Mieux comprendre les fluorochromes pour la microscopie confocale

Dimension: px
Commencer à balayer dès la page:

Download "Mieux comprendre les fluorochromes pour la microscopie confocale"

Transcription

1 Spencer BROWN, Dynamique de la compartimentation cellulaire, Béatrice SATIAT-JEUNEMAITRE, Olivier CATRICE, Institut des Sciences du Végétal, CNRS UPR2355, Gif-sur-Yvette et Susanne BOLTE, Marie-Noëlle SOLER IFR87 " La Plante et son environnement et Christel TALBOT, Plate-forme d'imagerie Cellulaire de l'institut de Neurosciences, Université de Bordeaux II Mieux comprendre les fluorochromes pour la microscopie confocale Processus physique et ses implications : spectres Autres propriétés des fluorochromes L environnement Montage de l échantillon Recouvrement des spectres d émission Choix d une sonde fluorescente Chargement, quantification, chromatisme, Techniques ratiométriques Les protéines fluorescentes Susanne Bolte Brown, S., Bolte, S., Satiat-Jeunemaître B. (2007) Tracking Gene Expression in Plant Cells: Microscopy and associated bio-imaging techniques. Chapter 13 in: Functional Genomics: From Sequence to Function in Plants, JF Morot-Gaudry, P Lea et JF Briat (eds) Science Publishers, UK, pp

2 Un marqueur pour chaque compartiment, ou pour chaque fonction? bisbenzimide Hoechst endosomes LY lissamine-rhodamine-dextran AF-actin DiIC1(5) DeBiasio et al. 1987

3 intensité, spectre, durée de vie de la fluorescence, anisotropie d émission fluoro-chromasia Acridine Orange

4 Aniline Blue : ß 1-3 glucanes insolubles Calcofluor White sur algues avec phycobiliprotéines

5 N Peroxisomes Nuclear membrane Tonoplast Vac Endoplasmic reticulum (ER+RER) Golgi stacks Plasma membrane Chloroplastes Mitochondria + cytoskeleton : actin, tubulin, etc. Cell Wall

6 GFP cible mitochondria autofluorescence de chlorophylle DsRed cible mitochondria GFP cible plastes Ian Small, INRA Evry

7 Cytoskeletal organisation in Medicago T. Hanh Trinh

8 LUMINESCENCE PHOTO-LUMINESCENCE CHIMI-LUMINESCENCE BIO-LUMINESCENCE Fluorescence Phosphorescence THERMO-LUMINESCENCE court tau τ f long ELECTRO-LUMINESCENCE singulet triplet etc Bernard VALEUR (2002, 2004) ; Cachan & CNAM

9 Diagramme simplifié des niveaux d énergie d une molécule polyatomique Jablonski energy diagram S 2 Niveaux d énergie niveau virtuel Raman Stokes & anti-stokes (inélastique, sans absorption) singulet T 1 S 0 phosphorescence S 1 cis absorption ~ps fluorescence ~fs ~ns ci vi v0 quenching de fluorescence 10-9 à10-7 s transfert d énergie à10-4 s S 1 cis phosphorescence 10-8 à10-2 s S 0 T 1 triplet

10 TPA : two-photon absorption l absorption quasi-simultanée (fs) de deux photons de faible énergie. Les spectres d excitation biphotonique ressemblent à peu près aux spectres conventionnels d absorption décalés d un facteur 2x sur l axe λ (

11 OH Spectre d absorption et d émission de l iso-thiocyanate de fluorescéine et de la chlorophylle in situ O N C S COOH O fluorescèine ITC PM 389 dalton acide faible pka ~6,4 Q 0,85 ε M -1. cm -1 Propriétés: absorptivité moyenne Absorbance (DO, ) Intensité (UA, ) bon rendement quantique peu encombrante divers analogues disponible iso-thiocyanate de fluorescéine déplacement de Stokes excitation Chlorella vulgaris émission Longueur d onde (nm) Intensité (UA, ) Intensité (UA, ) Figure 2.

12 Diagramme simplifié des niveaux d énergie d une molécule polyatomique Jablonski energy diagram S 2 T 1 Niveaux d énergie S 0 transfert d énergie à10-4 s S 1 cis S 0 T 1 phosphorescence 10-8 à10-2 s Raman Stokes & anti-stokes S 1 cis ~ps phosphorescence fluorescence quenching de fluorescence 10-9 à10-7 s ci absorption ~fs ~ns

13 Spectre d absorption et d émission de l iso-thiocyanate de fluorescéine et du propidium OH O O COOH N C S Intensité (UA, ) 1 iso-thiocyanate de fluorescéine excitation émission Intensité (UA, ) 0 NH 2 NH 2 propidium N + C 2 H 3 (CH 2 ) N CH 3 C 2 H 5 Intensité (UA, ) Longueur d onde (nm) Intensité (UA, )

14 Spectres et «déplacement de Stokes» Longueur d onde λ du maximum d excitation < λ du maximum d émission Déplacement de Stokes = la distance entre les maxima d'excitation et d'émission Exemple: pour la fluorescéine, respectivement 495 nm et 521 nm, déplacement de Stokes = 26 nm. Des complexes offrent un déplacement de Stokes important vis. chlorophylle, iodure de propidium, ECD, Red670, Tricolor, Cychrome et les Nano-particules colloïdales Quantum Dots et les particules à émission anti-stokes upconverted luminescence nanocrystals Wu S, Han G, Milliron DJ, Aloni S, Altoe V, Talapin DV, Cohen BE, Schuck PJ. (2009) Non-blinking and photostable upconverted luminescence from single lanthanide-doped nanocrystals. PNAS Early Edition, July 2009

15 phi Rendement quantique φ f = rapport du nombre total de photons émis dans tout le spectre d'émission de fluorescence au nombre de photons reçus et absorbés dans la zone spectrale d'excitation rendement quantique, I f = φ f I a I f émettant (f) la lumière et I a = nombre de quanta par unité de temps et de surface recevant (a) et ( φ f 0,85 pour la fluorescéine )

16 Coefficient d'extinction, ε, ou absorbance spécifique = absorbtivité molaire Sa valeur peut constituer un critère pour le choix des colorants ; plus ε est grand, plus la fluorescence sera élevée à intensité lumineuse incidente égale. ( Pour la fluorescéine à 488 nm, ε = 8 x 10 4 M -1. cm -1 ) Avec une absorbance spécifique très réduite ( ε.c.l < 0,02 ), on peut linéariser la fonction exponentielle, avec Log10 2,3 I f 2,3 φ f. I o. ε.c.l C, concentration du fluorophore I f, intensité d'émission

17 " Brillance " La "brillance" est proportionnelle à ε et φ ε φ «brillance» ( M -1. cm -1 ) ( unités arbitraires ) Fluorescéine , Cyanine , EYFP , B-phycoérythrine , Tryptophan ,1 600 Quantum Dot , Quantum Dot , (à 490 nm) Pour Non Linear Optics: Action cross section = absorption cross section (spécifique de NLO) multiplié par le rendement quantique 1 Göppert-Mayer = cm 4. s

18 tau Durée de vie du singulet excité le plus bas = la constante de temps de déclin de fluorescence, τ f τ f = φ f. τ N τ N, constante de temps intrinsèque de l'état excité (en considérant seulement la fluorescence). (τ f 4 ns pour la fluorescéine dans l'eau) φ F, rendement quantique Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy, FLIM phi

19 Transfert d'énergie par résonance (loi de Förster) Förster (Fluorescence) Resonant Energy Transfer = FRET Chevauchement du spectre d'émission d un donneur d'énergie et du spectre d absorption d un accepteur d'énergie : Excitation du donneur et émission de l'accepteur k ET = 1 / τ D. ( R o / R ) 6 k ET, constante de cinétique pour resonant energy transfer, RET τ D, durée de vie du donneur R o, constante de la distance critique (en nm) pour un couple donneur accepteur R, distance moyenne effective (en nm) entre les centres des dipôles donneur accepteur. Donc, le transfert d'énergie par résonance non radiatif est proportionnel à R -6. Notons que des transferts d'énergie sont importants dans des complexes chlorophylliens. L occurrence de FRET réduit le durée de vie apparente du donneur, τ D.

20 Intra-molecular FRET Violet or UV excited green to blue B-lactamase substrate Knapp et al. Cytometry (2003) Part A 51A: Aurora Company, Roger Tsien

21 Mesure de calcium avec le Biosenseur CAMELEON: CFP Calmodulin M13 YFP Allen et al., Ca 2+ -Ca 2+ Changement conformationnel 440 nm 480 nm FRET YFP 530 nm CFP 4Ca nm Les applications de la microscopie confocale en biologie végétale/susanne Bolte IFR87

22 caspase3 indicator CFP-DEVD-YFP in staurosporine-treated HeLa cells caspase3 X CFP-DEVD-YFP ex 430 nm, em nm ex 430 nm, em nm DAPI ex 357 nm, em nm 1.46 YFP/CFP 0.83 Intra-molecular FRET Mark JEPSON & Darran CLEMENTS, Bristol Univ. The Biochemist, June 2004, 30-34

23 Resonant Energy Transfer RET Förster (Fluorescence) Resonant Energy Transfer FRET Sonde permeante fluorescente bleu/verte pour l activité β lactamase. sondes calciques Cameleon, typiquement CFP-YFP Biosensors e.g. protéines périplasmiques fusionnées avec CFP/YFP Fehr (2004) PCR quantitative, un fluorophore et un quencher sont placés à proximité l'un de l'autre sur un même oligonucléotide Molecular Beacons ( balises moléculaires ) L'oligonucléotide libre forme par auto-hybridation une épingle à cheveux qui amène le fluorophore à proximité du quencher. Lors de l'hybridation avec un autre fragment d'adn, cette compétition amène une linéarisation de l'oligonucléotide, et le fluorophore est alors éloigné du quencher. «sondes FRET d'hybridation» homo-fret est dépolarisant GFP/GFP (Grandjean, Versailles) FRET inter-moléculaire FITC/TRITC ; CFP/YFP ; GFP/mCHERRY ; GFP/Cy3.18 Bioluminescence Resonant Energy Transfer BRET et CRET BRET2 utilise Renilla luciferase sur coelentérazine (DeepBlueC) qui transfert à GFP2. Black Hole Quenchers, Dabcyl et TAMRA (Qiagen Operon Product Guide 2002,

24 Autres propriétés Température : généralement l intensité augmente quand la température baisse Polarisation : absorption favorable si champs électromagnétique du photon // dipôle d absorption ; ensuite émission isotrope ou anisotrope, d après les cinétiques de rotation. par exemple, un fluorophore cylindrique dans un membrane Photostabilité : Perte de fluorescence (fading): fluorescéine versus rhodamine ; Alexas ; QuantumDots FRAP (Fluorescence Recovery/Redistribution After Photobleaching) FMI-43, FM4-64 styryl dyes, membranaires Rouge Neutre (Neutral Red; abs max 533, pka 6.7) Photo-activable Photo-convertible PA-GFP inductible par 413 nm Kaede, Eos, Dendra ; ou DRONPA réversible L importance donc du milieu de montage

25 L environnement Un déplacement d absorption vers des longueurs d onde courte se dit hypsochromique. Un déplacement d absorption vers des longueurs d onde longue se dit bathochromique. effet Solvant Nile Red (Rouge de Nil) : jaune triglycérides neutres ; rouge phospholipides polaires Nile Blue : jaunes lipides ; rouge protéines NBD (nitrobenzoxadiazole) Q est 10 fois moins dans un environnement aqueux : insertion membranaire critique ph - FITC pka 6,4 polarité - BCECF-AM pka 6,98 - EGFP pka 5,5 - EYFP pka 6,9 Ions métalliques mithramycine et chromomycine Mg 2+ essentiel Hoechst bromure quench sondes chélatrices de calcium Mn 2+ quench YFP chlore quench potentiel électrique liaison hydrogène ions Fluorescence moléculaire ph quenchers pression température viscosité Concentration ou agrégation carboxy-fluorescéine : non fluorescent à 100 mm JC-1 formation de J-agrégats, alors I rouge /I vert reflète l hyperpolarisation Bernard VALEUR (2002), CNAM Figure 3.

26 Protoplast from suspension cells of Arabidopsis in protoplasts & cells imagerie in CHAPS micelles spectrofluorométrie bathochrome base de données Transmission DIC hypsochrome Amphiphilic amino-styrene dye FM4-64 : emission spectrum Fluorescence Bolte S, Talbot C, Boutte Y, Catrice O, Read ND, Satiat-Jeunemaitre B (2004) FM-dyes as experimental probes for dissecting vesicle trafficking in living plant cells. J. Microscopy, 214,

27 Quenching Quenching dynamique Quenching statique RET : transfert d énergie à distance et bien sûr la photo-destruction

28 How many Photons? Consider 1 mw of power at 488 nm focused to a Gaussian spot whose radius at 1/e 2 intensity is 0.25 μm via a 1.25 NA objective The peak intensity at the center will be 10-3 W [π.(0.25 x 10-4 cm) 2 ] = 5.1 x 10 5 W/cm 2 or 1.25 x photons/(cm 2 sec -1 ) At this power, FITC would have 63% of its molecules in an excited state and 37% in ground state at any one time J. Paul Robinson, Purdue University Cytometry Laboratories

29 Photobleaching example FITC : At 4.4 x photons cm -2 sec -1 FITC bleaches with a quantum efficiency Q b of 3 x 10-5 Therefore FITC would be bleaching with a rate constant of 4.2 x 10 3 sec -1 so 37% of the molecules would remain after 240 µsec of irradiation. In a single plane, 16 scans would cause 6-50% bleaching J. Paul Robinson, Purdue University Cytometry Laboratories

30 transparence indexe de réfraction stabilité Milieu de montage respect des structures et volumes viscosité osmolarité ph (pka) ions antioxydant(s) pièges à radicaux libres (DABCO, etc.) et aux composés phénoliques (PVP) permanence On stocke ses préparations fixées à 4 C. Pour cellules vivantes : quencheurs de radicaux libres tel caroténoïdes (50 mm crocétine ou etretinate) ; ascorbate, imidazole, histidine, cystéamine, glutathion réduite, Trolox (analogue de vitamine E) voire notre base : Milieu de montage J. Paul Robinson, Purdue University Cytometry Laboratories

31 Maîtriser les Indices de Réfraction perdu n = 1.52 Objectifs n = 1.5 n = 1.52 Huile Air n = 1.0 Eau n= 1.33 n=1.52 Lamelle n = 1.52 n=1.52 Specimen Eau n= 1.33

32 Quel choix de fluorochromes?! Le marquage des cellules par des fluorochromes permet d'accéder à des informations arbitrairement classées en deux catégories - les paramètres structuraux - les paramètres fonctionnels M-H Ratinaud

33 hybridation in situ : réflectance sur l argent avec autofluorescence tissulaire nodule de Medicago : Fugier et Crespi (1994)

34 Glucuronidase report assessed by confocal microscopy develop the GUS reaction only weakly ; chlorhydrate ; fix ; gomme arabique Epi-reflectance confocal image (blue) superposed upon DIC transmission image A tissue-specific promotor of the vegetative apical meristem in Arabidopsis (200 images with z = 0.2 µm) Nathalie Glab and Séverine Domenichini, IBP, CNRS, UMR8618, Orsay

35 Autofluorescence chez la betterave et le pois modifié de Cerovic et al, 1999 phenylalanine tyrosine, tryptophan NAD(P)H, acide férulique, coumarines, alcaloïdes flavines, FAD, FMN chlorophylles, porphyrines (hème), rhodopsine en IR : matériaux phycobiliprotéines

36 Excitation UV sur le plan d une coupe transversale de feuille de Daphniphyllum macropodum et si on irradie par l épiderme en UV, vis, IR? coumarines phénoliques chlorophylle flavines (lignine) Chlorophylle comme sonde pour apprécier les polyphénoles d après leur effet d écran Zoran Cerovic Cerovic et al, 1999 ; Meyer et al Equipe de Biospectroscopie Végétale, Laboratoire d'ecologie Systématique et Evolution (UMR 8079), Université Paris-Sud 11

37 broad bean rye rye NH 3 Naturstoffreagenz A spruce Hutzler P, Fischbach R, Heller W, Jungblut TP, Reuber S, Schmitz R, Veit M., Weissenbo G, Schnitzler JP (1998) Tissue localization of phenolic compounds in plants by confocal laser scanning microscopy. J. Exp Bot., 49,

38 Plastids of live mesophyll of Commelina communis, with 1200 nm excitation THG 400 nm SHG 600 Biphoton Overlay Third Harmonic Second Harmonic autofluorescence Generation Generation des éléments contrastants complémentaires P-C Cheng, National Taiwan University, Taipei. Figure 36 in Feijo, J.A., Moreno, N Imaging plant cells by two-photon excitation. Protoplasma, 22, 1-32

39 Action cross section = absorption cross section multiplied by the fluorescence quantum yield 1 Göppert-Mayer = cm 4. s Fig. 1. Two-photon action cross sections and emission spectra from a basis set of biological molecules that contribute much of the intracellular 2PE intrinsic fluorescence. (a). In buffered (ph 7.2) saline solution, except retinol and cholecalciferol (vit D), which were measured in EtOH. Riboflavin, cholecalciferol, and NADH were measured at 100 µm; retinol, folic acid, phylloquinone, pyridoxine, and nicotinamide were measured at 500 µm. (b) Emission spectra of the compounds shown in a. Zipfel WR, Williams RM, Christie R, Yu Nikitin A, Hyman BT, Webb WW (2003) Live tissue intrinsic emission microscopy using multiphoton-excited native fluorescence and second harmonic generation. PNAS, 100,

40 Aspects spectraux Ratio N*/T* 485/585 nm Intensity Andrey S. Klymchenko A S, Duportail G, Mély Y, Demchenko A P (2003) Ultrasensitive two-color fluorescence probes for dipole potential in phospholipid membranes. PNAS, 100: Fig. 5. Response in emission spectra of F8N1S and PPZ8 to variations of the dipole potential in THP-1 cell plasma membrane produced by the addition of 6-KC (5, 10, 15, 20, 30, 40, and 50 µm). ψ d was modified by the addition of 6-ketocholestanol 10, 20, and 40 µm. Spectra normalized at the T* band for PPZ8 and at the N* band for F8N1S. Dotted line upper panel: addition of 50 µm cholesterol.

41 Exemples de marqueurs fluorescents utilisés en biologie cellulaire et moléculaire modifié d'après Kasten dans Mason (1999) Fluorescent and Luminescent Probes for Biological Activity. Academic Press, Londres (2è éd). Wavelength (nm) Name Excitation Emission Applications Immunocytochemical fluorophores, conjugates and lectins Tracers for various proteins, receptors, mono- and polysaccharides Alexa Fluor family 350, 430, 488, 532, 546, 568, 594, 633, 647, 660, 680 Allophycocyanin (AP) Allophycocyanin cross-linked (AP-XL) AMCA (7-amino-4- methylcoumarin-3-acetic acid) Bodipy (borondipyromethene difluoride dye) CT-120 (coumarin 120 thiolactone) CT-339 (coumarin 330 thiolactone) Coumarin Cyanine incompatible avec VectaShield Cyanine , ε Cy3 de biopuces Cyanine ε Cyanine ε Cy5 de biopuces Cyanine ε Cyanine ε Dimethylfluorescein DTAF (5-(4 6-dichloro- triazinyl) aminofluorescein) Eosin-5-isothiocyanate Erythrosin-5-isothiocyanate FITC(fluorescein-5- isothiocyanate) Tableau 6.

42 Faites la différence! = Cy3.18 https://www.omegafilters.com/

43 Quelques fluorochromes utilisés en microscopie confocale - immunofluorescence : FITC, TRITC, lissamine rhodamine, Texas Red, Cy3.5, Cy5.5, Alexa Fluors 488, 568, ADN : iodure de propidium, YOYO, YOPRO, SYTO16, chromomycine, mithramycine; DAPI, Hoechst, DRAQ5, TOTO3, TOPRO3 (oligos Cy3.18, Cy5.18) - mitochondie : sensible au potentiel membranaire: nm Rhodamine 123, DiOC 6 (3), DiOC 6 (5), DiOC 7 (3), JC-1, MitoTracker Red CMXRos (post-fixation possible) ; NAO (peu sensible potentiel) - membranes : Styrenes FM1-43, FM4-64, fusions-gfp, divers anticorps de surface - Viabilité : FDA, exclusion d iodure de propidium, morphologie, avec DIC - réticulum endoplasmique: (µm non spécifique) DiOC 6 (5), GFP-HDEL - appareil de Golgi : GFP-taggée, anticorps, NBD-C 6 -ceramide (pas pour végétaux) - dépendance envers le ph : carboxy-snarf-1, BCECF - dépendance envers le calcium : Fluo-3 ou -4 (± FF), FuraRed, CalciGreen, Indo-1, Cameleon -divers : LysoTracker, Acridine Orange, Neutral Red, Lucifer Yellow, chlorophylle, - Protéines (Auto)fluorescentes Tableau 3.

44 Une famille d excellents fluorophores pour marquer des protéines, anticorps secondaires, etc Fluorophore Absorption* (nm) Emission* (nm) Couleur Coefficient d extinction ( M -1. cm -1 ) AlexaFluor Bleu AlexaFluor Violet AlexaFluor Jaune-vert AlexaFluor Vert AlexaFluor Jaune AlexaFluor Orange AlexaFluor Jaune-orange AlexaFluor Orange-rouge AlexaFluor Rouge AlexaFluor Rouge AlexaFluor Rouge AlexaFluor Rouge AlexaFluor Rouge lointain AlexaFluor Rouge lointain AlexaFluor Rouge lointain AlexaFluor Rouge lointain AlexaFluor Infra-rouge proche *maximum approximatif d absorption et d émission Molecular Probes, Inc

45 Several laser options for microscopy Krypton/Argon 60 mw démodé Argon Ion 100 mw Argon Ion 5W (UV/Vis) refroidi à eau Blue Laser Diode Helium Cadmium Helium Néon-Green Diode Pumped Solid State (DPSS561) Helium Néon Orange Helium Néon-Red Laser blanc *488 nm (15 mw), 568 nm (15 mw) & 647 nm (15 mw) 457 nm (6 mw), 488 nm (40 mw) & 514 nm (40 mw) nm (50 mw), etc. 405 nm ( mw) 442 nm (80 mw) 543 nm (2 mw) 561 nm (50 mw) 595 nm (3 mw) 633 nm (10 mw) nm Accordable fs for multi-photon nm (1 W) Ytterbium fs with spectral selection nm (45%) *le rapport entre les différentes raies a tendance à se dégrader avec le temps Tableau 4.

46 Figure 6. Spectres normalisés d absorbance et d émission Recouvrement des spectres d émission!!! Absorbance relative FITC PE TX Red Emission : Fluorescence relative FITC PE TX Red BP 530 BP 580 BP Longueur d onde (nm) FITC = isothiocyanate de fluorescéine PE = Phycoérythrine TX Red = Texas Red

47 Acquisitions simultanées UV ou violet 405 nm HOECHST nm Alexa Fluor 488 Alexa Fluor , 561, 568 nm DIC Paramecium; Anne Fleury, UPS, Orsay

48 The cross-talk problem Acquisitions simultanées Lasers 488 and UV Acquisitions séquentielles Laser 488 then UV

49 AOTF : Acousto Optical Tunable Filter filtre opto-acoustique accordable Cristal TeO 2 Absorbeur lumière incidente I 1 raie diffractée ordre 1 Transducteur Radio-fréquences I 0 raie diffractée ordre -1 Temps de réponse rapide : 1-2 µs Modulation continue entre 0 95 % Effet bloquant fort : T < 10-5 Accordable pour de nouvelles configurations, et multilignes Robuste Brown et al. (2007)

50 AOBS: Acousto-Optical Beam Splitter change in 2 µs AOBS versus Double Dichroic 488/ nm Transmission % filtre dichroïc classique versus AOBS

51 Tableau 2. ±diffusion exemple, iodure de propidium ne diffuse qu à travers une membrane dégradée ; exclus par une membrane intacte lipophilicité Nile Red, DPH (di-phenyl-hexatriéne) ; DiIC 18 (3) sur membranes neuronales lipophile & polaire amphiphile amphiphile avec charge délocalisée base faible acide faible dérivés estérifiés = ancrage: TMA-DPH (tetra-méthyl-dph), FM1-43, FM4-64 (amino-styryls) bisbenzimide Hoechst (perméant) versus Hoechst (non perméant) exemples avec charges positives, DiOC 6 (3), JC-1, Rhodamine123. Vers la mitochondrie, leurs formes protonées seront captées à l'intérieur électronégatif de cet organite, d après l équation simplifié de Nernst : distribution d une molécule perméante de part et d autre d une membrane chargée V(mV) V = -61,5 log ( [M + ] i / [M + ] e ) soit, -61 mv vaut 10x concentration. exemple, Rouge neutre ou une alcaloïde s accumulent dans un compartiment acide comme la vacuole (piégée par protonation), d après l équation de Waddel & Butler : pour une base faible perméante dans un système à deux compartiments: i, intérieur et e, externe, alors C i / C e = 10pHe - phi soit, Δ1 ph vaut 10x concentration. exemple, Fluorescéine cytosolique s accumule dans un compartiment alcalin (chloroplaste) par son état dissocié et chargé Δ1 ph vaut 10x concentration. fluorescéine di-acétate, assez lipophiles pour traverser une membrane. On compte ensuite sur des estérases cellulaires pour libérer le composé actif sur place.

52 Quelques exemples des composés dérivés de la fluorescéine (1) HO O O HO O O O O CH 3 -C-O O O-C-CH 3 COO - H + COO - H + COO - H + fluorescéine N C S iso-thiocyanate de fluorescéine (FITC) di-acétate de fluorescéine (FDA) - Excitation maximum nm - Emission maximum 521 nm - rendement quantique 0,6 à 0,9 - pka 6,3; acide faible - largement imperméable à la membrane à ph >7 - Réagit avec les amines, sert donc pour étiqueter des protéines - quasi non fluorescent - perméant aux membranes - estérases cellulaires libèrent la fluorescéine acide

53 Quelques exemples des composés dérivés de la fluorescéine (2) O O CH 3 -C-O O O-C-CH 3 O O O O O Cl H Cl COO - H + CH 3 -C-O O-C-CH 3 O R-OOC R-O O O-R COO-R COO - H + R-OOC O di-acétate de 5-carboxyfluorescéine (CFDA) di-acétate de 2,7 -dichlorofluorescin (DCFH-DA) 2,7 -bis(carboxyethyl) -5(6)-carboxyfluorescéine, penta-acétoxyméthyl ester (BCECF-AM) - analogue à la FDA - lactone perméante - et le produit carboxyfluorescéine (pka 6,4) est mieux retenu dans la cellule - analogue à la FDA, réduite - les estérases libèrent un produit non fluorescent qui au cours d une activité cellulaire peroxydasique, devient fluorescent - analogue au FDA - le produit BCECF, avec pka 6,97 et une charge nette -4 à -5 est bien retenu dans la cellule et la dépendance de sa fluorescence sur le ph permet son emploi comme sonde de ph cytoplasmique

54 Perméation, libération, activation O CH 3 -C-O Cl O H O O-C-CH 3 Cl COO - H + Di-acétate de 2,7 -dichlorofluorescin (DCFH-DA) Membrane cellulaire O O CH 3 -C-O O O-C-CH 3 Cl H Cl COO - H + Désacétylation intracellulaire par des estérases HO O OH HO O OH Cl H Cl COO - H + + H 2 O 2 (+ peroxydase) Cl Cl COO - H + 2,7 -dichlorofluorescin (non fluorescent) 2,7 -dichlorofluorescein (fluorescent)

55 SNAP-tag, CLIP-tag 20 kda SNAP-tag petit réactif, éventuellement perméant et fluorescent Ozyme pour SNAP : X-Benzylguanine ; pour CLIP : X-Benzylcytosine

56 Imaging DNA Synthesis Click-iT EdU (Invitrogen) EdU (5-ethynyl-2'-deoxyuridine) analogue de la thymidine Non-radioactive AlexaFluor azide No DNA denaturation required Simplified protocol Small molecule detection Multiplex compatible, including Other antibodies Dyes for cell cycle analysis voir aussi l utilisation d anticorps contre bromo-deoxyuridine chloro-deoxyuridine iodo-deoxyuridine Altered Quiescent Centre cell properties in ccs52a2 mutant roots of A. thaliana. Vanstraelen et al. (2009) PNAS

57 La quantification toute une chaine! Absorption : Loi de Beer-Lambert I a = I o -I t = I o ( ε.c.l ) qui se simplifie à : I f 2,3 φ f. Io. ε. C. l I o, intensité lumineuse incidente I t, intensité lumineuse transmise C, concentration de la molécule absorbante, en mol.l -1 (M) l, trajet optique, en cm I f, intensité d émission

58 iso(s)beste Figure 4 : Spectres d'émission de fluorescence dépendant du ph, de la sonde ratiométrique carboxy-snarf-1, pour différentes excitations 488 (A), 514 (B), 534 (C). (Molecular Probes, Invitrogen)

59 Spectre d émission de fluorescence du FLUO-3 et de Fura-Red microinjectés ensemble

60 J-aggregate-forming dye JC-1 (un carbocyanine) seuillage, débruitage, puis ImgRatio = Img1 / Img2 = une cartographie de la potentiel Nernst Img1 J-aggregates émission 585 nm Img2 monoméric émission 520 nm notre perception Chen & Smiley

61 Anatomy of a quantum dot Michalet, X, Pinaud, F, Bentolila LA, Tsay J M, Doose S, Li J J, Sundaresan G, Wu A M, Gambhir S S, Weiss S (2005) Quantum dots for live cells, in vivo imaging, and diagnostics. Science 307: Violet

62 Dynamiques de la molécule unique : Single Particle Imaging or Tracking quantum dots = boîtes quantiques colloïdales Diffusion dynamics of glycine receptors revealed by single-quantum dot tracking. Dahan M., Triller A. (2003) Science 302: 442

63 afin de réduire la taille du complexe des boîtes quantiques colloïdales motif AP, puis biotine lyase : Howarth et al. 2005

64 On s imagine d ordinaire que rien n est plus aisé que de faire des expériences; et même des Savants du premier ordre ( ) ont traité cette occupation de frivole et de puérile. Cependant, j ose le dire, elle est d une difficulté infinie ; elle demande beaucoup d art, beaucoup de finesse et de sagacité d esprit. Pierre VAN MUSSENBROEK, 1769 (cité dans Valeur 2004) Marije Scholte, ISV, Gif

CELLULAIRE. FORMATION pour le LBFA

CELLULAIRE. FORMATION pour le LBFA CYTOMÉTRIE TRIE EN FLUX ET MICROSCOPIE CONFOCALE: 2 TECHNIQUES COMPLÉMENTAIRES MENTAIRES POUR L EXPLORATION L DU FONCTIONNEMENT CELLULAIRE FORMATION pour le LBFA Cécile COTTET 2006 3 sessions : I- Pré

Plus en détail

Mieux comprendre les fluorochromes pour la microscopie

Mieux comprendre les fluorochromes pour la microscopie La Microscopie confocale Formation Permanente, CNRS, Gif-sur-Yvette octobre 2009 Mieux comprendre les fluorochromes pour la microscopie Spencer BRWN et Christel PUJL*, «Dynamique de la compartimentation

Plus en détail

Fluorochromes et protéines fluorescentes

Fluorochromes et protéines fluorescentes Fluorochromes et protéines fluorescentes Susanne Bolte Formation microscopie photonique CNRS 2010 Quelques rappels sur la fluorescence La fluorescence est l absorption moléculaire d énergie lumineuse à

Plus en détail

Les appareillages des Spectrométrie optique

Les appareillages des Spectrométrie optique ATELIERS DE BIOPHOTONIQUE Les appareillages des Spectrométrie optique 1. Spectroscopies optiques conventionnelles Spectrophotomètre, Spectrofluorimètre, 2. Analyse Spectrale en Microscopie de fluorescence

Plus en détail

La fluorescence, les fluorophores

La fluorescence, les fluorophores La fluorescence, les fluorophores Taille d observation et techniques de microscopies électron photon 0.1 1

Plus en détail

Microscopie Multiphotonique

Microscopie Multiphotonique Microscopie Multiphotonique Philippe Guillaud 2014 Université Pierre et Marie Curie Paris 6 Principaux problèmes rencontrés en microscopie confocale La dégradation rapide des échantillons biologiques et

Plus en détail

Microscopie Confocale. Principes de base & Applications en Biologie Cellulaire

Microscopie Confocale. Principes de base & Applications en Biologie Cellulaire Université Paris Descartes L3 - Licence Professionnelle «Industries chimiques et Pharmaceutiques Option Biotechnologie» Microscopie Confocale Principes de base & Applications en Biologie Cellulaire Bruno

Plus en détail

Photoactivatable Probes for Protein Labeling

Photoactivatable Probes for Protein Labeling Photoactivatable Probes for Protein Labeling THÈSE N O 4660 (2010) PRÉSENTÉE LE 26 MARS 2010 À LA FACULTÉ SCIENCES DE BASE LABORATOIRE D'INGÉNIERIE DES PROTÉINES PROGRAMME DOCTORAL EN CHIMIE ET GÉNIE CHIMIQUE

Plus en détail

Microscopie de fluorescence Etat de l art

Microscopie de fluorescence Etat de l art Etat de l art Bibliométrie (Web of sciences) CLSM GFP & TPE EPI-FLUORESCENCE 1 Fluorescence Diagramme de JABLONSKI S2 S1 10-12 s Excitation Eex Eem 10-9 s Émission Courtoisie de C. Spriet

Plus en détail

Microscopie de fluorescence

Microscopie de fluorescence Microscopie de fluorescence François MICHEL PhD La microscopie pour débutants (ou pas) Partie 2 Imagerie de fluorescence Ce qui vous attend (encore) Fluorescence?? Microscopie à épi-fluorescence Résolution

Plus en détail

Dr E. CHEVRET UE2.1 2013-2014. Aperçu général sur l architecture et les fonctions cellulaires

Dr E. CHEVRET UE2.1 2013-2014. Aperçu général sur l architecture et les fonctions cellulaires Aperçu général sur l architecture et les fonctions cellulaires I. Introduction II. Les microscopes 1. Le microscope optique 2. Le microscope à fluorescence 3. Le microscope confocal 4. Le microscope électronique

Plus en détail

Université Victor Segalen Bordeaux 2 UFR Science de la Vie

Université Victor Segalen Bordeaux 2 UFR Science de la Vie Université Victor Segalen Bordeaux 2 UFR Science de la Vie Licence Professionnelle «Techniques et Applications en Biologie Cellulaire et Biologie Moléculaire» Examen 2006-2007 UE1 : «Technologies en Biologie

Plus en détail

Nouvelles techniques d imagerie laser

Nouvelles techniques d imagerie laser Nouvelles techniques d imagerie laser Les chimistes utilisent depuis longtemps les interactions avec la lumière pour observer et caractériser les milieux organiques ou inorganiques. La présence, dans la

Plus en détail

Introduction à la microscopie confocale

Introduction à la microscopie confocale Introduction à la microscopie confocale Sylvette CHASSEROT-GOLAZ Unité CNRS UPR 2356, Strasbourg Principe de la microscopie confocale La microscopie confocale est l'une des percées les plus notables de

Plus en détail

Partec: l innovation en marche depuis 40 ans Principes des appareils de Cytométrie en Flux. Pascal Brunou, David Bastien Partec France

Partec: l innovation en marche depuis 40 ans Principes des appareils de Cytométrie en Flux. Pascal Brunou, David Bastien Partec France 1968 2008 Partec: l innovation en marche depuis 40 ans Principes des appareils de Cytométrie en Flux Pascal Brunou, David Bastien Partec France en Allemagne et partout dans le Monde Société basée à Münster

Plus en détail

La PCR en temps réel

La PCR en temps réel La PCR en temps réel Hôpital La Rabta Tunis 6 juin 2013 Dr Sabine Favre-Bonté Maître de Conférences, Université Claude Bernard Lyon 1 UMR CNRS 5557 Ecologie Microbienne Equipe Multi-résistance environnementale

Plus en détail

Microscopie de fluorescence

Microscopie de fluorescence Rev : 21/01/2015 Microscopie de fluorescence La microscopie pour débutants (ou pas) Partie 2 François MICHEL PhD Quelques images en fluorescence Ce qui vous attend (encore) Fluorescence?? Microscopie à

Plus en détail

Elvire Guiot. To cite this version: HAL Id: tel-00010025 https://tel.archives-ouvertes.fr/tel-00010025

Elvire Guiot. To cite this version: HAL Id: tel-00010025 https://tel.archives-ouvertes.fr/tel-00010025 microscopie de fluorescence par excitation à deux photons : application à des études de corrélations et de déclins de fluorescence en milieu biologique Elvire Guiot To cite this version: Elvire Guiot.

Plus en détail

Chapitre 02. La lumière des étoiles. Exercices :

Chapitre 02. La lumière des étoiles. Exercices : Chapitre 02 La lumière des étoiles. I- Lumière monochromatique et lumière polychromatique. )- Expérience de Newton (642 727). 2)- Expérience avec la lumière émise par un Laser. 3)- Radiation et longueur

Plus en détail

Microscopies plein champs 3D & 3D n couleurs+temps

Microscopies plein champs 3D & 3D n couleurs+temps Microscopies plein champs 3D & 3D n couleurs+temps Dr Fabrice Cordelières, IR2 CNRS Institut Curie - Section de recherche/ CNRS UMR 146 Plateforme d'imagerie Cellulaire Bâtiment 112 - Centre universitaire

Plus en détail

Revue de processus service Imagerie 1/04/2015

Revue de processus service Imagerie 1/04/2015 Revue de processus service Imagerie 1/04/2015 Réunion des utilisateurs des vidéo microscopes et apotomes ObserverZ1 colibri1 salle 7014 ImagerZ1 Apo salle 1023 Responsable Vidéo et Mécanique Brice DETAILLEUR

Plus en détail

Spectrophotométrie - Dilution 1 Dilution et facteur de dilution. 1.1 Mode opératoire :

Spectrophotométrie - Dilution 1 Dilution et facteur de dilution. 1.1 Mode opératoire : Spectrophotométrie - Dilution 1 Dilution et facteur de dilution. 1.1 Mode opératoire : 1. Prélever ml de la solution mère à la pipette jaugée. Est-ce que je sais : Mettre une propipette sur une pipette

Plus en détail

EXERCICE 2 : SUIVI CINETIQUE D UNE TRANSFORMATION PAR SPECTROPHOTOMETRIE (6 points)

EXERCICE 2 : SUIVI CINETIQUE D UNE TRANSFORMATION PAR SPECTROPHOTOMETRIE (6 points) BAC S 2011 LIBAN http://labolycee.org EXERCICE 2 : SUIVI CINETIQUE D UNE TRANSFORMATION PAR SPECTROPHOTOMETRIE (6 points) Les parties A et B sont indépendantes. A : Étude du fonctionnement d un spectrophotomètre

Plus en détail

ANALYSE SPECTRALE. monochromateur

ANALYSE SPECTRALE. monochromateur ht ANALYSE SPECTRALE Une espèce chimique est susceptible d interagir avec un rayonnement électromagnétique. L étude de l intensité du rayonnement (absorbé ou réémis) en fonction des longueurs d ode s appelle

Plus en détail

Plateau technique de cytométrie Fatima-Ezzahra L Faqihi-Olive, IE université. Alger,08/05/07 F-E L'Faqihi-Olive, IFR30 Toulouse 1

Plateau technique de cytométrie Fatima-Ezzahra L Faqihi-Olive, IE université. Alger,08/05/07 F-E L'Faqihi-Olive, IFR30 Toulouse 1 Plateau technique de cytométrie Fatima-Ezzahra L Faqihi-Olive, IE université Alger,08/05/07 F-E L'Faqihi-Olive, IFR30 Toulouse 1 Plateau technique de cytométrie Fatima-Ezzahra L Faqihi-Olive, IE université

Plus en détail

POPULATION D ADN COMPLEXE - ADN génomique ou - copie d ARNm = CDNA

POPULATION D ADN COMPLEXE - ADN génomique ou - copie d ARNm = CDNA POPULATION D ADN COMPLEXE - ADN génomique ou - copie d ARNm = CDNA Amplification spécifique Détection spécifique Clonage dans des vecteurs Amplification in vitro PCR Hybridation moléculaire - hôte cellulaire

Plus en détail

La biophotonique pour l étude de la dynamique et des interactions moléculaires dans le noyau

La biophotonique pour l étude de la dynamique et des interactions moléculaires dans le noyau Plan: Introduction: Dynamique des réseaux de régulation Cellules uniques vs ensemble de cellules La biophotonique pour l étude de la dynamique et des interactions moléculaires dans le noyau Mesure de dynamique

Plus en détail

Comprendre l Univers grâce aux messages de la lumière

Comprendre l Univers grâce aux messages de la lumière Seconde / P4 Comprendre l Univers grâce aux messages de la lumière 1/ EXPLORATION DE L UNIVERS Dans notre environnement quotidien, les dimensions, les distances sont à l échelle humaine : quelques mètres,

Plus en détail

Mesures de PAR. Densité de flux de photons utiles pour la photosynthèse

Mesures de PAR. Densité de flux de photons utiles pour la photosynthèse Densité de flux de photons utiles pour la photosynthèse Le rayonnement lumineux joue un rôle critique dans le processus biologique et chimique de la vie sur terre. Il intervient notamment dans sur les

Plus en détail

Les techniques de préparation des coupes pour les microscopies optique et électronique

Les techniques de préparation des coupes pour les microscopies optique et électronique Université Mohammed V-Agdal Faculté des Sciences de Rabat Laboratoire de Zoologie et de Biologie générale Les techniques de préparation des coupes pour les microscopies optique et électronique Histologie-Embryologie

Plus en détail

Partie Observer : Ondes et matière CHAP 04-ACT/DOC Analyse spectrale : Spectroscopies IR et RMN

Partie Observer : Ondes et matière CHAP 04-ACT/DOC Analyse spectrale : Spectroscopies IR et RMN Partie Observer : Ondes et matière CHAP 04-ACT/DOC Analyse spectrale : Spectroscopies IR et RMN Objectifs : Exploiter un spectre infrarouge pour déterminer des groupes caractéristiques Relier un spectre

Plus en détail

Chapitre II PHÉNOMÈNES RADIATIFS: PROPRIÉTÉS D EMISSION. f AB = mc 2 e 2. β 1 k(υ)dυ N

Chapitre II PHÉNOMÈNES RADIATIFS: PROPRIÉTÉS D EMISSION. f AB = mc 2 e 2. β 1 k(υ)dυ N 1 Chapitre II PHÉNOMÈNES RADIATIFS: PROPRIÉTÉS D EMISSION Compte tenu des règles de sélection une émission peut être observée si un gap d énergie important existe entre l état fondamental et un des états

Plus en détail

INSTRUMENTS DE MESURE

INSTRUMENTS DE MESURE INSTRUMENTS DE MESURE Diagnostique d impulsions lasers brèves Auto corrélateur à balayage modèle AA-10DD Compact et facile d emploi et de réglage, l auto corrélateur AA-10DD permet de mesurer des durées

Plus en détail

Dosages à réactifs marqués

Dosages à réactifs marqués Dosages à réactifs marqués Principe = réaction Ag-Ac un des deux réactifs (Ag ou Ac) est marqué par un traceur Différentes méthodes selon que le traceur est radioactif (RIA), enzymatique (EIA) ou luminescent

Plus en détail

A chaque couleur dans l'air correspond une longueur d'onde.

A chaque couleur dans l'air correspond une longueur d'onde. CC4 LA SPECTROPHOTOMÉTRIE I) POURQUOI UNE SUBSTANCE EST -ELLE COLORÉE? 1 ) La lumière blanche 2 ) Solutions colorées II)LE SPECTROPHOTOMÈTRE 1 ) Le spectrophotomètre 2 ) Facteurs dont dépend l'absorbance

Plus en détail

Imagerie biologique. CARDINET RémyR LARRAUFIE Pierre MASSUÉ Cyriac 24/09/2009

Imagerie biologique. CARDINET RémyR LARRAUFIE Pierre MASSUÉ Cyriac 24/09/2009 Imagerie biologique Etude d articles d scientifiques CARDINET RémyR LARRAUFIE Pierre MASSUÉ Cyriac 24/09/2009 Imagerie biologique Quelques éléments de biologie cellulaire Etude d article d : Limitation

Plus en détail

EXERCICE I : Où il est question de lumière (8 points) PARTIE A. Figure 2

EXERCICE I : Où il est question de lumière (8 points) PARTIE A. Figure 2 EXERCICE I : Où il est question de lumière (8 points) PARTIE A 1. Figure 2 D On observe sur l'écran un étalement du faisceau laser, perpendiculaire à la direction du fil, constitué d'une tache centrale

Plus en détail

5.5.5 Exemple d un essai immunologique

5.5.5 Exemple d un essai immunologique 5.5.5 Exemple d un essai immunologique Test de grossesse Test en forme de bâtonnet destiné à mettre en évidence l'hormone spécifique de la grossesse, la gonadotrophine chorionique humaine (hcg), une glycoprotéine.

Plus en détail

Mise en pratique : Etude de spectres

Mise en pratique : Etude de spectres Mise en pratique : Etude de spectres Introduction La nouvelle génération de spectromètre à détecteur CCD permet de réaliser n importe quel spectre en temps réel sur toute la gamme de longueur d onde. La

Plus en détail

trie en flux : Principes

trie en flux : Principes La Cytométrie trie en flux : Principes Gérald Grégori Laboratoire de Microbiologie, de Géochimie et d 'Ecologie Marines CNRS UMR 6117 163 Avenue de Luminy - Case 901- Bât TPR1, 13288 Marseille cedex 9

Plus en détail

Voir dans le nanomonde

Voir dans le nanomonde Voir dans le nanomonde Spectroscopie La lumière visible permettra-t-elle de «voir» les atomes? Fréquence micro onde Infrarouge Visible et UV Rayon X réaction des molécules rotation vibration des liaisons

Plus en détail

Correction ex feuille Etoiles-Spectres.

Correction ex feuille Etoiles-Spectres. Correction ex feuille Etoiles-Spectres. Exercice n 1 1 )Signification UV et IR UV : Ultraviolet (λ < 400 nm) IR : Infrarouge (λ > 800 nm) 2 )Domaines des longueurs d onde UV : 10 nm < λ < 400 nm IR : 800

Plus en détail

PRINCIPE MICROSCOPIE CONFOCALE

PRINCIPE MICROSCOPIE CONFOCALE PRINCIPE MICROSCOPIE CONFOCALE Un microscope confocal est un système pour lequel l'illumination et la détection sont limités à un même volume de taille réduite (1). L'image confocale (ou coupe optique)

Plus en détail

Application à l astrophysique ACTIVITE

Application à l astrophysique ACTIVITE Application à l astrophysique Seconde ACTIVITE I ) But : Le but de l activité est de donner quelques exemples d'utilisations pratiques de l analyse spectrale permettant de connaître un peu mieux les étoiles.

Plus en détail

SUIVI CINETIQUE PAR SPECTROPHOTOMETRIE (CORRECTION)

SUIVI CINETIQUE PAR SPECTROPHOTOMETRIE (CORRECTION) Terminale S CHIMIE TP n 2b (correction) 1 SUIVI CINETIQUE PAR SPECTROPHOTOMETRIE (CORRECTION) Objectifs : Déterminer l évolution de la vitesse de réaction par une méthode physique. Relier l absorbance

Plus en détail

Module d Immunologie. 2eme Année Licence Tronc Commun des Sciences de la Nature Année universitaire 2014-2015 Dr A.Ghidouche / Dr D.

Module d Immunologie. 2eme Année Licence Tronc Commun des Sciences de la Nature Année universitaire 2014-2015 Dr A.Ghidouche / Dr D. Module d Immunologie 2eme Année Licence Tronc Commun des Sciences de la Nature Année universitaire 2014-2015 Dr A.Ghidouche / Dr D.Ait-Ali Annexe : Techniques utilisée en immunologie La majorité sont des

Plus en détail

FLUORESCENCE ET TESTS FONCTIONNELS Association Française aise de Cytométrie. 18 janvier 2007

FLUORESCENCE ET TESTS FONCTIONNELS Association Française aise de Cytométrie. 18 janvier 2007 FLUORESCENCE ET TESTS FONCTIONNELS Association Française aise de Cytométrie trie Journée e Thématique 18 janvier 2007 Cécile COTTET Laboratoire de Bioénerg nergétique Fondamentale et Appliquée e - Inserm

Plus en détail

pka D UN INDICATEUR COLORE

pka D UN INDICATEUR COLORE TP SPETROPHOTOMETRIE Lycée F.BUISSON PTSI pka D UN INDIATEUR OLORE ) Principes de la spectrophotométrie La spectrophotométrie est une technique d analyse qualitative et quantitative, de substances absorbant

Plus en détail

La spectrophotométrie

La spectrophotométrie Chapitre 2 Document de cours La spectrophotométrie 1 Comment interpréter la couleur d une solution? 1.1 Décomposition de la lumière blanche En 1666, Isaac Newton réalise une expérience cruciale sur la

Plus en détail

SPECTROSCOPIE D ABSORPTION DANS L UV- VISIBLE

SPECTROSCOPIE D ABSORPTION DANS L UV- VISIBLE 18 CHAPITRE III SPECTROSCOPIE D ABSORPTION DANS L UV- VISIBLE La spectroscopie d absorption dans l UV et le visible est une méthode très commune dans les laboratoires. Elle est basée sur la propriété des

Plus en détail

Cytométrie en flux. DES de Biologie Médicale Enseignement d Immunologie ET05. Phnom Penh Septembre 2009

Cytométrie en flux. DES de Biologie Médicale Enseignement d Immunologie ET05. Phnom Penh Septembre 2009 DES de Biologie Médicale Enseignement d Immunologie ET05 Cytométrie en flux Phnom Penh Septembre 2009 Michelle Rosenzwajg Service de Biothérapies/UPMC CNRS UMR7211 INSERM U959 Pitié-Salpétrière - Paris

Plus en détail

ImageUP forma-on 2013 CYTOMETRIE EN FLUX. BD FACSVerse. BD FACSAria III

ImageUP forma-on 2013 CYTOMETRIE EN FLUX. BD FACSVerse. BD FACSAria III CYTOMETRIE EN FLUX BD FACSVerse BD FACSAria III Journée de Forma-on et Informa-on 6/11/2013 CYTOMETRIE EN FLUX Principe Applica4ons Tri Qu est que ce la cytométrie en flux? Individuelle Quan4ta4ve Qualita4ve

Plus en détail

DIFFRACTion des ondes

DIFFRACTion des ondes DIFFRACTion des ondes I DIFFRACTION DES ONDES PAR LA CUVE À ONDES Lorsqu'une onde plane traverse un trou, elle se transforme en onde circulaire. On dit que l'onde plane est diffractée par le trou. Ce phénomène

Plus en détail

ATELIER IMAGEJ. Différentes applications vous sont proposées pour apprendre à utiliser quelques fonctions d ImageJ :

ATELIER IMAGEJ. Différentes applications vous sont proposées pour apprendre à utiliser quelques fonctions d ImageJ : Différentes applications vous sont proposées pour apprendre à utiliser quelques fonctions d ImageJ : 1. ANALYSE QUANTITATIVE D UN GEL D ELECTROPHORESE... 2 2. NUMERATION DE COLONIES BACTERIENNES SUR UNE

Plus en détail

Indicateur d'unité Voyant Marche/Arrêt

Indicateur d'unité Voyant Marche/Arrêt Notice MESURACOLOR Colorimètre à DEL Réf. 22020 Indicateur d'unité Voyant Marche/Arrêt Indicateur Etalonnage Bouton Marche/Arrêt Indicateur de sélection de la longueur d'onde Indicateur de mode chronomètre

Plus en détail

Ce document a été mis en ligne par le Canopé de l académie de Bordeaux pour la Base Nationale des Sujets d Examens de l enseignement professionnel.

Ce document a été mis en ligne par le Canopé de l académie de Bordeaux pour la Base Nationale des Sujets d Examens de l enseignement professionnel. Ce document a été mis en ligne par le Canopé de l académie de Bordeaux pour la Base Nationale des Sujets d Examens de l enseignement professionnel. Ce fichier numérique ne peut être reproduit, représenté,

Plus en détail

ASEP Prérentrée 2008-2009. Histologie Générale Techniques d imagerie cellulaire Histologie Générale, Techniques d imagerie cellulaire

ASEP Prérentrée 2008-2009. Histologie Générale Techniques d imagerie cellulaire Histologie Générale, Techniques d imagerie cellulaire Histologie Générale, Techniques d imagerie cellulaire A. La cellule Par Célian BERTIN Elle est l unité fondamentale de la vie. C est la plus petite quantité de matière vivante capable de subsister à l

Plus en détail

Niveau 2 nde THEME : L UNIVERS. Programme : BO spécial n 4 du 29/04/10 L UNIVERS

Niveau 2 nde THEME : L UNIVERS. Programme : BO spécial n 4 du 29/04/10 L UNIVERS Document du professeur 1/7 Niveau 2 nde THEME : L UNIVERS Physique Chimie SPECTRES D ÉMISSION ET D ABSORPTION Programme : BO spécial n 4 du 29/04/10 L UNIVERS Les étoiles : l analyse de la lumière provenant

Plus en détail

RDP : Voir ou conduire

RDP : Voir ou conduire 1S Thème : Observer RDP : Voir ou conduire DESCRIPTIF DE SUJET DESTINE AU PROFESSEUR Objectif Compétences exigibles du B.O. Initier les élèves de première S à la démarche de résolution de problème telle

Plus en détail

Le vivant est complexe: - 30 millions de types d organismes - 100 000 protéines différentes chez l homme

Le vivant est complexe: - 30 millions de types d organismes - 100 000 protéines différentes chez l homme Introduction Le vivant est complexe: - 30 millions de types d organismes - 100 000 protéines différentes chez l homme Informatique: - stocker les données - éditer les données - analyser les données (computational

Plus en détail

Chapitre 7 Les solutions colorées

Chapitre 7 Les solutions colorées Chapitre 7 Les solutions colorées Manuel pages 114 à 127 Choix pédagogiques. Ce chapitre a pour objectif d illustrer les points suivants du programme : - dosage de solutions colorées par étalonnage ; -

Plus en détail

Séquence 9. Étudiez le chapitre 11 de physique des «Notions fondamentales» : Physique : Dispersion de la lumière

Séquence 9. Étudiez le chapitre 11 de physique des «Notions fondamentales» : Physique : Dispersion de la lumière Séquence 9 Consignes de travail Étudiez le chapitre 11 de physique des «Notions fondamentales» : Physique : Dispersion de la lumière Travaillez les cours d application de physique. Travaillez les exercices

Plus en détail

2D-Differential Differential Gel Electrophoresis & Applications en neurosciences

2D-Differential Differential Gel Electrophoresis & Applications en neurosciences 2D-Differential Differential Gel Electrophoresis & Applications en neurosciences Jean-Etienne Poirrier Centre de Neurobiologie Cellulaire et Moléculaire Centre de Recherches du Cyclotron Université de

Plus en détail

TP 2: LES SPECTRES, MESSAGES DE LA LUMIERE

TP 2: LES SPECTRES, MESSAGES DE LA LUMIERE TP 2: LES SPECTRES, MESSAGES DE LA LUMIERE OBJECTIFS : - Distinguer un spectre d émission d un spectre d absorption. - Reconnaître et interpréter un spectre d émission d origine thermique - Savoir qu un

Plus en détail

Nanovecteurslipidiques bimodaux pour l imagerie in vivo

Nanovecteurslipidiques bimodaux pour l imagerie in vivo Nanovecteurslipidiques bimodaux pour l imagerie in vivo Aurélie Jacquart 1, I. Texier-Nogues 1, F. Mittler 1, F. Navarro 1, R. Boisgard 2, F. Ponce 3, D. Camporese 4, J. Boutet 5 1 CEA-LETI, Minatec-Campus,

Plus en détail

TP fibres optiques. Laser, Matériaux, Milieux Biologiques. Sécurité laser. Précautions à prendre

TP fibres optiques. Laser, Matériaux, Milieux Biologiques. Sécurité laser. Précautions à prendre TP fibres optiques Laser, Matériaux, Milieux Biologiques Sécurité laser ATTENTION : la diode laser à 810 nm est puissante (50 mw). Pour des raisons de sécurité et de sauvegarde de la santé des yeux, vous

Plus en détail

Université Bordeaux Segalen - PACES 2012-2013 ED UE9s Avril 2013

Université Bordeaux Segalen - PACES 2012-2013 ED UE9s Avril 2013 Sélectionner les propositions exactes Université Bordeaux Segalen - PACES 2012-2013 ED UE9s Avril 2013 QCM 1 La plupart des techniques de biologie moléculaire repose sur le principe de complémentarité

Plus en détail

Les Protéines Fluorescentes. Tounsia Aït-Slimane, UMRS 938, CDR Saint-Antoine CHU Saint-Antoine

Les Protéines Fluorescentes. Tounsia Aït-Slimane, UMRS 938, CDR Saint-Antoine CHU Saint-Antoine Les Protéines Fluorescentes Tounsia Aït-Slimane, UMRS 938, CDR Saint-Antoine CHU Saint-Antoine Sondes fluorescentes et méthodes d imagerie en biologie : GFP, EGFP, BFP, CFP, YFP, dsred, mrfp1, Hc Red,

Plus en détail

Synthèse de sondes fluorescentes photo-activables pour le marquage et l'étude de la dynamique de protéines cellulaires.

Synthèse de sondes fluorescentes photo-activables pour le marquage et l'étude de la dynamique de protéines cellulaires. Université de Strasbourg Thèse présentée par David WARTHER pour l'obtention du grade de Docteur de l'université de Strasbourg Discipline : Chimie Spécialité : Chimie Bioorganique Synthèse de sondes fluorescentes

Plus en détail

Laboratoire de Photophysique et de Photochimie Supra- et Macromoléculaires (UMR 8531)

Laboratoire de Photophysique et de Photochimie Supra- et Macromoléculaires (UMR 8531) Unité Mixte du CNRS (UMR8531) Institut de Chimie Directeur : Keitaro NAKATANI (PU ENS Cachan) Courrier électronique : nakatani@ppsm.ens-cachan.fr http://www.ppsm.ens-cachan.fr Problématique générale :

Plus en détail

Les rencontres scientifiques du vendredi

Les rencontres scientifiques du vendredi Les rencontres scientifiques du vendredi Un élément de l Animation Scientifique de l axe 2 Techniques & Méthodes : Mesurer la taille des Particules Natalia Nicole Rosa Doctorante de l Axe 2 UMR IATE 29

Plus en détail

K W = [H 3 O + ] [OH - ] = 10-14 = K a K b à 25 C. [H 3 O + ] = [OH - ] = 10-7 M Solution neutre. [H 3 O + ] > [OH - ] Solution acide

K W = [H 3 O + ] [OH - ] = 10-14 = K a K b à 25 C. [H 3 O + ] = [OH - ] = 10-7 M Solution neutre. [H 3 O + ] > [OH - ] Solution acide La constante d autoprotolyse de l eau, K W, est égale au produit de K a par K b pour un couple acide/base donné : En passant en échelle logarithmique, on voit donc que la somme du pk a et du pk b d un

Plus en détail

1 er sujet : ancre GPI et association aux rafts (64 points)

1 er sujet : ancre GPI et association aux rafts (64 points) Université Joseph Fourier - Grenoble I Année 2007-2008 Epreuve de BIO121 1 ère session mai 2008 Durée : 2 heures Les documents, la calculette et le téléphone portable ne sont pas autorisés. Total des points

Plus en détail

Comment réaliser physiquement un ordinateur quantique. Yves LEROYER

Comment réaliser physiquement un ordinateur quantique. Yves LEROYER Comment réaliser physiquement un ordinateur quantique Yves LEROYER Enjeu: réaliser physiquement -un système quantique à deux états 0 > ou 1 > -une porte à un qubitconduisant à l état générique α 0 > +

Plus en détail

Objectifs pédagogiques : spectrophotomètre Décrire les procédures d entretien d un spectrophotomètre Savoir changer l ampoule d un

Objectifs pédagogiques : spectrophotomètre Décrire les procédures d entretien d un spectrophotomètre Savoir changer l ampoule d un CHAPITRE 6 : LE SPECTROPHOTOMETRE Objectifs pédagogiques : Citer les principaux éléments d un dun spectrophotomètre Décrire les procédures d entretien d un spectrophotomètre p Savoir changer l ampoule

Plus en détail

Atelier : Détection de la mort cellulaire par apoptose en réponse à un agent anti-tumoral.

Atelier : Détection de la mort cellulaire par apoptose en réponse à un agent anti-tumoral. - La cytométrie en flux est une méthode d analyse de cellules en suspension, véhiculées à grande vitesse jusqu à une chambre d analyse traversée par des faisceaux lasers. L interaction des cellules avec

Plus en détail

EXERCICE II. SYNTHÈSE D UN ANESTHÉSIQUE : LA BENZOCAÏNE (9 points)

EXERCICE II. SYNTHÈSE D UN ANESTHÉSIQUE : LA BENZOCAÏNE (9 points) Bac S 2015 Antilles Guyane http://labolycee.org EXERCICE II. SYNTHÈSE D UN ANESTHÉSIQUE : LA BENZOCAÏNE (9 points) La benzocaïne (4-aminobenzoate d éthyle) est utilisée en médecine comme anesthésique local

Plus en détail

Chapitre II. Étude de risques spécifiques. Risques optiques

Chapitre II. Étude de risques spécifiques. Risques optiques Chapitre II Étude de risques spécifiques Risques optiques L exposition maximale permise (E.M.P.) est le niveau maximal auquel l œil peut être exposé sans subir de dommage immédiat ou à long terme. Cette

Plus en détail

101 Adoptée : 12 mai 1981

101 Adoptée : 12 mai 1981 LIGNE DIRECTRICE DE L OCDE POUR LES ESSAIS DE PRODUITS CHIMIQUES 101 Adoptée : 12 mai 1981 «Spectres d'absorption UV-VIS» (Méthode spectrophotométrique) 1. I N T R O D U C T I O N I n f o r m a t i o n

Plus en détail

Détection de Chlorophylle Réalisation d'un fluorimètre

Détection de Chlorophylle Réalisation d'un fluorimètre MANGOTECHNO Détection de Chlorophylle Réalisation d'un fluorimètre Frédéric BOUCHAR (TENUM Toulouse) Document de travail - Janvier 2012 Version 1.0 Table des matières 1.Introduction...3 2. La chlorophylle...3

Plus en détail

LABORATOIRES DE CHIMIE Techniques de dosage

LABORATOIRES DE CHIMIE Techniques de dosage LABORATOIRES DE CHIMIE Techniques de dosage Un dosage (ou titrage) a pour but de déterminer la concentration molaire d une espèce (molécule ou ion) en solution (généralement aqueuse). Un réactif de concentration

Plus en détail

La recherche d'indices par fluorescence

La recherche d'indices par fluorescence La recherche d'indices par fluorescence Ces sources d éclairage à haute intensité permettent, en fluorescence, la mise en évidence d indices qui ne sont pas visibles ou peu à l oeil nu. Ex : empreintes

Plus en détail

Perrothon Sandrine UV Visible. Spectrophotométrie d'absorption moléculaire Étude et dosage de la vitamine B 6

Perrothon Sandrine UV Visible. Spectrophotométrie d'absorption moléculaire Étude et dosage de la vitamine B 6 Spectrophotométrie d'absorption moléculaire Étude et dosage de la vitamine B 6 1 1.But et théorie: Le but de cette expérience est de comprendre l'intérêt de la spectrophotométrie d'absorption moléculaire

Plus en détail

Fluorescent ou phosphorescent?

Fluorescent ou phosphorescent? Fluorescent ou phosphorescent? On entend régulièrement ces deux termes, et on ne se préoccupe pas souvent de la différence entre les deux. Cela nous semble tellement complexe que nous préférons rester

Plus en détail

1 ère partie : tous CAP sauf hôtellerie et alimentation CHIMIE ETRE CAPABLE DE. PROGRAMME - Atomes : structure, étude de quelques exemples.

1 ère partie : tous CAP sauf hôtellerie et alimentation CHIMIE ETRE CAPABLE DE. PROGRAMME - Atomes : structure, étude de quelques exemples. Référentiel CAP Sciences Physiques Page 1/9 SCIENCES PHYSIQUES CERTIFICATS D APTITUDES PROFESSIONNELLES Le référentiel de sciences donne pour les différentes parties du programme de formation la liste

Plus en détail

Une nouvelle technique d'analyse : La spectrophotométrie

Une nouvelle technique d'analyse : La spectrophotométrie Une nouvelle technique d'analyse : La spectrophotométrie Par spectrophotométrie on peut : - déterminer la concentration d'une espèce chimique colorée en solution à partir de l'absorbance. - suivre la cinétique

Plus en détail

LE PHYSICIEN FRANCAIS SERGE HAROCHE RECOIT CONJOINTEMENT LE PRIX NOBEL DE PHYSIQUE 2012 AVEC LE PHYSICIEN AMERCAIN DAVID WINELAND

LE PHYSICIEN FRANCAIS SERGE HAROCHE RECOIT CONJOINTEMENT LE PRIX NOBEL DE PHYSIQUE 2012 AVEC LE PHYSICIEN AMERCAIN DAVID WINELAND LE PHYSICIEN FRANCAIS SERGE HAROCHE RECOIT CONJOINTEMENT LE PRIX NOBEL DE PHYSIQUE 0 AVEC LE PHYSICIEN AMERCAIN DAVID WINELAND SERGE HAROCHE DAVID WINELAND Le physicien français Serge Haroche, professeur

Plus en détail

INTRODUCTION À LA SPECTROSCOPIE

INTRODUCTION À LA SPECTROSCOPIE INTRODUCTION À LA SPECTROSCOPIE Table des matières 1 Introduction : 2 2 Comment obtenir un spectre? : 2 2.1 Étaller la lumière :...................................... 2 2.2 Quelques montages possibles

Plus en détail

I. Principe des dosages :

I. Principe des dosages : Dans les cours d'eau, notamment canalisés, et dans les régions densément habitées ou d'agriculture intensive, les nitrites sont souvent un paramètre important de déclassement des cours d'eau. Chez l'homme

Plus en détail

Les technologies motrices de l'immunologie

Les technologies motrices de l'immunologie Les technologies motrices de l'immunologie 2ème Partie Imagerie : Molécules et cellules en action I. Les progrès de l imagerie. II. Cellules et molécules immunitaires en action. 18/05/2010 1 Imagerie :

Plus en détail

WHITE PAPER CYTOMÉTRIE

WHITE PAPER CYTOMÉTRIE SYSMEX OCTOBRE 2014 WHITE PAPER CYTOMÉTRIE Cytométrie en flux pour l analyse de la ploïdie et la taille du génome chez les plantes et autres organismes. Introduction : Dès son origine, la cytométrie en

Plus en détail

Biologie Appliquée. Dosages Immunologiques TD9 Mai 2015. Stéphanie Sigaut INSERM U1141 stephanie.sigaut@inserm.fr

Biologie Appliquée. Dosages Immunologiques TD9 Mai 2015. Stéphanie Sigaut INSERM U1141 stephanie.sigaut@inserm.fr Biologie Appliquée Dosages Immunologiques TD9 Mai 2015 Stéphanie Sigaut INSERM U1141 stephanie.sigaut@inserm.fr 1 ELISA 2 3 4 [Ac] 5 6 7 8 9 Correction : Faire la moyenne D0-1 et D0-2 pour toute les valeurs

Plus en détail

www.gbo.com/bioscience 1 Culture Cellulaire Microplaques 2 HTS- 3 Immunologie/ HLA 4 Microbiologie/ Bactériologie Containers 5 Tubes/ 6 Pipetage

www.gbo.com/bioscience 1 Culture Cellulaire Microplaques 2 HTS- 3 Immunologie/ HLA 4 Microbiologie/ Bactériologie Containers 5 Tubes/ 6 Pipetage 2 HTS 3 Immunologie / Immunologie Informations Techniques 3 I 2 ELISA 96 Puits 3 I 4 ELISA 96 Puits en Barrettes 3 I 6 en Barrettes de 8 Puits 3 I 7 en Barrettes de 12 Puits 3 I 8 en Barrettes de 16 Puits

Plus en détail

TP 3 diffusion à travers une membrane

TP 3 diffusion à travers une membrane TP 3 diffusion à travers une membrane CONSIGNES DE SÉCURITÉ Ce TP nécessite la manipulation de liquides pouvant tacher les vêtements. Le port de la blouse est fortement conseillé. Les essuie tout en papier

Plus en détail

Sujet. calculatrice: autorisée durée: 4 heures

Sujet. calculatrice: autorisée durée: 4 heures DS SCIENCES PHYSIQUES MATHSPÉ calculatrice: autorisée durée: 4 heures Sujet Spectrophotomètre à réseau...2 I.Loi de Beer et Lambert... 2 II.Diffraction par une, puis par deux fentes rectangulaires... 3

Plus en détail

THEME 2. LE SPORT CHAP 1. MESURER LA MATIERE: LA MOLE

THEME 2. LE SPORT CHAP 1. MESURER LA MATIERE: LA MOLE THEME 2. LE SPORT CHAP 1. MESURER LA MATIERE: LA MOLE 1. RAPPEL: L ATOME CONSTITUANT DE LA MATIERE Toute la matière de l univers, toute substance, vivante ou inerte, est constituée à partir de particules

Plus en détail

TD de Biochimie 4 : Coloration.

TD de Biochimie 4 : Coloration. TD de Biochimie 4 : Coloration. Synthèse de l expérience 2 Les questions posées durant l expérience 2 Exposé sur les méthodes de coloration des molécules : Générique Spécifique Autres Questions Pourquoi

Plus en détail

TP n 1: Initiation au laboratoire

TP n 1: Initiation au laboratoire Centre Universitaire d El-Tarf Institut des Sciences Agronomiques 3 ème année Contrôle de Qualité en Agroalimentaire TP n 1: Initiation au laboratoire Introduction L analyse de la matière vivante au laboratoire

Plus en détail

Biochimie I. Extraction et quantification de l hexokinase dans Saccharomyces cerevisiae 1. Assistants : Tatjana Schwabe Marcy Taylor Gisèle Dewhurst

Biochimie I. Extraction et quantification de l hexokinase dans Saccharomyces cerevisiae 1. Assistants : Tatjana Schwabe Marcy Taylor Gisèle Dewhurst Biochimie I Extraction et quantification de l hexokinase dans Saccharomyces cerevisiae 1 Daniel Abegg Sarah Bayat Alexandra Belfanti Assistants : Tatjana Schwabe Marcy Taylor Gisèle Dewhurst Laboratoire

Plus en détail