans les travaux preâ ceâ dents pour les uorophores de type C. L'ensemble des points preâ sente une certaine homogeâ neâ iteâ dans la distribution des maxima des longueurs d'onde d'excitation et d'eâ mission pour les eaux naturelles et pour celles concentreâ es par UFTS (respectivement 320±360 et 428±465 nm). Les eâ chantillons analyseâ s dans cette eâ tude preâ sentent cependant des longueurs d'onde d'excitation plus eâ leveâ es. Toutefois le ph n'eâ tant pas toujours preâ ciseâ dans les travaux anteâ rieurs, ce leâ ger glissement vers les longueurs d'onde plus grandes peut eã tre duã aá une di eâ rence de ph. Pour l'ensemble des fractions issues de l'ufts, les positions (l ex /l em ) max apparaissent dans le meã me domaine que celui des eaux de rivieá re autres que l'amazone. Les valeurs extreã mes observeâ es pour des eaux interstitielles ou pour de la meâ lanoõè dine (Coble, 1996) ne sont pas deâ passeâ es (Fig. 3). Les longueurs d'onde d'excitation et d'eâ mission observeâ es ici sont di eâ rentes de celles mesureâ es sur les substances humiques et fulviques extraites. Ceci con rme que leur extraction par un protocole trop seâ lectif, peut modi er leur structure (Thurman et al., 1988). La concentration d'un mateâ riel humique par UFTS n'alteá re donc pas sa con guration, les positions (l ex /l em ) max eâ tant proches de celles trouveâ es pour des eaux naturelles non concentreâ es. Facteurs in uenc ant les positions des maxima L'intensite de uorescence des substances humiques peut eã tre atteâ nueâ e par plusieurs parameá tres.

5 Fluorescence 3D de la matieá re organique 1527 Les e ets dus aá la preâ sence d'ions meâ talliques complexants ou aá la preâ sence d'oxygeá ne et de radiation UV ne sont pas des moindres (De Souza-Sierra et al., 1994). Par contre leur in uence sur la position des maxima de uorescence de la matieá re organique naturelle est encore treá s peu eâ tudieâ e. Addition d'ions cuivriques. De manieá re geâ neâ rale, les intensiteâ s des uorophores lieâ s au cuivre (sites complexants) subissent une deâ croissance (Cabaniss and Shuman, 1986). Syste matiquement, pour chaque fraction de taille, la capaciteâ complexante est deâ termineâ e par cette extinction de uorescence. L'ajout de cuivre dans les eaux concentreâ es de l'amazone montre deux comportements di eâ rents dans l'eâ volution des maxima (Fig. 4). Une partie des points ne varie que treá s peu. Par contre, un autre groupe de points se deâ tache, pour lesquels il semble y avoir une relation entre l exc et l em (Fig. 5, droite). Irradiation UV-visible. Les eâ chantillons, une fois irradieâ s durant 20 min dans les meã mes conditions que pour la deâ termination du ux photonique, montrent eâ galement deux comportements di eâ rents. Pour une partie, les maxima semblent inchangeâ s avec un resserrement autour de la longueur d'onde d'excitation de 330 nm (Fig. 5). L'autre partie, s'est par contre deâ ployeâ e dans un domaine de longueur d'onde d'excitation plus large (310 aá 370 nm + 20 nm) pour un domaine d'eâ mission sensiblement identique (428 aá 465 nm). Ces variations montrent que le domaine des longueurs d'onde d'excitation e caces s'agrandit de 320±360 aá 300±370 nm. Cette augmentation de 30 nm dans l'eâ ventail des longueurs d'onde d'excitation est accompagneâ e d'une relation entre la longueur d'onde d'excitation et d'eâ mission. Plus la longueur d'onde d'excitation est grande, plus la longueur d'onde d'eâ mission est grande. Ainsi, dans le domaine des uorophores de type C, il existe deux types de moleâ cules: celles qui reâ agissent en preâ sence de cuivre ou d'une irradiation, et celles qui sont insensibles et proches du domaine l exc / l em des eaux naturelles. CorreÂlation ``Intensite de uorescence: carbone organique'' pour les 2 pics A et C Pour chaque fraction concentreâ e par UFTS d'un site de preâ leá vement, les intensiteâ s de uorescence sont mesureâ es pour les maxima de type A (l 240 / l 445 ) et de type C (l 320 /l 445 ). Les concentrations en COT varient entre 110 et 4200 mmol de C l 1 (Table 1). Ces valeurs ne montrent pas de correâ lation marqueâ e entre les intensiteâ s de uorescence et les teneurs en COT. Ceci peut s'expliquer par la preâ sence d'une grande varieâ teâ de uorophores dans les eaux naturelles (r 2 compris entre 0,12 et 0,09). Par contre le rapport des intensiteâ s maximales entre I a et I c (r a,c =I A /I C ) semble suivre une tendance inverse aá celle du COT (Fig. 6). Fig. 3. Comparaison des positions (l ex /l em ) max obtenues dans cette eâ tude avec les reâ sultats des preâ - ceâ dents travaux (pic C) W = notre eâ tude sur les eaux du bassin amazonien (PEGI 1996) et concentreâ es par UFTS, r = valeurs Amazone (Coble, 1996), w = autres rivieá res (Coble, 1996), y = substances humiques et fulviques, * = meâ lanoõè dine, + = eaux de mer (Coble, 1996), - = eaux interstitielles marines (Coble, 1996), ÐÐÐ correâ lation pour les points de cette eâ tude. Comparison of (l ex /l em ) max position between this work and previous works (peak C) W= amazon basin (PEGI 1996), this work and concentrated by UFTS, r = Amazon value (Coble, 1996), w = others rivers (Coble, 1996), y = humic and fulvic substances, * = melanoõè din, + = marine water (Coble, 1996), - = marine pore water (Coble, 1996), ÐÐÐ solid line correlation for this work.)

6 1528 S. Mounier et al. Fig. 4. Comparaison des positions (l ex /l em ) max apreá s ajout d'ions cuivriques (Cu ++ ) pour des eaux concentreâ es du bassin amazonien avec les reâ sultats des preâ ceâ dents travaux (pic C). W = notre eâ tude sur les eaux du bassin amazonien (PEGI 1996) et concentreâ es par UFTS, apreá s ajout d'ions cuivriques, r = valeurs Amazone (Coble, 1996), w = autres rivieá res (Coble, 1996). (Comparison of ((l ex /l em ) max position between this work after Cu ++ added and previous (peak C). W = Amazon basin (PEGI 1996), this work and concentrated by UFTS and Cu ++ added, r = Amazon value (Coble, 1996), w = others rivers (Coble, 1996).) L'augmentation du COT dans une eau naturelle apreá s concentration par UFTS est accompagneâ e d'une diminution de r a,c. Cette tendance est plus prononceâ e pour les eaux noires qui peuvent atteindre 4166 mmol de C l 1 apreá s concentration. Une telle deâ croissance montre que le carbone organique retenu par les di eâ rents seuils de coupure peut contenir une forte proportion de uorophore de type C (l 320 /l 445 ) et qu'ils sont plus riches en carbone organique que les uorophores de type A. Etude du rapport r a,c en fonction du fractionnement par ultra ltration tangentielle seâquentielle Les rapports que l'on obtient sont proches de ceux preâ ceâ demment obtenus pour des eaux du bassin amazonien (Fig. 8). On observe que les uorophores A et C sont preâ sents dans toutes les Fig. 5. Comparaison des positions (l ex /l em ) max apreá s irradiation pour des eaux concentreâ es du bassin amazonien avec les reâ sultats des preâ ceâ dents travaux (pic C). W = notre eâ tude sur les eaux du bassin amazonien (PEGI 1996) et concentreâ es par UFTS apreá s irradiation, r = valeurs Amazone (Coble, 1996), w = autres rivieá res (Coble, 1996). (Comparison of (l ex /l em ) max position between this work after irradiation and previous (peak C). W = amazon basin (PEGI 1996), this work and concentrated by UFTS after irradiation, r = Amazon value (Coble, 1996), w = others rivers (Coble, 1996).)

7 Fluorescence 3D de la matieá re organique 1529 fractions obtenues par UFTS. Les maxima ont des valeurs bien deâ nies quel que soit le type d'eau que l'on observe (eau blanche, noire ou meâ lange) (Fig. 7). De manieá re geâ neâ rale, r a,c est supeâ rieur aá 1,5 pour les eaux blanches comme le Rio Madeira ou le Rio SolimoÄ es et pour les fractions concentreâ es particulaires et colloõè dales 100 kda (Fig. 8). Par contre le rapport est nettement plus faible pour les fractions du Rio Negro (1,1). Toutefois, les moleâ cules uorescentes ne sont pas retenues de manieá re identique par les di eâ rentes membranes (0,22 mm, 100 kda, 5 kda). L'e tude montre clairement que r a,c diminue fortement pour la fraction retenue par le seuil de coupure de 5 kda (Fig. 8, fraction C 3 ). Ceci s'explique par une reâ tention preâ feâ rentielle des uorophores de types C par la membrane de 5 kda et donc un enrichissement de la fraction C 3. Par la suite, la valeur de r a,c devient supeâ rieure aá celle de la fraction preâ ceâ dente (C 3 ) quel que soit le type d'eau. Ceci est duã aá une diminution de la concentration en composeâ de type C dans le domaine du dissous (Fig. 8, fraction P 3 ) et donc un enrichissement relatif en composeâ de type A. Apparemment pour les fractions supeâ rieures aá 5 kda, une faible valeur de r a,c est caracteâ ristique d'une eau noire, alors qu'une valeur plus eâ leveâ e est caracteâ ristique d'une eau blanche. (Fig. 8). L'Amazone, qui est le meâ lange de ces deux types d'eau, preâ sente un rapport proche de 0,5, ce qui tend aá montrer que les moleâ cules de type C preâ - sentes dans l'amazone sont principalement ameneâ es par le Rio Negro. Les eaux du Rio Negro transportent une matieá re organique plus vieille et de plus grande taille que celle des eaux blanches. Dans la fraction C 3 (5 kda < ± < 100 kda) il y a une plus forte contribution des acides humiques (type C). Dans la fraction P 3 (<5 kda) la contribution des acides fulviques (type A) devient preâ dominante. Les chromophores de type A sont preâ sents dans toutes les fractions, car ils sont peu concentreâ s par rapport aux chromophores de type C. Addition d'ions cuivriques. Les rapports r a,c sont eâ galement mesureâ s avant et apreá s ajout d'une quantiteâ de cuivre eâ gale aá la capaciteâ complexante Table 1. Intensite s de uorescence pour les deux types de uorophore (A et C) aá ph = 5. (Fluorescence intensities for the two types of uorophores (A and C) at ph = 5) Eau Eau naturelle Eau naturelle + [Cu 2+ ] b naturelle + hn c Point Fraction Type d'eau COT a I a d I c d Capacite s complexantes e I d a I c d I a d I c d O1 C1 blanche 397, O1 C2 blanche 372, O1 C3 blanche 1956, O1 P3 blanche N1 C1 noire 701, N1 C2 noire N1 C3 noire 2377, N1 P3 noire 168, M1 C1 blanche 176, M1 C2 blanche 210, M1 C3 blanche 494, M1 P3 blanche 116, S1 C1 blanche 363, S1 C2 blanche 288, S1 C3 blanche 1342, S1 P3 blanche 463, P6bis C1 noire 3551, P6bis C2 noire 761, P6bis C3 noire 4236, P6bis P3 noire 205, C23 C1 noire C23 C2 noire C23 C3 noire 266, C23 P3 noire C7 C1 noire C7 C2 noire 1966, C7 C3 noire C7 P3 noire 233, D12 C1 noire 3843, D12 C2 noire 1479, D12 C3 noire 1265, D12 P3 noire 121, D2 C1 blanche 321, D2 C2 blanche 287, D2 C3 blanche D2 P3 blanche 143, a mmol de C l 1. b [Cu 2+ ] = capaciteâ complexante. c 10 min aá 6650 me s 1 m 2. d Unite arbitraire de uorescence. e Capacite complexante en mmol l 1 deâ termineâ e par extinction de uorescence (25%).

8 1530 S. Mounier et al. Fig. 6. Relation entre le rapport Ia/Ic et le COT dans les eaux naturelles traiteâ es par UFTS pour l'ensemble des eâ chantillons. (Correlation between Ia/Ic ratio and TOC for all samples treated by UFTS.) (Table 1). L'e tude montre que ces rapports sont sensiblement infeâ rieurs aá ceux observeâ s pour les fractions initiales (sans meâ tal). Les sites de type A auraient une intensiteâ qui diminue sensiblement plus que celle des composeâ s de type C. Ceci con rme l'hypotheá se preâ ceâ dente, les composeâ s A, de type fulvique, sont en e et plus facilement complexeâ s par les ions cuivriques. Irradiation UV-visible. L'augmentation de r a,c (Table 1) apreá s une irradiation (+11% en moyenne) montre, par contre, que les moleâ cules de type C sont plus sensibles aux irradiations que les moleâ cules de type A. Les composeâ s de type C, comportant plus de structures aromatiques, sont plus sensibles aux photoreâ actions induites secondaires (Mo ett and Zika, 1987). Au cours de l'irradiation, ces derniers se deâ graderaient en moleâ cules plus petites et moins uorescentes (Kouassi and Zika, 1990): le rapport r a,c augmente. Ceci pourrait con- rmer une appellation ``type humique'' ou ``type fulvique'' des composeâ s de type C (l 320 /l 445 )eta (l 240 /l 445 ). CONCLUSION L'utilisation des matrices d'excitation et d'eâ mission de uorescence (MEEF) permet d'obtenir des informations assez preâ cises sur la qualiteâ de la matieá re organique preâ sente dans les eaux de euve. Cette technique appliqueâ eaá des fractions concentreâ es provenant d'expeâ riences d'ufts permet en plus une caracteâ risation par criteá re de taille. Les composeâ s de type humique C (l ex =350, l eâ m =450) et A (l ex =260, l eâ m =445) sont preâ sents dans toutes les fractions de taille (particulaire 0,22 mm, colloõè dal 100 kda, colloõè dal 5 kda et dissoute <5 kda). La position des maxima dans les MEEF, permet de situer les matieá res organiques du bassin amazonien et de les di eâ rencier par comparaison avec des matieá res organiques issues d'autres milieux naturels. La concentration des substances humiques par UFTS ne modi e pas les proprieâ teâ s uorescentes de celles-ci contrairement aux extractions sur colonne de type XAD. Le suivi des expeâ riences d'irradiation ainsi que des complexations par le cuivre permet de distinguer deux eâ volutions pour les uorophores de type C: soit un comportement non a ecteâ par la preâ sence d'ion cuivrique ou par l'irradiation UV, soit une modi cation eâ largissant le domaine des longueurs d'onde d'excitation e caces de 20 aá 30 nm. L'e tude du rapport des deux intensiteâ s de uorescence (r a,c =I A /I C ) montre une forte proportion des composeâ s humiques de type C dans les eaux du Rio Negro. Ce rapport est un bon indicateur de structure de la matieá re organique. Dans ce travail deux sortes de uorophores sont distingueâ s: ceux de type C aá qui on a attribueâ un caracteá re humique, et ceux de type A aá qui on a attribueâ un caracteá re fulvique plus marqueâ. Cette deâ nomination est baseâ e sur la reâ tention preâ feâ rentielle des uorophores de type C par le seuil de coupure de 5 kda, et qui sont donc globalement de plus haut poids moleâ culaire que les composeâ s de type A; mais aussi sur leurs proprieâ teâ s spectroscopiques, photochimiques et complexantes vis aá vis du cuivre. La diminution de r a,c apreá s un ajout de cuivre, con rme la plus forte sensibiliteâ des moleâ cules de type fulvique aá la complexation par le cuivre. Les expeâ riences d'irradiation par des rayonnements UV meneâ es sur les fractions concentreâ es par UFTS montrent eâ galement que les substances de type

9 Fluorescence 3D de la matieá re organique 1531 Fig. 7. MEEF pour une eau noire (7a) et une eau blanche (7b). EEM contour plot for a black water (7a) and a white water (7b).)

10 1532 S. Mounier et al. Fig. 8. Rapport r A,C =I A /I C en fonction des fractions (type eaux blanches ``vide'', type eaux noires ``plein'') aá ph = bassin amazonien (Coble, 1996), ÐÐÐ substances humiques (Coble, 1996), w = particulaire, q = colloõè dal 100 kda, r = colloõè dal 5 kda, r = dissous. Dependence of r A,C ratio on the UFTS fraction at ph = Amazon basin (Coble, 1996), ÐÐÐ humic substances (Coble, 1996), w = particulate, q = colloidal 100 kda, r = colloidal 5 kda, y = dissolved.) humique (C) sont plus sensibles aá la photodeâ gradation que celles de type fulvique (A). REFERENCES Benamou C., Richou M., Benaim J. Y., Loussert A., Bartholin F. and Richou J. (1994) Laser-induced uorescence of marine sedimentary interstitial dissolved organic matter. Mar. Chem. 46, 7±23. Bowman W. D. and Demas J. N. (1976) Ferrioxalate actinometry. A warning on its correct use. J. Phys. Chem. 80, 2434±2435. Braun A. M., Maurette M. T. and Oliveros E. (1986) Technologie Photochimique. Lausane. Buesseler K. O., Bauer J. E., Chen R. F., Eglinton T. I., Gustafsson O., Landing W., Mopper K., Moran S. B., Santschi P. H., VernonClark R., Wells M. L. (1996) An intercomparison of cross- ow techniques used for sampling marine colloids: Overview and organic carbon results. Mar. Chem. 55, 1±31. Bu e J., Deladoey P. and Haerdi W. (1978) The use of ultra ltration for the separation and fractionation of organic ligands in fresh waters. Anal. Chim. Acta 101, 339±357. Cabaniss S. E. (1992) Synchronous uorescence spectra of metal fulvic acid complex. Environ. Sci. Technol. 26(6), 1133±1139. Cabaniss S. E. and Shuman M. S. (1986) Combined ion selective electrode and uorescence quenching detection for copper-dissolved organic matter titrations. Anal. Chem. 58, 398±401. Cathalifaud G., Ayele J. and Mazet M. (1997) Etudes de la complexation des ions aluminium par des moleâ cules organiques: constantes et stoechiomeâ trie des complexes. Application au traitement de potabilisation des eaux. Water Res. 31(4), 689±698. Coble G. P. (1996) Characterization of marine and terrestrial DOM in seawater using excitation-emission matrix spectroscopy. Mar. Chem. 51, 325±346. De Souza-Sierra M. M., Donard O. F. X., Lamotte M. and Belin C. (1994) Fluorescence spectroscopy of coastal and marine waters. Mar. Chem. 47, 127±144. Furch K. (1984) Water chemistry of the Amazon basin: The distribution of chemical elements among freshwater. In The Amazon Limnology and Landscape Ecology of a Mighty Tropical River and its Basin, Vol. 6, pp. 167± 199. Hart B. T. (1981) Trace metal complexing capacity of natural waters: a review. Environ. Technol. Lett. 2, 95± 110. Hatchard C. G. and Parker C. A. (1956) A new sensitive chemical actinometer. II. Potassiumferrioxalate as a standard actinometer. Proc. R. Soc. Ser. A: 235, 518± 536. Klinkhammer G. P., Chin C. S., Wilson C., Rudnicki M. D. and German C. R. (1997) Distribution of dissolved manganese and uorescent dissolved organic matter in the Columbia River estuary and plume as determined by in situ measurement. Mar. Chem. 56, 1±14. Kouassi A. M. and Zika R. G. (1990) Light-induced alteration of the photophysical properties of disslved organic matter in seawater. Part I. Photoreversible properties of natural water uorescence. Netherlands J. Sea Res. 27(1), 25±32. Kuma K., Nakabayashi S., Suzuki Y., Kudo I. and Matsunaga K. (1992) Photo-reduction of Fe(III) by dissolved organic substances and existence of Fe(II) in seawater during spring blooms. Mar. Chem. 37, 15±27. Martin-Mousset B., Croue J. P., Lefebvre E. and Legube B. (1997) Distribution and characterization of the dissolved organic matter of surfaces waters. Water Res. 31(3), 541±553. Mo ett J. W. and Zika R. G. (1987) Photochemistry of copper complexes in sea water. In Photochemistry of Copper Complexes, pp. 116±130. Plankey B. J. and Patterson H. H. (1987) Kinetics of aluminium±fulvic acid complexation in acidic waters. Environ. Sci. Technol. 21, 595±601. Powell R. T., Landing W. M. and Bauer J. E. (1996) Colloidal metals, organic carbon and nitrogen in a southeastern U.S. estuary. Mar. Chem. 55, 165±176. Ryan D. K. and Weber J. H. (1982) Fluorescence quenching titration for determination of complexing capacities and stability constant of fulvic acid. Anal. Chem. 54, 986±990.

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