Mieux comprendre les fluorochromes pour la microscopie confocale

Dimension: px
Commencer à balayer dès la page:

Download "Mieux comprendre les fluorochromes pour la microscopie confocale"

Transcription

1 Spencer BROWN, Dynamique de la compartimentation cellulaire, Béatrice SATIAT-JEUNEMAITRE, Olivier CATRICE, Institut des Sciences du Végétal, CNRS UPR2355, Gif-sur-Yvette et Susanne BOLTE, Marie-Noëlle SOLER IFR87 " La Plante et son environnement et Christel TALBOT, Plate-forme d'imagerie Cellulaire de l'institut de Neurosciences, Université de Bordeaux II Mieux comprendre les fluorochromes pour la microscopie confocale Processus physique et ses implications : spectres Autres propriétés des fluorochromes L environnement Montage de l échantillon Recouvrement des spectres d émission Choix d une sonde fluorescente Chargement, quantification, chromatisme, Techniques ratiométriques Les protéines fluorescentes Susanne Bolte Brown, S., Bolte, S., Satiat-Jeunemaître B. (2007) Tracking Gene Expression in Plant Cells: Microscopy and associated bio-imaging techniques. Chapter 13 in: Functional Genomics: From Sequence to Function in Plants, JF Morot-Gaudry, P Lea et JF Briat (eds) Science Publishers, UK, pp

2 Un marqueur pour chaque compartiment, ou pour chaque fonction? bisbenzimide Hoechst endosomes LY lissamine-rhodamine-dextran AF-actin DiIC1(5) DeBiasio et al. 1987

3 intensité, spectre, durée de vie de la fluorescence, anisotropie d émission fluoro-chromasia Acridine Orange

4 Aniline Blue : ß 1-3 glucanes insolubles Calcofluor White sur algues avec phycobiliprotéines

5 N Peroxisomes Nuclear membrane Tonoplast Vac Endoplasmic reticulum (ER+RER) Golgi stacks Plasma membrane Chloroplastes Mitochondria + cytoskeleton : actin, tubulin, etc. Cell Wall

6 GFP cible mitochondria autofluorescence de chlorophylle DsRed cible mitochondria GFP cible plastes Ian Small, INRA Evry

7 Cytoskeletal organisation in Medicago T. Hanh Trinh

8 LUMINESCENCE PHOTO-LUMINESCENCE CHIMI-LUMINESCENCE BIO-LUMINESCENCE Fluorescence Phosphorescence THERMO-LUMINESCENCE court tau τ f long ELECTRO-LUMINESCENCE singulet triplet etc Bernard VALEUR (2002, 2004) ; Cachan & CNAM

9 Diagramme simplifié des niveaux d énergie d une molécule polyatomique Jablonski energy diagram S 2 Niveaux d énergie niveau virtuel Raman Stokes & anti-stokes (inélastique, sans absorption) singulet T 1 S 0 phosphorescence S 1 cis absorption ~ps fluorescence ~fs ~ns ci vi v0 quenching de fluorescence 10-9 à10-7 s transfert d énergie à10-4 s S 1 cis phosphorescence 10-8 à10-2 s S 0 T 1 triplet

10 TPA : two-photon absorption l absorption quasi-simultanée (fs) de deux photons de faible énergie. Les spectres d excitation biphotonique ressemblent à peu près aux spectres conventionnels d absorption décalés d un facteur 2x sur l axe λ (

11 OH Spectre d absorption et d émission de l iso-thiocyanate de fluorescéine et de la chlorophylle in situ O N C S COOH O fluorescèine ITC PM 389 dalton acide faible pka ~6,4 Q 0,85 ε M -1. cm -1 Propriétés: absorptivité moyenne Absorbance (DO, ) Intensité (UA, ) bon rendement quantique peu encombrante divers analogues disponible iso-thiocyanate de fluorescéine déplacement de Stokes excitation Chlorella vulgaris émission Longueur d onde (nm) Intensité (UA, ) Intensité (UA, ) Figure 2.

12 Diagramme simplifié des niveaux d énergie d une molécule polyatomique Jablonski energy diagram S 2 T 1 Niveaux d énergie S 0 transfert d énergie à10-4 s S 1 cis S 0 T 1 phosphorescence 10-8 à10-2 s Raman Stokes & anti-stokes S 1 cis ~ps phosphorescence fluorescence quenching de fluorescence 10-9 à10-7 s ci absorption ~fs ~ns

13 Spectre d absorption et d émission de l iso-thiocyanate de fluorescéine et du propidium OH O O COOH N C S Intensité (UA, ) 1 iso-thiocyanate de fluorescéine excitation émission Intensité (UA, ) 0 NH 2 NH 2 propidium N + C 2 H 3 (CH 2 ) N CH 3 C 2 H 5 Intensité (UA, ) Longueur d onde (nm) Intensité (UA, )

14 Spectres et «déplacement de Stokes» Longueur d onde λ du maximum d excitation < λ du maximum d émission Déplacement de Stokes = la distance entre les maxima d'excitation et d'émission Exemple: pour la fluorescéine, respectivement 495 nm et 521 nm, déplacement de Stokes = 26 nm. Des complexes offrent un déplacement de Stokes important vis. chlorophylle, iodure de propidium, ECD, Red670, Tricolor, Cychrome et les Nano-particules colloïdales Quantum Dots et les particules à émission anti-stokes upconverted luminescence nanocrystals Wu S, Han G, Milliron DJ, Aloni S, Altoe V, Talapin DV, Cohen BE, Schuck PJ. (2009) Non-blinking and photostable upconverted luminescence from single lanthanide-doped nanocrystals. PNAS Early Edition, July 2009

15 phi Rendement quantique φ f = rapport du nombre total de photons émis dans tout le spectre d'émission de fluorescence au nombre de photons reçus et absorbés dans la zone spectrale d'excitation rendement quantique, I f = φ f I a I f émettant (f) la lumière et I a = nombre de quanta par unité de temps et de surface recevant (a) et ( φ f 0,85 pour la fluorescéine )

16 Coefficient d'extinction, ε, ou absorbance spécifique = absorbtivité molaire Sa valeur peut constituer un critère pour le choix des colorants ; plus ε est grand, plus la fluorescence sera élevée à intensité lumineuse incidente égale. ( Pour la fluorescéine à 488 nm, ε = 8 x 10 4 M -1. cm -1 ) Avec une absorbance spécifique très réduite ( ε.c.l < 0,02 ), on peut linéariser la fonction exponentielle, avec Log10 2,3 I f 2,3 φ f. I o. ε.c.l C, concentration du fluorophore I f, intensité d'émission

17 " Brillance " La "brillance" est proportionnelle à ε et φ ε φ «brillance» ( M -1. cm -1 ) ( unités arbitraires ) Fluorescéine , Cyanine , EYFP , B-phycoérythrine , Tryptophan ,1 600 Quantum Dot , Quantum Dot , (à 490 nm) Pour Non Linear Optics: Action cross section = absorption cross section (spécifique de NLO) multiplié par le rendement quantique 1 Göppert-Mayer = cm 4. s

18 tau Durée de vie du singulet excité le plus bas = la constante de temps de déclin de fluorescence, τ f τ f = φ f. τ N τ N, constante de temps intrinsèque de l'état excité (en considérant seulement la fluorescence). (τ f 4 ns pour la fluorescéine dans l'eau) φ F, rendement quantique Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy, FLIM phi

19 Transfert d'énergie par résonance (loi de Förster) Förster (Fluorescence) Resonant Energy Transfer = FRET Chevauchement du spectre d'émission d un donneur d'énergie et du spectre d absorption d un accepteur d'énergie : Excitation du donneur et émission de l'accepteur k ET = 1 / τ D. ( R o / R ) 6 k ET, constante de cinétique pour resonant energy transfer, RET τ D, durée de vie du donneur R o, constante de la distance critique (en nm) pour un couple donneur accepteur R, distance moyenne effective (en nm) entre les centres des dipôles donneur accepteur. Donc, le transfert d'énergie par résonance non radiatif est proportionnel à R -6. Notons que des transferts d'énergie sont importants dans des complexes chlorophylliens. L occurrence de FRET réduit le durée de vie apparente du donneur, τ D.

20 Intra-molecular FRET Violet or UV excited green to blue B-lactamase substrate Knapp et al. Cytometry (2003) Part A 51A: Aurora Company, Roger Tsien

21 Mesure de calcium avec le Biosenseur CAMELEON: CFP Calmodulin M13 YFP Allen et al., Ca 2+ -Ca 2+ Changement conformationnel 440 nm 480 nm FRET YFP 530 nm CFP 4Ca nm Les applications de la microscopie confocale en biologie végétale/susanne Bolte IFR87

22 caspase3 indicator CFP-DEVD-YFP in staurosporine-treated HeLa cells caspase3 X CFP-DEVD-YFP ex 430 nm, em nm ex 430 nm, em nm DAPI ex 357 nm, em nm 1.46 YFP/CFP 0.83 Intra-molecular FRET Mark JEPSON & Darran CLEMENTS, Bristol Univ. The Biochemist, June 2004, 30-34

23 Resonant Energy Transfer RET Förster (Fluorescence) Resonant Energy Transfer FRET Sonde permeante fluorescente bleu/verte pour l activité β lactamase. sondes calciques Cameleon, typiquement CFP-YFP Biosensors e.g. protéines périplasmiques fusionnées avec CFP/YFP Fehr (2004) PCR quantitative, un fluorophore et un quencher sont placés à proximité l'un de l'autre sur un même oligonucléotide Molecular Beacons ( balises moléculaires ) L'oligonucléotide libre forme par auto-hybridation une épingle à cheveux qui amène le fluorophore à proximité du quencher. Lors de l'hybridation avec un autre fragment d'adn, cette compétition amène une linéarisation de l'oligonucléotide, et le fluorophore est alors éloigné du quencher. «sondes FRET d'hybridation» homo-fret est dépolarisant GFP/GFP (Grandjean, Versailles) FRET inter-moléculaire FITC/TRITC ; CFP/YFP ; GFP/mCHERRY ; GFP/Cy3.18 Bioluminescence Resonant Energy Transfer BRET et CRET BRET2 utilise Renilla luciferase sur coelentérazine (DeepBlueC) qui transfert à GFP2. Black Hole Quenchers, Dabcyl et TAMRA (Qiagen Operon Product Guide 2002,

24 Autres propriétés Température : généralement l intensité augmente quand la température baisse Polarisation : absorption favorable si champs électromagnétique du photon // dipôle d absorption ; ensuite émission isotrope ou anisotrope, d après les cinétiques de rotation. par exemple, un fluorophore cylindrique dans un membrane Photostabilité : Perte de fluorescence (fading): fluorescéine versus rhodamine ; Alexas ; QuantumDots FRAP (Fluorescence Recovery/Redistribution After Photobleaching) FMI-43, FM4-64 styryl dyes, membranaires Rouge Neutre (Neutral Red; abs max 533, pka 6.7) Photo-activable Photo-convertible PA-GFP inductible par 413 nm Kaede, Eos, Dendra ; ou DRONPA réversible L importance donc du milieu de montage

25 L environnement Un déplacement d absorption vers des longueurs d onde courte se dit hypsochromique. Un déplacement d absorption vers des longueurs d onde longue se dit bathochromique. effet Solvant Nile Red (Rouge de Nil) : jaune triglycérides neutres ; rouge phospholipides polaires Nile Blue : jaunes lipides ; rouge protéines NBD (nitrobenzoxadiazole) Q est 10 fois moins dans un environnement aqueux : insertion membranaire critique ph - FITC pka 6,4 polarité - BCECF-AM pka 6,98 - EGFP pka 5,5 - EYFP pka 6,9 Ions métalliques mithramycine et chromomycine Mg 2+ essentiel Hoechst bromure quench sondes chélatrices de calcium Mn 2+ quench YFP chlore quench potentiel électrique liaison hydrogène ions Fluorescence moléculaire ph quenchers pression température viscosité Concentration ou agrégation carboxy-fluorescéine : non fluorescent à 100 mm JC-1 formation de J-agrégats, alors I rouge /I vert reflète l hyperpolarisation Bernard VALEUR (2002), CNAM Figure 3.

26 Protoplast from suspension cells of Arabidopsis in protoplasts & cells imagerie in CHAPS micelles spectrofluorométrie bathochrome base de données Transmission DIC hypsochrome Amphiphilic amino-styrene dye FM4-64 : emission spectrum Fluorescence Bolte S, Talbot C, Boutte Y, Catrice O, Read ND, Satiat-Jeunemaitre B (2004) FM-dyes as experimental probes for dissecting vesicle trafficking in living plant cells. J. Microscopy, 214,

27 Quenching Quenching dynamique Quenching statique RET : transfert d énergie à distance et bien sûr la photo-destruction

28 How many Photons? Consider 1 mw of power at 488 nm focused to a Gaussian spot whose radius at 1/e 2 intensity is 0.25 μm via a 1.25 NA objective The peak intensity at the center will be 10-3 W [π.(0.25 x 10-4 cm) 2 ] = 5.1 x 10 5 W/cm 2 or 1.25 x photons/(cm 2 sec -1 ) At this power, FITC would have 63% of its molecules in an excited state and 37% in ground state at any one time J. Paul Robinson, Purdue University Cytometry Laboratories

29 Photobleaching example FITC : At 4.4 x photons cm -2 sec -1 FITC bleaches with a quantum efficiency Q b of 3 x 10-5 Therefore FITC would be bleaching with a rate constant of 4.2 x 10 3 sec -1 so 37% of the molecules would remain after 240 µsec of irradiation. In a single plane, 16 scans would cause 6-50% bleaching J. Paul Robinson, Purdue University Cytometry Laboratories

30 transparence indexe de réfraction stabilité Milieu de montage respect des structures et volumes viscosité osmolarité ph (pka) ions antioxydant(s) pièges à radicaux libres (DABCO, etc.) et aux composés phénoliques (PVP) permanence On stocke ses préparations fixées à 4 C. Pour cellules vivantes : quencheurs de radicaux libres tel caroténoïdes (50 mm crocétine ou etretinate) ; ascorbate, imidazole, histidine, cystéamine, glutathion réduite, Trolox (analogue de vitamine E) voire notre base : Milieu de montage J. Paul Robinson, Purdue University Cytometry Laboratories

31 Maîtriser les Indices de Réfraction perdu n = 1.52 Objectifs n = 1.5 n = 1.52 Huile Air n = 1.0 Eau n= 1.33 n=1.52 Lamelle n = 1.52 n=1.52 Specimen Eau n= 1.33

32 Quel choix de fluorochromes?! Le marquage des cellules par des fluorochromes permet d'accéder à des informations arbitrairement classées en deux catégories - les paramètres structuraux - les paramètres fonctionnels M-H Ratinaud

33 hybridation in situ : réflectance sur l argent avec autofluorescence tissulaire nodule de Medicago : Fugier et Crespi (1994)

34 Glucuronidase report assessed by confocal microscopy develop the GUS reaction only weakly ; chlorhydrate ; fix ; gomme arabique Epi-reflectance confocal image (blue) superposed upon DIC transmission image A tissue-specific promotor of the vegetative apical meristem in Arabidopsis (200 images with z = 0.2 µm) Nathalie Glab and Séverine Domenichini, IBP, CNRS, UMR8618, Orsay

35 Autofluorescence chez la betterave et le pois modifié de Cerovic et al, 1999 phenylalanine tyrosine, tryptophan NAD(P)H, acide férulique, coumarines, alcaloïdes flavines, FAD, FMN chlorophylles, porphyrines (hème), rhodopsine en IR : matériaux phycobiliprotéines

36 Excitation UV sur le plan d une coupe transversale de feuille de Daphniphyllum macropodum et si on irradie par l épiderme en UV, vis, IR? coumarines phénoliques chlorophylle flavines (lignine) Chlorophylle comme sonde pour apprécier les polyphénoles d après leur effet d écran Zoran Cerovic Cerovic et al, 1999 ; Meyer et al Equipe de Biospectroscopie Végétale, Laboratoire d'ecologie Systématique et Evolution (UMR 8079), Université Paris-Sud 11

37 broad bean rye rye NH 3 Naturstoffreagenz A spruce Hutzler P, Fischbach R, Heller W, Jungblut TP, Reuber S, Schmitz R, Veit M., Weissenbo G, Schnitzler JP (1998) Tissue localization of phenolic compounds in plants by confocal laser scanning microscopy. J. Exp Bot., 49,

38 Plastids of live mesophyll of Commelina communis, with 1200 nm excitation THG 400 nm SHG 600 Biphoton Overlay Third Harmonic Second Harmonic autofluorescence Generation Generation des éléments contrastants complémentaires P-C Cheng, National Taiwan University, Taipei. Figure 36 in Feijo, J.A., Moreno, N Imaging plant cells by two-photon excitation. Protoplasma, 22, 1-32

39 Action cross section = absorption cross section multiplied by the fluorescence quantum yield 1 Göppert-Mayer = cm 4. s Fig. 1. Two-photon action cross sections and emission spectra from a basis set of biological molecules that contribute much of the intracellular 2PE intrinsic fluorescence. (a). In buffered (ph 7.2) saline solution, except retinol and cholecalciferol (vit D), which were measured in EtOH. Riboflavin, cholecalciferol, and NADH were measured at 100 µm; retinol, folic acid, phylloquinone, pyridoxine, and nicotinamide were measured at 500 µm. (b) Emission spectra of the compounds shown in a. Zipfel WR, Williams RM, Christie R, Yu Nikitin A, Hyman BT, Webb WW (2003) Live tissue intrinsic emission microscopy using multiphoton-excited native fluorescence and second harmonic generation. PNAS, 100,

40 Aspects spectraux Ratio N*/T* 485/585 nm Intensity Andrey S. Klymchenko A S, Duportail G, Mély Y, Demchenko A P (2003) Ultrasensitive two-color fluorescence probes for dipole potential in phospholipid membranes. PNAS, 100: Fig. 5. Response in emission spectra of F8N1S and PPZ8 to variations of the dipole potential in THP-1 cell plasma membrane produced by the addition of 6-KC (5, 10, 15, 20, 30, 40, and 50 µm). ψ d was modified by the addition of 6-ketocholestanol 10, 20, and 40 µm. Spectra normalized at the T* band for PPZ8 and at the N* band for F8N1S. Dotted line upper panel: addition of 50 µm cholesterol.

41 Exemples de marqueurs fluorescents utilisés en biologie cellulaire et moléculaire modifié d'après Kasten dans Mason (1999) Fluorescent and Luminescent Probes for Biological Activity. Academic Press, Londres (2è éd). Wavelength (nm) Name Excitation Emission Applications Immunocytochemical fluorophores, conjugates and lectins Tracers for various proteins, receptors, mono- and polysaccharides Alexa Fluor family 350, 430, 488, 532, 546, 568, 594, 633, 647, 660, 680 Allophycocyanin (AP) Allophycocyanin cross-linked (AP-XL) AMCA (7-amino-4- methylcoumarin-3-acetic acid) Bodipy (borondipyromethene difluoride dye) CT-120 (coumarin 120 thiolactone) CT-339 (coumarin 330 thiolactone) Coumarin Cyanine incompatible avec VectaShield Cyanine , ε Cy3 de biopuces Cyanine ε Cyanine ε Cy5 de biopuces Cyanine ε Cyanine ε Dimethylfluorescein DTAF (5-(4 6-dichloro- triazinyl) aminofluorescein) Eosin-5-isothiocyanate Erythrosin-5-isothiocyanate FITC(fluorescein-5- isothiocyanate) Tableau 6.

42 Faites la différence! = Cy3.18 https://www.omegafilters.com/

43 Quelques fluorochromes utilisés en microscopie confocale - immunofluorescence : FITC, TRITC, lissamine rhodamine, Texas Red, Cy3.5, Cy5.5, Alexa Fluors 488, 568, ADN : iodure de propidium, YOYO, YOPRO, SYTO16, chromomycine, mithramycine; DAPI, Hoechst, DRAQ5, TOTO3, TOPRO3 (oligos Cy3.18, Cy5.18) - mitochondie : sensible au potentiel membranaire: nm Rhodamine 123, DiOC 6 (3), DiOC 6 (5), DiOC 7 (3), JC-1, MitoTracker Red CMXRos (post-fixation possible) ; NAO (peu sensible potentiel) - membranes : Styrenes FM1-43, FM4-64, fusions-gfp, divers anticorps de surface - Viabilité : FDA, exclusion d iodure de propidium, morphologie, avec DIC - réticulum endoplasmique: (µm non spécifique) DiOC 6 (5), GFP-HDEL - appareil de Golgi : GFP-taggée, anticorps, NBD-C 6 -ceramide (pas pour végétaux) - dépendance envers le ph : carboxy-snarf-1, BCECF - dépendance envers le calcium : Fluo-3 ou -4 (± FF), FuraRed, CalciGreen, Indo-1, Cameleon -divers : LysoTracker, Acridine Orange, Neutral Red, Lucifer Yellow, chlorophylle, - Protéines (Auto)fluorescentes Tableau 3.

44 Une famille d excellents fluorophores pour marquer des protéines, anticorps secondaires, etc Fluorophore Absorption* (nm) Emission* (nm) Couleur Coefficient d extinction ( M -1. cm -1 ) AlexaFluor Bleu AlexaFluor Violet AlexaFluor Jaune-vert AlexaFluor Vert AlexaFluor Jaune AlexaFluor Orange AlexaFluor Jaune-orange AlexaFluor Orange-rouge AlexaFluor Rouge AlexaFluor Rouge AlexaFluor Rouge AlexaFluor Rouge AlexaFluor Rouge lointain AlexaFluor Rouge lointain AlexaFluor Rouge lointain AlexaFluor Rouge lointain AlexaFluor Infra-rouge proche *maximum approximatif d absorption et d émission Molecular Probes, Inc

45 Several laser options for microscopy Krypton/Argon 60 mw démodé Argon Ion 100 mw Argon Ion 5W (UV/Vis) refroidi à eau Blue Laser Diode Helium Cadmium Helium Néon-Green Diode Pumped Solid State (DPSS561) Helium Néon Orange Helium Néon-Red Laser blanc *488 nm (15 mw), 568 nm (15 mw) & 647 nm (15 mw) 457 nm (6 mw), 488 nm (40 mw) & 514 nm (40 mw) nm (50 mw), etc. 405 nm ( mw) 442 nm (80 mw) 543 nm (2 mw) 561 nm (50 mw) 595 nm (3 mw) 633 nm (10 mw) nm Accordable fs for multi-photon nm (1 W) Ytterbium fs with spectral selection nm (45%) *le rapport entre les différentes raies a tendance à se dégrader avec le temps Tableau 4.

46 Figure 6. Spectres normalisés d absorbance et d émission Recouvrement des spectres d émission!!! Absorbance relative FITC PE TX Red Emission : Fluorescence relative FITC PE TX Red BP 530 BP 580 BP Longueur d onde (nm) FITC = isothiocyanate de fluorescéine PE = Phycoérythrine TX Red = Texas Red

47 Acquisitions simultanées UV ou violet 405 nm HOECHST nm Alexa Fluor 488 Alexa Fluor , 561, 568 nm DIC Paramecium; Anne Fleury, UPS, Orsay

48 The cross-talk problem Acquisitions simultanées Lasers 488 and UV Acquisitions séquentielles Laser 488 then UV

49 AOTF : Acousto Optical Tunable Filter filtre opto-acoustique accordable Cristal TeO 2 Absorbeur lumière incidente I 1 raie diffractée ordre 1 Transducteur Radio-fréquences I 0 raie diffractée ordre -1 Temps de réponse rapide : 1-2 µs Modulation continue entre 0 95 % Effet bloquant fort : T < 10-5 Accordable pour de nouvelles configurations, et multilignes Robuste Brown et al. (2007)

50 AOBS: Acousto-Optical Beam Splitter change in 2 µs AOBS versus Double Dichroic 488/ nm Transmission % filtre dichroïc classique versus AOBS

51 Tableau 2. ±diffusion exemple, iodure de propidium ne diffuse qu à travers une membrane dégradée ; exclus par une membrane intacte lipophilicité Nile Red, DPH (di-phenyl-hexatriéne) ; DiIC 18 (3) sur membranes neuronales lipophile & polaire amphiphile amphiphile avec charge délocalisée base faible acide faible dérivés estérifiés = ancrage: TMA-DPH (tetra-méthyl-dph), FM1-43, FM4-64 (amino-styryls) bisbenzimide Hoechst (perméant) versus Hoechst (non perméant) exemples avec charges positives, DiOC 6 (3), JC-1, Rhodamine123. Vers la mitochondrie, leurs formes protonées seront captées à l'intérieur électronégatif de cet organite, d après l équation simplifié de Nernst : distribution d une molécule perméante de part et d autre d une membrane chargée V(mV) V = -61,5 log ( [M + ] i / [M + ] e ) soit, -61 mv vaut 10x concentration. exemple, Rouge neutre ou une alcaloïde s accumulent dans un compartiment acide comme la vacuole (piégée par protonation), d après l équation de Waddel & Butler : pour une base faible perméante dans un système à deux compartiments: i, intérieur et e, externe, alors C i / C e = 10pHe - phi soit, Δ1 ph vaut 10x concentration. exemple, Fluorescéine cytosolique s accumule dans un compartiment alcalin (chloroplaste) par son état dissocié et chargé Δ1 ph vaut 10x concentration. fluorescéine di-acétate, assez lipophiles pour traverser une membrane. On compte ensuite sur des estérases cellulaires pour libérer le composé actif sur place.

52 Quelques exemples des composés dérivés de la fluorescéine (1) HO O O HO O O O O CH 3 -C-O O O-C-CH 3 COO - H + COO - H + COO - H + fluorescéine N C S iso-thiocyanate de fluorescéine (FITC) di-acétate de fluorescéine (FDA) - Excitation maximum nm - Emission maximum 521 nm - rendement quantique 0,6 à 0,9 - pka 6,3; acide faible - largement imperméable à la membrane à ph >7 - Réagit avec les amines, sert donc pour étiqueter des protéines - quasi non fluorescent - perméant aux membranes - estérases cellulaires libèrent la fluorescéine acide

53 Quelques exemples des composés dérivés de la fluorescéine (2) O O CH 3 -C-O O O-C-CH 3 O O O O O Cl H Cl COO - H + CH 3 -C-O O-C-CH 3 O R-OOC R-O O O-R COO-R COO - H + R-OOC O di-acétate de 5-carboxyfluorescéine (CFDA) di-acétate de 2,7 -dichlorofluorescin (DCFH-DA) 2,7 -bis(carboxyethyl) -5(6)-carboxyfluorescéine, penta-acétoxyméthyl ester (BCECF-AM) - analogue à la FDA - lactone perméante - et le produit carboxyfluorescéine (pka 6,4) est mieux retenu dans la cellule - analogue à la FDA, réduite - les estérases libèrent un produit non fluorescent qui au cours d une activité cellulaire peroxydasique, devient fluorescent - analogue au FDA - le produit BCECF, avec pka 6,97 et une charge nette -4 à -5 est bien retenu dans la cellule et la dépendance de sa fluorescence sur le ph permet son emploi comme sonde de ph cytoplasmique

54 Perméation, libération, activation O CH 3 -C-O Cl O H O O-C-CH 3 Cl COO - H + Di-acétate de 2,7 -dichlorofluorescin (DCFH-DA) Membrane cellulaire O O CH 3 -C-O O O-C-CH 3 Cl H Cl COO - H + Désacétylation intracellulaire par des estérases HO O OH HO O OH Cl H Cl COO - H + + H 2 O 2 (+ peroxydase) Cl Cl COO - H + 2,7 -dichlorofluorescin (non fluorescent) 2,7 -dichlorofluorescein (fluorescent)

55 SNAP-tag, CLIP-tag 20 kda SNAP-tag petit réactif, éventuellement perméant et fluorescent Ozyme pour SNAP : X-Benzylguanine ; pour CLIP : X-Benzylcytosine

56 Imaging DNA Synthesis Click-iT EdU (Invitrogen) EdU (5-ethynyl-2'-deoxyuridine) analogue de la thymidine Non-radioactive AlexaFluor azide No DNA denaturation required Simplified protocol Small molecule detection Multiplex compatible, including Other antibodies Dyes for cell cycle analysis voir aussi l utilisation d anticorps contre bromo-deoxyuridine chloro-deoxyuridine iodo-deoxyuridine Altered Quiescent Centre cell properties in ccs52a2 mutant roots of A. thaliana. Vanstraelen et al. (2009) PNAS

57 La quantification toute une chaine! Absorption : Loi de Beer-Lambert I a = I o -I t = I o ( ε.c.l ) qui se simplifie à : I f 2,3 φ f. Io. ε. C. l I o, intensité lumineuse incidente I t, intensité lumineuse transmise C, concentration de la molécule absorbante, en mol.l -1 (M) l, trajet optique, en cm I f, intensité d émission

58 iso(s)beste Figure 4 : Spectres d'émission de fluorescence dépendant du ph, de la sonde ratiométrique carboxy-snarf-1, pour différentes excitations 488 (A), 514 (B), 534 (C). (Molecular Probes, Invitrogen)

59 Spectre d émission de fluorescence du FLUO-3 et de Fura-Red microinjectés ensemble

60 J-aggregate-forming dye JC-1 (un carbocyanine) seuillage, débruitage, puis ImgRatio = Img1 / Img2 = une cartographie de la potentiel Nernst Img1 J-aggregates émission 585 nm Img2 monoméric émission 520 nm notre perception Chen & Smiley

61 Anatomy of a quantum dot Michalet, X, Pinaud, F, Bentolila LA, Tsay J M, Doose S, Li J J, Sundaresan G, Wu A M, Gambhir S S, Weiss S (2005) Quantum dots for live cells, in vivo imaging, and diagnostics. Science 307: Violet

62 Dynamiques de la molécule unique : Single Particle Imaging or Tracking quantum dots = boîtes quantiques colloïdales Diffusion dynamics of glycine receptors revealed by single-quantum dot tracking. Dahan M., Triller A. (2003) Science 302: 442

63 afin de réduire la taille du complexe des boîtes quantiques colloïdales motif AP, puis biotine lyase : Howarth et al. 2005

64 On s imagine d ordinaire que rien n est plus aisé que de faire des expériences; et même des Savants du premier ordre ( ) ont traité cette occupation de frivole et de puérile. Cependant, j ose le dire, elle est d une difficulté infinie ; elle demande beaucoup d art, beaucoup de finesse et de sagacité d esprit. Pierre VAN MUSSENBROEK, 1769 (cité dans Valeur 2004) Marije Scholte, ISV, Gif

Mieux comprendre les fluorochromes pour la microscopie

Mieux comprendre les fluorochromes pour la microscopie La Microscopie confocale Formation Permanente, CNRS, Gif-sur-Yvette octobre 2011 Mieux comprendre les fluorochromes pour la microscopie Spencer BRWN et Christel PUJL*, «Dynamique de la compartimentation

Plus en détail

CELLULAIRE. FORMATION pour le LBFA

CELLULAIRE. FORMATION pour le LBFA CYTOMÉTRIE TRIE EN FLUX ET MICROSCOPIE CONFOCALE: 2 TECHNIQUES COMPLÉMENTAIRES MENTAIRES POUR L EXPLORATION L DU FONCTIONNEMENT CELLULAIRE FORMATION pour le LBFA Cécile COTTET 2006 3 sessions : I- Pré

Plus en détail

Mieux comprendre les fluorochromes pour la microscopie

Mieux comprendre les fluorochromes pour la microscopie La Microscopie confocale Formation Permanente, CNRS, Gif-sur-Yvette octobre 2009 Mieux comprendre les fluorochromes pour la microscopie Spencer BRWN et Christel PUJL*, «Dynamique de la compartimentation

Plus en détail

Fluorochromes et protéines fluorescentes

Fluorochromes et protéines fluorescentes Fluorochromes et protéines fluorescentes Susanne Bolte Formation microscopie photonique CNRS 2010 Quelques rappels sur la fluorescence La fluorescence est l absorption moléculaire d énergie lumineuse à

Plus en détail

VI. Diffusion latérale des lipides et des protéines. VI.1 Diffusion latérale théorique

VI. Diffusion latérale des lipides et des protéines. VI.1 Diffusion latérale théorique Structures et propriétés des membranes biologiques I. Rappels II. Interactions entre les constituants membranaires III. Caractérisation des constituants membranaires IV. Structure et fonctions des protéines

Plus en détail

TRANSFERT DE L ENERGIE D EXCITATION

TRANSFERT DE L ENERGIE D EXCITATION Extinction de fluorescence par Transfert 1. Excitation de M 2. Couplage de type dipôle-dipôle, une partie des M* transmettent leur énergie, i.e. seule une partie des M* fluorescent normalement M* + Q M

Plus en détail

FRET ( Förster / fluorescence resonance energy transfer )

FRET ( Förster / fluorescence resonance energy transfer ) FRET ( Förster / fluorescence resonance energy transfer ) I - Théorie II - Méthodes de mesure III - Applications à des études biologiques IV - Un exemple de l utilisation du FRET : étude de l interaction

Plus en détail

Les appareillages des Spectrométrie optique

Les appareillages des Spectrométrie optique ATELIERS DE BIOPHOTONIQUE Les appareillages des Spectrométrie optique 1. Spectroscopies optiques conventionnelles Spectrophotomètre, Spectrofluorimètre, 2. Analyse Spectrale en Microscopie de fluorescence

Plus en détail

III CRITERES POUR CHOISIR UN COUPLE DE FLUOROPHORES

III CRITERES POUR CHOISIR UN COUPLE DE FLUOROPHORES Page : 17/ 77 III CRITERES POUR CHOISIR UN COUPLE DE FLUOROPHORES Le choix d un couple donneur-accepteur dépend de la technique utilisée (FRET, TR- FRET, BRET, etc.) et des molécules disponibles pour ces

Plus en détail

La fluorescence, les fluorophores

La fluorescence, les fluorophores La fluorescence, les fluorophores Taille d observation et techniques de microscopies électron photon 0.1 1

Plus en détail

FRAP & FLIP. Dossier technique. M1 VRV 2011 Université de Strasbourg

FRAP & FLIP. Dossier technique. M1 VRV 2011 Université de Strasbourg Adrien Paoli Aurore Strugala FRAP & FLIP Technique FRAP Technique FLIP Avantages & inconvénients Exemples d application Alternatives Adrien Paoli Aurore Strugala Introduction > Technique FRAP > Technique

Plus en détail

A l interface entre la Biologie Moléculaire, la Biochimie, l Imagerie et la Médecine

A l interface entre la Biologie Moléculaire, la Biochimie, l Imagerie et la Médecine A l interface entre la Biologie Moléculaire, la Biochimie, l Imagerie et la Médecine L Imagerie Petit Animal : Visualisation de marqueurs in vivo Fluorescence ou Bioluminescence Bruno Combettes HAMAMATSU

Plus en détail

La fluorescence des végétaux

La fluorescence des végétaux La fluorescence des végétaux Définition de la fluorescence La fluorescence est une émission lumineuse provoquée par l excitation d une molécule, généralement par absorption d un photon. Ce signal optique

Plus en détail

Microscopie Confocale. Principes de base & Applications en Biologie Cellulaire

Microscopie Confocale. Principes de base & Applications en Biologie Cellulaire Université Paris Descartes L3 - Licence Professionnelle «Industries chimiques et Pharmaceutiques Option Biotechnologie» Microscopie Confocale Principes de base & Applications en Biologie Cellulaire Bruno

Plus en détail

Photoactivatable Probes for Protein Labeling

Photoactivatable Probes for Protein Labeling Photoactivatable Probes for Protein Labeling THÈSE N O 4660 (2010) PRÉSENTÉE LE 26 MARS 2010 À LA FACULTÉ SCIENCES DE BASE LABORATOIRE D'INGÉNIERIE DES PROTÉINES PROGRAMME DOCTORAL EN CHIMIE ET GÉNIE CHIMIQUE

Plus en détail

Les principes de la spectroscopie de fluorescence : de la théorie à la pratique

Les principes de la spectroscopie de fluorescence : de la théorie à la pratique Les principes de la spectroscopie de fluorescence : de la théorie à la pratique Nathalie Locquet, INRA UMR, INRA-Agroparistech, Ingénierie Procédés Aliments, équipe IAQA (Ingénierie Analytique pour la

Plus en détail

Voyage au cœur du fruit techniques classiques et nouvelles

Voyage au cœur du fruit techniques classiques et nouvelles Voyage au cœur du fruit techniques classiques et nouvelles Catherine Cheniclet UMR 619 Biologie du fruit, Villenave d Ornon Pôle Imagerie du Végétal journées RµI 25-26 novembre 2010 0 jaa Divisions cellulaires

Plus en détail

La PCR en temps réel frederic.gevaudant@bordeaux.inra.fr

La PCR en temps réel frederic.gevaudant@bordeaux.inra.fr La PCR en temps réel frederic.gevaudant@bordeaux.inra.fr INRA Centre de recherche de Bordeaux UMR Biologie du Fruit et Pathologie Historique 1985 : Invention par Kary Mullis de la technique de (PCR). 1991

Plus en détail

Dynamique moléculaire dans la cellule vivante: FRAP, PA-GFP, FLIP

Dynamique moléculaire dans la cellule vivante: FRAP, PA-GFP, FLIP Dynamique moléculaire dans la cellule vivante: FRAP PA-GFP FLIP Christophe KLEIN IFR58 - Service commun d Imagerie Cellulaire et de Cytomètrie Institut Biomédical des Cordeliers - 75006 Paris Christophe.Klein@ifr58.bhdc.jussieu.fr

Plus en détail

Les méthodes d observation

Les méthodes d observation Les méthodes de biologie cellulaire et moléculaire Les méthodes d observation Cocher la (ou les) proposition(s) vraie(s) 1. La limite de résolution d un microscope optique : A. Est la distance à laquelle

Plus en détail

Microscopie Multiphotonique

Microscopie Multiphotonique Microscopie Multiphotonique Philippe Guillaud 2014 Université Pierre et Marie Curie Paris 6 Principaux problèmes rencontrés en microscopie confocale La dégradation rapide des échantillons biologiques et

Plus en détail

Cellules procaryotes (toujours unicellulaire) Cellules eucaryotes (unicellulaire ou pluricellulaire)

Cellules procaryotes (toujours unicellulaire) Cellules eucaryotes (unicellulaire ou pluricellulaire) 4- Organisation structurale et fonctionnelle des cellules Organismes unicellulaires Organismes pluricellulaires cellule Cellules procaryotes (toujours unicellulaire) Cellules eucaryotes (unicellulaire

Plus en détail

Microscopie et imagerie :

Microscopie et imagerie : Microscopie et imagerie : enjeu majeur en sciences du vivant 1. Instrumentation : Microscopie confocale et multiphoton, déconvolution, caméras EMCCD, super-résolution, sélective plane illumination (SPIM),

Plus en détail

La microscopie multi-photons Ou microscopie non linéaire. Théorie & applications

La microscopie multi-photons Ou microscopie non linéaire. Théorie & applications La microscopie multi-photons Ou microscopie non linéaire Théorie & applications F. Brau FP CNRS Avril 2009 Absorption multi-photonique Maria Göppert-Mayer Principe E hc 1931 Prédiction théorique Un atome

Plus en détail

epi-fluorescence microscope

epi-fluorescence microscope epi-fluorescence microscope epi-fluorescence microscope Certaines substances dés qu ils sont excitées avec de la lumière de certain longueur d onde, possèdent-elles la capacité d émettre à nouveau de la

Plus en détail

Bases de la microscopie et quelques aspects avancés

Bases de la microscopie et quelques aspects avancés Bases de la microscopie et quelques aspects avancés Intervenant : François Waharte Plateforme Imagerie Cellulaire et Tissulaire UMR144 Institut Curie Francois.Waharte@curie.fr Bases de la microscopie

Plus en détail

CELLULAIRE. FORMATION pour le LBFA

CELLULAIRE. FORMATION pour le LBFA CYTOMÉTRIE TRIE EN FLUX ET MICROSCOPIE CONFOCALE: 2 TECHNIQUES COMPLÉMENTAIRES MENTAIRES POUR L EXPLORATION L DU FONCTIONNEMENT CELLULAIRE FORMATION pour le LBFA Cécile COTTET 2007 3 sessions : I- Pré

Plus en détail

LE MICROSCOPE OPTIQUE

LE MICROSCOPE OPTIQUE LE MICROSCOPE OPTIQUE Le microscope optique est un instrument d'optique muni d'un système objectif et d'un système habituellement binoculaire qui permet de grossir l'image d'un objet de petites dimensions

Plus en détail

Chimie des matériaux CHM506

Chimie des matériaux CHM506 Chimie des matériaux CHM506 Yue Zhao Properties of Materials Mary Anne White Qu est-ce qui est dans la chimie des matériaux? Covers solid-state chemistry, both inorganic and organic, and polymer chemistry,

Plus en détail

LA MICROSCOPIE CONFOCALE

LA MICROSCOPIE CONFOCALE LA MICROSCOPIE CONFOCALE Philippe COCHARD, Directeur de recherche CNRS Centre de Biologie du Développement UMR 5547 CNRS/UPS Université Paul Sabatier Philippe.cochard@univ-tlse3.fr Principe Fonctionnement

Plus en détail

Les UV ( lampe de Wood, basée sur la fluorescence ultra violette).

Les UV ( lampe de Wood, basée sur la fluorescence ultra violette). Les UV ( lampe de Wood, basée sur la fluorescence ultra violette). Ce type de lumière a été découvert en 1801 par Ritten. Après des recherches par Stoke et Schumann entre 1862 et 1903 c'est en fin de compte

Plus en détail

PRINCIPES THEORIQUES DE LA PCRq

PRINCIPES THEORIQUES DE LA PCRq PRINCIPES THEORIQUES DE LA PCRq Ce chapitre aborde les notions présentées rapidement dans l introduction (Ct, droite standard, principes de la quantification). Il détaille les différents formats de fluorescence

Plus en détail

Microscopie confocale

Microscopie confocale Microscopie confocale principes et applications 27 mars 2014 Plan de la présentation - Qu est-ce que la microscopie confocale? différence entre la microscopie conventionnelle et confocale type de microscopie

Plus en détail

Microscopie à onde évanescente : Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF)

Microscopie à onde évanescente : Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) Microscopie à onde évanescente : Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) Stephanie Bonneau stephanie.bonneau@upmc.fr 1- interaction lumière matière A- Bases physiques de la lumière Une forme d énergie

Plus en détail

Microscopie de fluorescence Etat de l art

Microscopie de fluorescence Etat de l art Etat de l art Bibliométrie (Web of sciences) CLSM GFP & TPE EPI-FLUORESCENCE 1 Fluorescence Diagramme de JABLONSKI S2 S1 10-12 s Excitation Eex Eem 10-9 s Émission Courtoisie de C. Spriet

Plus en détail

Dr E. CHEVRET UE2.1 2013-2014. Aperçu général sur l architecture et les fonctions cellulaires

Dr E. CHEVRET UE2.1 2013-2014. Aperçu général sur l architecture et les fonctions cellulaires Aperçu général sur l architecture et les fonctions cellulaires I. Introduction II. Les microscopes 1. Le microscope optique 2. Le microscope à fluorescence 3. Le microscope confocal 4. Le microscope électronique

Plus en détail

Chapitre I PHENOMENE DE FLUORESCENCE ORIGINE ET PROCESSUS. * hυ hυ

Chapitre I PHENOMENE DE FLUORESCENCE ORIGINE ET PROCESSUS. * hυ hυ Rayons Rayons X Ultra-violets Infra-rouges Micro-ondes Ondes radio 1 Chapitre I PHENOMENE DE FLUORESCENCE ORIGINE ET PROCESSUS Définitions * hυ hυ La fluorescence ou luminescence est l émission d énergie

Plus en détail

Formation de l image en microscopie optique

Formation de l image en microscopie optique Formation de l image en microscopie optique Aude Jobart-Malfait Plateforme de recherche «Imagerie des processus dynamiques en Biologie Cellulaire et Biologie du Développement» IFR 117 Institut Jacques

Plus en détail

Plateau technique Imagerie cellulaire IFR141 ITFM. Responsable Scientifique : Pr C. Poüs Responsable du service : Valérie Nicolas

Plateau technique Imagerie cellulaire IFR141 ITFM. Responsable Scientifique : Pr C. Poüs Responsable du service : Valérie Nicolas Plateau technique Imagerie cellulaire IFR141 ITFM Responsable Scientifique : Pr C. Poüs Responsable du service : Valérie Nicolas «Principe de la microscopie confocale à balayage laser» Formation permanente

Plus en détail

Université Victor Segalen Bordeaux 2 UFR Science de la Vie

Université Victor Segalen Bordeaux 2 UFR Science de la Vie Université Victor Segalen Bordeaux 2 UFR Science de la Vie Licence Professionnelle «Techniques et Applications en Biologie Cellulaire et Biologie Moléculaire» Examen 2006-2007 UE1 : «Technologies en Biologie

Plus en détail

Microscopie de fluorescence

Microscopie de fluorescence Microscopie de fluorescence François MICHEL PhD La microscopie pour débutants (ou pas) Partie 2 Imagerie de fluorescence Ce qui vous attend (encore) Fluorescence?? Microscopie à épi-fluorescence Résolution

Plus en détail

V APPLICATION DES TECHNIQUES DE RET A L ANALYSE DES INTERACTIONS PROTEINE-

V APPLICATION DES TECHNIQUES DE RET A L ANALYSE DES INTERACTIONS PROTEINE- Page : 45/ 77 V APPLICATION DES TECHNIQUES DE RET A L ANALYSE DES INTERACTIONS PROTEINE- PROTEINE : CAS DES RECEPTEURS COUPLES AUX PROTEINES G (RCPG) Les RCPG sont des protéines à sept domaines transmembranaires

Plus en détail

Partec: l innovation en marche depuis 40 ans Principes des appareils de Cytométrie en Flux. Pascal Brunou, David Bastien Partec France

Partec: l innovation en marche depuis 40 ans Principes des appareils de Cytométrie en Flux. Pascal Brunou, David Bastien Partec France 1968 2008 Partec: l innovation en marche depuis 40 ans Principes des appareils de Cytométrie en Flux Pascal Brunou, David Bastien Partec France en Allemagne et partout dans le Monde Société basée à Münster

Plus en détail

Nouvelles techniques d imagerie laser

Nouvelles techniques d imagerie laser Nouvelles techniques d imagerie laser Les chimistes utilisent depuis longtemps les interactions avec la lumière pour observer et caractériser les milieux organiques ou inorganiques. La présence, dans la

Plus en détail

Spectrophotométrie Colorimétrie

Spectrophotométrie Colorimétrie Pharmacie 1 ere année 2002-2003 Spectrophotométrie Colorimétrie ITRODUCTIO... 1 RAPPELS THEORIQUES... 2 DEFIITIOS... 3 LOI DE BEER-LAMBERT... 5 METHODES D AALYSE SPECTROPHOTOMETRIQUE... 6 Méthode de l

Plus en détail

Laurence DUBREIL Responsable Microscopie confocale UMR 703 INRA Ecole Nationale Vétérinaire de Nantes laurence.dubreil@vet-nantes.

Laurence DUBREIL Responsable Microscopie confocale UMR 703 INRA Ecole Nationale Vétérinaire de Nantes laurence.dubreil@vet-nantes. Préparation des échantillons pour l immunohistochimie Application à la microscopie confocale Microscopie confocale : Principe et Pratique Formation permanente INSERM ADR Grand Ouest 19-22 mai 2008 Laurence

Plus en détail

2. La lumière, source d énergie de la photosynthèse est captée par la chlorophylle.

2. La lumière, source d énergie de la photosynthèse est captée par la chlorophylle. Hyp : la chlorophylle absorbe les photons de la lumière et convertit l énergie lumineuse pour permettre la photolyse de l eau et les oxydoréductions mises en évidence précédemment. 2. La lumière, source

Plus en détail

Introduction à la microscopie confocale

Introduction à la microscopie confocale Introduction à la microscopie confocale Sylvette CHASSEROT-GOLAZ Unité CNRS UPR 2356, Strasbourg Principe de la microscopie confocale La microscopie confocale est l'une des percées les plus notables de

Plus en détail

La PCR en temps réel

La PCR en temps réel La PCR en temps réel Hôpital La Rabta Tunis 6 juin 2013 Dr Sabine Favre-Bonté Maître de Conférences, Université Claude Bernard Lyon 1 UMR CNRS 5557 Ecologie Microbienne Equipe Multi-résistance environnementale

Plus en détail

SPECTROSCOPIE RAMAN I APPLICATIONS

SPECTROSCOPIE RAMAN I APPLICATIONS SPECTROSCOPIE RAMAN La spectroscopie Raman est une technique d analyse non destructive, basée sur la détection des photons diffusés inélastiquement suite à l interaction de l échantillon avec un faisceau

Plus en détail

Microscopie de fluorescence

Microscopie de fluorescence Rev : 21/01/2015 Microscopie de fluorescence La microscopie pour débutants (ou pas) Partie 2 François MICHEL PhD Quelques images en fluorescence Ce qui vous attend (encore) Fluorescence?? Microscopie à

Plus en détail

CYTOMETRIE EN FLUX. BD FACSVerse. BD FACSAria III. Adriana.Delwail@univ-poitiers.fr. Journée de Formation et Information 17/11/2014

CYTOMETRIE EN FLUX. BD FACSVerse. BD FACSAria III. Adriana.Delwail@univ-poitiers.fr. Journée de Formation et Information 17/11/2014 CYTOMETRIE EN FLUX BD FACSVerse BD FACSAria III Journée de Formation et Information 17/11/2014 Adriana.Delwail@univ-poitiers.fr CYTOMETRIE EN FLUX Principe Applications Tri Qu est que ce la cytométrie

Plus en détail

Chapitre II PHÉNOMÈNES RADIATIFS: PROPRIÉTÉS D EMISSION. f AB = mc 2 e 2. β 1 k(υ)dυ N

Chapitre II PHÉNOMÈNES RADIATIFS: PROPRIÉTÉS D EMISSION. f AB = mc 2 e 2. β 1 k(υ)dυ N 8 Chapitre II PHÉNOMÈNES RADIATIFS: PROPRIÉTÉS D EMISSION Compte tenu des règles de sélection une émission peut être observée si un gap d énergie important existe entre l état fondamental et un des états

Plus en détail

Les objets de l évolution :

Les objets de l évolution : Les objets de l évolution : éléments de biologie cellulaire Table des matières Les 3 règnes et leurs spécificitéss Les cellules procaryotes Les cellules eucaryotes Les cellules végétales Les cellules de

Plus en détail

Spectrophotométrie appliquée aux biomolécules

Spectrophotométrie appliquée aux biomolécules UNIVERSITE FRANCOIS RABELAIS FACULTE DES SCIENCES ET TECHNIQUES TOURS Licence L1 Science et Technologies Mention Sciences du Vivant TRAVAUX PRATIQUES: BIOCHIMIE STRUCTURALE Spectrophotométrie appliquée

Plus en détail

NANOPARTICULES D ORD Qu en attendent les biologistes?

NANOPARTICULES D ORD Qu en attendent les biologistes? NANOPARTICULE D ORD Qu en attendent les biologistes? Gérard Morel Laboratoire de Physiologie Intégrative Cellulaire et Moléculaire UMR 5123 CNR téphane Roux Laboratoire de Physico-Chimie des Matériaux

Plus en détail

Rapport final LA VOIE DE SECRETION D UNE CELLULE HUMAINE. Différentes techniques de visualisation des compartiments cellulaires

Rapport final LA VOIE DE SECRETION D UNE CELLULE HUMAINE. Différentes techniques de visualisation des compartiments cellulaires Loïc Martin 6 avril 2012 Rapport final LA VOIE DE SECRETION D UNE CELLULE HUMAINE Différentes techniques de visualisation des compartiments cellulaires Travail effectué, à l'université de Genève, Sciences

Plus en détail

Travaux Dirigés de Biologie Cellulaire. TD n 1 Compléments sur les microscopes

Travaux Dirigés de Biologie Cellulaire. TD n 1 Compléments sur les microscopes Travaux Dirigés de Biologie Cellulaire TD n 1 Compléments sur les microscopes Les différents types de microscopes photoniques A. Le microscope à fond noir B.Le microscope polarisant C.Le microscope à contraste

Plus en détail

ATELIER EPIGENETIQUE

ATELIER EPIGENETIQUE Juin 2012 ATELIER EPIGENETIQUE Utilisation de la Q-PCR pour analyser des données de ChIP ou de MeDIP Emmanuèle Mouchel-Vielh I. La PCR quantitative: principe et généralités II. Interprétation des résultats

Plus en détail

Principe de la microscopie par absorption biphotonique. La microscopie à 2 photons

Principe de la microscopie par absorption biphotonique. La microscopie à 2 photons Principe de la microscopie par absorption biphotonique L optique non-linéaire ou 1 photon + 1 photon = 1photon! Principe de la fluorescence Absorption Emission e 1 > e 2 λ 1 < λ 2 e 2 = hν 2 e 1 = hν 1

Plus en détail

Intérêt de la fluorescence. La finesse

Intérêt de la fluorescence. La finesse Intérêt de la fluorescence La finesse R R V B lumière blanche chromophore V B En fond clair: le contraste est du à l absorption des photons par les chromophores excitation λ1 bleu λ2 > λ1 émission λ2 vert

Plus en détail

Start Pane. Microscopie confocale - 2010

Start Pane. Microscopie confocale - 2010 Start Pane Microscopie confocale - 2010 1 Microscopie Confocale Introduction Historique Fluorescence Résolution Microscopie Confocale Applications et exploitation des données Immunomarquages Réflection

Plus en détail

PhotoPhysique des Protéines Fluorescentes (P3F)

PhotoPhysique des Protéines Fluorescentes (P3F) PhotoPhysique des Protéines Fluorescentes (P3F) BIO (F. Merola, M. Erard, A. Espagne, H. Laguitton-Pasquier) Spectroscopie d émission de fluorescence résolue en temps CTM (I. Demachy, J. Ridard, B. Levy,

Plus en détail

PRINCIPES DE SPECTROSCOPIE UV-VISIBLE

PRINCIPES DE SPECTROSCOPIE UV-VISIBLE Licence MPC L3 S5 «Chimie Organique Avancée» PRINCIPES DE SPECTROSCOPIE UV-VISIBLE 1. Introduction: le spectre électromagnétique 2. Spectres UV-visible, spectres électroniques 3. Appareillage 4. Applications

Plus en détail

LA PHOTOSYNTHÈSE : un mécanisme de photophosphorylation

LA PHOTOSYNTHÈSE : un mécanisme de photophosphorylation LA PHOTOSYNTHÈSE : un mécanisme de photophosphorylation Les végétaux photosynthétiques captent et transforment l'énergie solaire sous forme d'atp et de NADPH. Ces molécules sont alors utilisées pour la

Plus en détail

Elvire Guiot. To cite this version: HAL Id: tel-00010025 https://tel.archives-ouvertes.fr/tel-00010025

Elvire Guiot. To cite this version: HAL Id: tel-00010025 https://tel.archives-ouvertes.fr/tel-00010025 microscopie de fluorescence par excitation à deux photons : application à des études de corrélations et de déclins de fluorescence en milieu biologique Elvire Guiot To cite this version: Elvire Guiot.

Plus en détail

Spectroscopie d émission: Luminescence. 1. Principe 2. Exemples et applications 3. Lasers (Rubis et YAG)

Spectroscopie d émission: Luminescence. 1. Principe 2. Exemples et applications 3. Lasers (Rubis et YAG) Spectroscopie d émission: Luminescence 1. Principe 2. Exemples et applications 3. Lasers (Rubis et YAG) I. Principe Etat excité instable Photon Retour à l état fondamental??? Conversion interne (non radiatif)

Plus en détail

Macromolécules et la Cellule

Macromolécules et la Cellule Macromolécules et la Cellule Macromolécules Campbell chapitre 5 Macromolécules Définition: Molécule géante formée par l assemblage de plusieurs petites molécules organiques Macromolécules Définition:

Plus en détail

Chapitre 02. La lumière des étoiles. Exercices :

Chapitre 02. La lumière des étoiles. Exercices : Chapitre 02 La lumière des étoiles. I- Lumière monochromatique et lumière polychromatique. )- Expérience de Newton (642 727). 2)- Expérience avec la lumière émise par un Laser. 3)- Radiation et longueur

Plus en détail

Revue de processus service Imagerie 1/04/2015

Revue de processus service Imagerie 1/04/2015 Revue de processus service Imagerie 1/04/2015 Réunion des utilisateurs des vidéo microscopes et apotomes ObserverZ1 colibri1 salle 7014 ImagerZ1 Apo salle 1023 Responsable Vidéo et Mécanique Brice DETAILLEUR

Plus en détail

Application de la technique de spectroscopie de fluorescence à la caractérisation de la matière organique. naturelles

Application de la technique de spectroscopie de fluorescence à la caractérisation de la matière organique. naturelles Application de la technique de spectroscopie de fluorescence à la caractérisation de la matière organique dissoute (MOD) dans les eaux naturelles E. Parlanti (LPTC) des systèmes naturels UMR 5472 CNRS

Plus en détail

POPULATION D ADN COMPLEXE - ADN génomique ou - copie d ARNm = CDNA

POPULATION D ADN COMPLEXE - ADN génomique ou - copie d ARNm = CDNA POPULATION D ADN COMPLEXE - ADN génomique ou - copie d ARNm = CDNA Amplification spécifique Détection spécifique Clonage dans des vecteurs Amplification in vitro PCR Hybridation moléculaire - hôte cellulaire

Plus en détail

Sondes actives à base de nanocristaux individuels de CdSe pour l optique en champ proche

Sondes actives à base de nanocristaux individuels de CdSe pour l optique en champ proche Sondes actives à base de nanocristaux individuels de CdSe pour l optique en champ proche N. Chevalier, M. J. Nasse, Y. Sonnefraud J.F. Motte, J.C. Woehl, S. Huant Laboratoire de Spectrométrie Physique,

Plus en détail

La microscopie optique. Nicolas Sandeau Maître de Conférences

La microscopie optique. Nicolas Sandeau Maître de Conférences La microscopie optique Nicolas Sandeau Maître de Conférences A quoi ça sert? Observer un objet, un phénomène avec une bonne résolution spatiale (voire temporelle) sans trop de perturbations (innocuité).

Plus en détail

Chapitre 2 : Organisation de la cellule

Chapitre 2 : Organisation de la cellule Partie 1 : notions de biologie cellulaire DAEU- Cours Sciences de la Nature & de la Vie- Marc Cantaloube Chapitre 2 : Organisation de la cellule La cellule est l unité de base des êtres vivants. Il existe

Plus en détail

La spectrophotométrie permet l'étude de solutions colorées dans l'infrarouge (1 100 nm au maximum), dans le visible et dans l'ultraviolet (190 nm).

La spectrophotométrie permet l'étude de solutions colorées dans l'infrarouge (1 100 nm au maximum), dans le visible et dans l'ultraviolet (190 nm). Spectrophotométrie Spectrophotométrie La spectrophotométrie permet l'étude de solutions colorées dans l'infrarouge (1 100 nm au maximum), dans le visible et dans l'ultraviolet (190 nm). Spectre d'absorption

Plus en détail

Microscopies plein champs 3D & 3D n couleurs+temps

Microscopies plein champs 3D & 3D n couleurs+temps Microscopies plein champs 3D & 3D n couleurs+temps Dr Fabrice Cordelières, IR2 CNRS Institut Curie - Section de recherche/ CNRS UMR 146 Plateforme d'imagerie Cellulaire Bâtiment 112 - Centre universitaire

Plus en détail

Lumière et couleur. 2 Rayonnement polychromatique et monochromatique.

Lumière et couleur. 2 Rayonnement polychromatique et monochromatique. Chapitre 19 Sciences Physiques - BTS Lumière et couleur 1 Introduction. La lumière fait partie des ondes électromagnétiques qui vont des rayons cosmiques aux ondes radar. Ces ondes se différencient par

Plus en détail

La membrane plasmique

La membrane plasmique La membrane plasmique Les molécules qui composent la membrane plasmique 1. Les lipides ls sont amphiphiles ou amphipatiques (une partie hydrophobe et une partie hydrophile) (amphi= des deux cotés, phile

Plus en détail

Application et méthodologie d acquisition d images

Application et méthodologie d acquisition d images Application et méthodologie d acquisition d images Application industrielle et acquisition de l image 2 Imagerie industrielle est utilisée comme outil de contrôle et de gestion augmentation flexibilité

Plus en détail

Plateau technique de cytométrie Fatima-Ezzahra L Faqihi-Olive, IE université. Alger,08/05/07 F-E L'Faqihi-Olive, IFR30 Toulouse 1

Plateau technique de cytométrie Fatima-Ezzahra L Faqihi-Olive, IE université. Alger,08/05/07 F-E L'Faqihi-Olive, IFR30 Toulouse 1 Plateau technique de cytométrie Fatima-Ezzahra L Faqihi-Olive, IE université Alger,08/05/07 F-E L'Faqihi-Olive, IFR30 Toulouse 1 Plateau technique de cytométrie Fatima-Ezzahra L Faqihi-Olive, IE université

Plus en détail

EXERCICE 2 : SUIVI CINETIQUE D UNE TRANSFORMATION PAR SPECTROPHOTOMETRIE (6 points)

EXERCICE 2 : SUIVI CINETIQUE D UNE TRANSFORMATION PAR SPECTROPHOTOMETRIE (6 points) BAC S 2011 LIBAN http://labolycee.org EXERCICE 2 : SUIVI CINETIQUE D UNE TRANSFORMATION PAR SPECTROPHOTOMETRIE (6 points) Les parties A et B sont indépendantes. A : Étude du fonctionnement d un spectrophotomètre

Plus en détail

INSTRUMENTS DE MESURE

INSTRUMENTS DE MESURE INSTRUMENTS DE MESURE Diagnostique d impulsions lasers brèves Auto corrélateur à balayage modèle AA-10DD Compact et facile d emploi et de réglage, l auto corrélateur AA-10DD permet de mesurer des durées

Plus en détail

1.Principe 2.Algorhithmes 3.Détail de mise en oeuvre 4.Analyse des simulations 5.Relation avec des grandeurs expérimentales

1.Principe 2.Algorhithmes 3.Détail de mise en oeuvre 4.Analyse des simulations 5.Relation avec des grandeurs expérimentales II. Simulations de dynamique moléculaire 1.Principe 2.Algorhithmes 3.Détail de mise en oeuvre 4.Analyse des simulations 5.Relation avec des grandeurs Relation avec la structrure (le modèle) expérimental(e)

Plus en détail

Les techniques de préparation des coupes pour les microscopies optique et électronique

Les techniques de préparation des coupes pour les microscopies optique et électronique Université Mohammed V-Agdal Faculté des Sciences de Rabat Laboratoire de Zoologie et de Biologie générale Les techniques de préparation des coupes pour les microscopies optique et électronique Histologie-Embryologie

Plus en détail

ANALYSE SPECTRALE. monochromateur

ANALYSE SPECTRALE. monochromateur ht ANALYSE SPECTRALE Une espèce chimique est susceptible d interagir avec un rayonnement électromagnétique. L étude de l intensité du rayonnement (absorbé ou réémis) en fonction des longueurs d ode s appelle

Plus en détail

Energie. L intérêt de ce milieu amplificateur est que la fréquence de la transition laser, ν 0 = E 2 E 1

Energie. L intérêt de ce milieu amplificateur est que la fréquence de la transition laser, ν 0 = E 2 E 1 1 Université Paris XI Centre d Orsay Master 1 de Physique Fondamentale Magistère de Physique Fondamentale 2 ième année Examen de Physique des Lasers Examen de 2 ieme cycle Première session 2011-2012 Épreuve

Plus en détail

Mesures de PAR. Densité de flux de photons utiles pour la photosynthèse

Mesures de PAR. Densité de flux de photons utiles pour la photosynthèse Densité de flux de photons utiles pour la photosynthèse Le rayonnement lumineux joue un rôle critique dans le processus biologique et chimique de la vie sur terre. Il intervient notamment dans sur les

Plus en détail

Comprendre l Univers grâce aux messages de la lumière

Comprendre l Univers grâce aux messages de la lumière Seconde / P4 Comprendre l Univers grâce aux messages de la lumière 1/ EXPLORATION DE L UNIVERS Dans notre environnement quotidien, les dimensions, les distances sont à l échelle humaine : quelques mètres,

Plus en détail

Spectrophotométrie - Dilution 1 Dilution et facteur de dilution. 1.1 Mode opératoire :

Spectrophotométrie - Dilution 1 Dilution et facteur de dilution. 1.1 Mode opératoire : Spectrophotométrie - Dilution 1 Dilution et facteur de dilution. 1.1 Mode opératoire : 1. Prélever ml de la solution mère à la pipette jaugée. Est-ce que je sais : Mettre une propipette sur une pipette

Plus en détail

INVESTIGATIONS TECHNIQUES EN PHYSIOPATHOLOGIE CELLULAIRE ET MOLECULAIRE Partie I. La transfection. Responsable : Valérie Chopin.

INVESTIGATIONS TECHNIQUES EN PHYSIOPATHOLOGIE CELLULAIRE ET MOLECULAIRE Partie I. La transfection. Responsable : Valérie Chopin. INVESTIGATIONS TECHNIQUES EN PHYSIOPATHOLOGIE CELLULAIRE ET MOLECULAIRE Partie I La transfection Responsable : Valérie Chopin LBH semestre 6 Faculté des Sciences Laboratoire de Physiologie Cellulaire et

Plus en détail

LA PCR QUANTITATIVE EN TEMPS REEL OU LA "TAQMAN"

LA PCR QUANTITATIVE EN TEMPS REEL OU LA TAQMAN LA PCR QUANTITATIVE EN TEMPS REEL OU LA "TAQMAN" I- Terminologie Le terme TaqMan est souvent utilisé par abus de langage pour désigner : - la technique de PCR quantitative par détection en temps réel de

Plus en détail

cpgedupuydelome.fr -PC Lorient

cpgedupuydelome.fr -PC Lorient Première partie Modèle scalaire des ondes lumineuses On se place dans le cadre de l optique géométrique 1 Modèle de propagation 1.1 Aspect ondulatoire Notion d onde électromagnétique On considère une onde

Plus en détail

Partie Observer : Ondes et matière CHAP 04-ACT/DOC Analyse spectrale : Spectroscopies IR et RMN

Partie Observer : Ondes et matière CHAP 04-ACT/DOC Analyse spectrale : Spectroscopies IR et RMN Partie Observer : Ondes et matière CHAP 04-ACT/DOC Analyse spectrale : Spectroscopies IR et RMN Objectifs : Exploiter un spectre infrarouge pour déterminer des groupes caractéristiques Relier un spectre

Plus en détail

La super-résolution. Malgré les avancées considérables CAHIER TECHNIQUE COMPRENDRE

La super-résolution. Malgré les avancées considérables CAHIER TECHNIQUE COMPRENDRE CAHIER TECHNIQUE La super-résolution Guillaume DUPUIS Maître de conférences Centre de Photonique Biomédicale Centre Laser de l Université Paris-Sud, Fédération LUMAT FR 2764, 91405 Orsay guillaume.dupuis@u-psud.fr

Plus en détail

Examen Méthodes spectroscopiques 2

Examen Méthodes spectroscopiques 2 16 décembre 2010 Examen Méthodes spectroscopiques 2 Durée 2 h Calculatrice et tables spectroscopiques (fournies en début d année) autorisées Exercice 1 (3 pts 10min) Il est possible de doser simultanément

Plus en détail

Physique avec les systèmes vivants... et avec de l optique.

Physique avec les systèmes vivants... et avec de l optique. Physique avec les systèmes vivants... et avec de l optique. Antoine DELON : enseignant-chercheur au Laboratoire Interdisciplinaire de Physique Microscopie optique pour la biologie (biophotonique) antoine.delon@ujf-grenoble.fr

Plus en détail

Quelques notions de génomique fonctionnelle: l exemple des puces à ADN

Quelques notions de génomique fonctionnelle: l exemple des puces à ADN Quelques notions de génomique fonctionnelle: l exemple des puces à ADN Frédéric Devaux Laboratoire de génétique moléculaire Ecole Normale Supérieure Le «dogme central» de la biologie moléculaire Transcription

Plus en détail

La biophotonique pour l étude de la dynamique et des interactions moléculaires dans le noyau

La biophotonique pour l étude de la dynamique et des interactions moléculaires dans le noyau Plan: Introduction: Dynamique des réseaux de régulation Cellules uniques vs ensemble de cellules La biophotonique pour l étude de la dynamique et des interactions moléculaires dans le noyau Mesure de dynamique

Plus en détail