Mieux comprendre les fluorochromes pour la microscopie confocale

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1 Spencer BROWN, Dynamique de la compartimentation cellulaire, Béatrice SATIAT-JEUNEMAITRE, Olivier CATRICE, Institut des Sciences du Végétal, CNRS UPR2355, Gif-sur-Yvette et Susanne BOLTE, Marie-Noëlle SOLER IFR87 " La Plante et son environnement et Christel TALBOT, Plate-forme d'imagerie Cellulaire de l'institut de Neurosciences, Université de Bordeaux II Mieux comprendre les fluorochromes pour la microscopie confocale Processus physique et ses implications : spectres Autres propriétés des fluorochromes L environnement Montage de l échantillon Recouvrement des spectres d émission Choix d une sonde fluorescente Chargement, quantification, chromatisme, Techniques ratiométriques Les protéines fluorescentes Susanne Bolte Brown, S., Bolte, S., Satiat-Jeunemaître B. (2007) Tracking Gene Expression in Plant Cells: Microscopy and associated bio-imaging techniques. Chapter 13 in: Functional Genomics: From Sequence to Function in Plants, JF Morot-Gaudry, P Lea et JF Briat (eds) Science Publishers, UK, pp

2 Un marqueur pour chaque compartiment, ou pour chaque fonction? bisbenzimide Hoechst endosomes LY lissamine-rhodamine-dextran AF-actin DiIC1(5) DeBiasio et al. 1987

3 intensité, spectre, durée de vie de la fluorescence, anisotropie d émission fluoro-chromasia Acridine Orange

4 Aniline Blue : ß 1-3 glucanes insolubles Calcofluor White sur algues avec phycobiliprotéines

5 N Peroxisomes Nuclear membrane Tonoplast Vac Endoplasmic reticulum (ER+RER) Golgi stacks Plasma membrane Chloroplastes Mitochondria + cytoskeleton : actin, tubulin, etc. Cell Wall

6 GFP cible mitochondria autofluorescence de chlorophylle DsRed cible mitochondria GFP cible plastes Ian Small, INRA Evry

7 Cytoskeletal organisation in Medicago T. Hanh Trinh

8 LUMINESCENCE PHOTO-LUMINESCENCE CHIMI-LUMINESCENCE BIO-LUMINESCENCE Fluorescence Phosphorescence THERMO-LUMINESCENCE court tau τ f long ELECTRO-LUMINESCENCE singulet triplet etc Bernard VALEUR (2002, 2004) ; Cachan & CNAM

9 Diagramme simplifié des niveaux d énergie d une molécule polyatomique Jablonski energy diagram S 2 Niveaux d énergie niveau virtuel Raman Stokes & anti-stokes (inélastique, sans absorption) singulet T 1 S 0 phosphorescence S 1 cis absorption ~ps fluorescence ~fs ~ns ci vi v0 quenching de fluorescence 10-9 à10-7 s transfert d énergie à10-4 s S 1 cis phosphorescence 10-8 à10-2 s S 0 T 1 triplet

10 TPA : two-photon absorption l absorption quasi-simultanée (fs) de deux photons de faible énergie. Les spectres d excitation biphotonique ressemblent à peu près aux spectres conventionnels d absorption décalés d un facteur 2x sur l axe λ (

11 OH Spectre d absorption et d émission de l iso-thiocyanate de fluorescéine et de la chlorophylle in situ O N C S COOH O fluorescèine ITC PM 389 dalton acide faible pka ~6,4 Q 0,85 ε M -1. cm -1 Propriétés: absorptivité moyenne Absorbance (DO, ) Intensité (UA, ) bon rendement quantique peu encombrante divers analogues disponible iso-thiocyanate de fluorescéine déplacement de Stokes excitation Chlorella vulgaris émission Longueur d onde (nm) Intensité (UA, ) Intensité (UA, ) Figure 2.

12 Diagramme simplifié des niveaux d énergie d une molécule polyatomique Jablonski energy diagram S 2 T 1 Niveaux d énergie S 0 transfert d énergie à10-4 s S 1 cis S 0 T 1 phosphorescence 10-8 à10-2 s Raman Stokes & anti-stokes S 1 cis ~ps phosphorescence fluorescence quenching de fluorescence 10-9 à10-7 s ci absorption ~fs ~ns

13 Spectre d absorption et d émission de l iso-thiocyanate de fluorescéine et du propidium OH O O COOH N C S Intensité (UA, ) 1 iso-thiocyanate de fluorescéine excitation émission Intensité (UA, ) 0 NH 2 NH 2 propidium N + C 2 H 3 (CH 2 ) N CH 3 C 2 H 5 Intensité (UA, ) Longueur d onde (nm) Intensité (UA, )

14 Spectres et «déplacement de Stokes» Longueur d onde λ du maximum d excitation < λ du maximum d émission Déplacement de Stokes = la distance entre les maxima d'excitation et d'émission Exemple: pour la fluorescéine, respectivement 495 nm et 521 nm, déplacement de Stokes = 26 nm. Des complexes offrent un déplacement de Stokes important vis. chlorophylle, iodure de propidium, ECD, Red670, Tricolor, Cychrome et les Nano-particules colloïdales Quantum Dots et les particules à émission anti-stokes upconverted luminescence nanocrystals Wu S, Han G, Milliron DJ, Aloni S, Altoe V, Talapin DV, Cohen BE, Schuck PJ. (2009) Non-blinking and photostable upconverted luminescence from single lanthanide-doped nanocrystals. PNAS Early Edition, July 2009

15 phi Rendement quantique φ f = rapport du nombre total de photons émis dans tout le spectre d'émission de fluorescence au nombre de photons reçus et absorbés dans la zone spectrale d'excitation rendement quantique, I f = φ f I a I f émettant (f) la lumière et I a = nombre de quanta par unité de temps et de surface recevant (a) et ( φ f 0,85 pour la fluorescéine )

16 Coefficient d'extinction, ε, ou absorbance spécifique = absorbtivité molaire Sa valeur peut constituer un critère pour le choix des colorants ; plus ε est grand, plus la fluorescence sera élevée à intensité lumineuse incidente égale. ( Pour la fluorescéine à 488 nm, ε = 8 x 10 4 M -1. cm -1 ) Avec une absorbance spécifique très réduite ( ε.c.l < 0,02 ), on peut linéariser la fonction exponentielle, avec Log10 2,3 I f 2,3 φ f. I o. ε.c.l C, concentration du fluorophore I f, intensité d'émission

17 " Brillance " La "brillance" est proportionnelle à ε et φ ε φ «brillance» ( M -1. cm -1 ) ( unités arbitraires ) Fluorescéine , Cyanine , EYFP , B-phycoérythrine , Tryptophan ,1 600 Quantum Dot , Quantum Dot , (à 490 nm) Pour Non Linear Optics: Action cross section = absorption cross section (spécifique de NLO) multiplié par le rendement quantique 1 Göppert-Mayer = cm 4. s

18 tau Durée de vie du singulet excité le plus bas = la constante de temps de déclin de fluorescence, τ f τ f = φ f. τ N τ N, constante de temps intrinsèque de l'état excité (en considérant seulement la fluorescence). (τ f 4 ns pour la fluorescéine dans l'eau) φ F, rendement quantique Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy, FLIM phi

19 Transfert d'énergie par résonance (loi de Förster) Förster (Fluorescence) Resonant Energy Transfer = FRET Chevauchement du spectre d'émission d un donneur d'énergie et du spectre d absorption d un accepteur d'énergie : Excitation du donneur et émission de l'accepteur k ET = 1 / τ D. ( R o / R ) 6 k ET, constante de cinétique pour resonant energy transfer, RET τ D, durée de vie du donneur R o, constante de la distance critique (en nm) pour un couple donneur accepteur R, distance moyenne effective (en nm) entre les centres des dipôles donneur accepteur. Donc, le transfert d'énergie par résonance non radiatif est proportionnel à R -6. Notons que des transferts d'énergie sont importants dans des complexes chlorophylliens. L occurrence de FRET réduit le durée de vie apparente du donneur, τ D.

20 Intra-molecular FRET Violet or UV excited green to blue B-lactamase substrate Knapp et al. Cytometry (2003) Part A 51A: Aurora Company, Roger Tsien

21 Mesure de calcium avec le Biosenseur CAMELEON: CFP Calmodulin M13 YFP Allen et al., Ca 2+ -Ca 2+ Changement conformationnel 440 nm 480 nm FRET YFP 530 nm CFP 4Ca nm Les applications de la microscopie confocale en biologie végétale/susanne Bolte IFR87

22 caspase3 indicator CFP-DEVD-YFP in staurosporine-treated HeLa cells caspase3 X CFP-DEVD-YFP ex 430 nm, em nm ex 430 nm, em nm DAPI ex 357 nm, em nm 1.46 YFP/CFP 0.83 Intra-molecular FRET Mark JEPSON & Darran CLEMENTS, Bristol Univ. The Biochemist, June 2004, 30-34

23 Resonant Energy Transfer RET Förster (Fluorescence) Resonant Energy Transfer FRET Sonde permeante fluorescente bleu/verte pour l activité β lactamase. sondes calciques Cameleon, typiquement CFP-YFP Biosensors e.g. protéines périplasmiques fusionnées avec CFP/YFP Fehr (2004) PCR quantitative, un fluorophore et un quencher sont placés à proximité l'un de l'autre sur un même oligonucléotide Molecular Beacons ( balises moléculaires ) L'oligonucléotide libre forme par auto-hybridation une épingle à cheveux qui amène le fluorophore à proximité du quencher. Lors de l'hybridation avec un autre fragment d'adn, cette compétition amène une linéarisation de l'oligonucléotide, et le fluorophore est alors éloigné du quencher. «sondes FRET d'hybridation» homo-fret est dépolarisant GFP/GFP (Grandjean, Versailles) FRET inter-moléculaire FITC/TRITC ; CFP/YFP ; GFP/mCHERRY ; GFP/Cy3.18 Bioluminescence Resonant Energy Transfer BRET et CRET BRET2 utilise Renilla luciferase sur coelentérazine (DeepBlueC) qui transfert à GFP2. Black Hole Quenchers, Dabcyl et TAMRA (Qiagen Operon Product Guide 2002,

24 Autres propriétés Température : généralement l intensité augmente quand la température baisse Polarisation : absorption favorable si champs électromagnétique du photon // dipôle d absorption ; ensuite émission isotrope ou anisotrope, d après les cinétiques de rotation. par exemple, un fluorophore cylindrique dans un membrane Photostabilité : Perte de fluorescence (fading): fluorescéine versus rhodamine ; Alexas ; QuantumDots FRAP (Fluorescence Recovery/Redistribution After Photobleaching) FMI-43, FM4-64 styryl dyes, membranaires Rouge Neutre (Neutral Red; abs max 533, pka 6.7) Photo-activable Photo-convertible PA-GFP inductible par 413 nm Kaede, Eos, Dendra ; ou DRONPA réversible L importance donc du milieu de montage

25 L environnement Un déplacement d absorption vers des longueurs d onde courte se dit hypsochromique. Un déplacement d absorption vers des longueurs d onde longue se dit bathochromique. effet Solvant Nile Red (Rouge de Nil) : jaune triglycérides neutres ; rouge phospholipides polaires Nile Blue : jaunes lipides ; rouge protéines NBD (nitrobenzoxadiazole) Q est 10 fois moins dans un environnement aqueux : insertion membranaire critique ph - FITC pka 6,4 polarité - BCECF-AM pka 6,98 - EGFP pka 5,5 - EYFP pka 6,9 Ions métalliques mithramycine et chromomycine Mg 2+ essentiel Hoechst bromure quench sondes chélatrices de calcium Mn 2+ quench YFP chlore quench potentiel électrique liaison hydrogène ions Fluorescence moléculaire ph quenchers pression température viscosité Concentration ou agrégation carboxy-fluorescéine : non fluorescent à 100 mm JC-1 formation de J-agrégats, alors I rouge /I vert reflète l hyperpolarisation Bernard VALEUR (2002), CNAM Figure 3.

26 Protoplast from suspension cells of Arabidopsis in protoplasts & cells imagerie in CHAPS micelles spectrofluorométrie bathochrome base de données Transmission DIC hypsochrome Amphiphilic amino-styrene dye FM4-64 : emission spectrum Fluorescence Bolte S, Talbot C, Boutte Y, Catrice O, Read ND, Satiat-Jeunemaitre B (2004) FM-dyes as experimental probes for dissecting vesicle trafficking in living plant cells. J. Microscopy, 214,

27 Quenching Quenching dynamique Quenching statique RET : transfert d énergie à distance et bien sûr la photo-destruction

28 How many Photons? Consider 1 mw of power at 488 nm focused to a Gaussian spot whose radius at 1/e 2 intensity is 0.25 μm via a 1.25 NA objective The peak intensity at the center will be 10-3 W [π.(0.25 x 10-4 cm) 2 ] = 5.1 x 10 5 W/cm 2 or 1.25 x photons/(cm 2 sec -1 ) At this power, FITC would have 63% of its molecules in an excited state and 37% in ground state at any one time J. Paul Robinson, Purdue University Cytometry Laboratories

29 Photobleaching example FITC : At 4.4 x photons cm -2 sec -1 FITC bleaches with a quantum efficiency Q b of 3 x 10-5 Therefore FITC would be bleaching with a rate constant of 4.2 x 10 3 sec -1 so 37% of the molecules would remain after 240 µsec of irradiation. In a single plane, 16 scans would cause 6-50% bleaching J. Paul Robinson, Purdue University Cytometry Laboratories

30 transparence indexe de réfraction stabilité Milieu de montage respect des structures et volumes viscosité osmolarité ph (pka) ions antioxydant(s) pièges à radicaux libres (DABCO, etc.) et aux composés phénoliques (PVP) permanence On stocke ses préparations fixées à 4 C. Pour cellules vivantes : quencheurs de radicaux libres tel caroténoïdes (50 mm crocétine ou etretinate) ; ascorbate, imidazole, histidine, cystéamine, glutathion réduite, Trolox (analogue de vitamine E) voire notre base : Milieu de montage J. Paul Robinson, Purdue University Cytometry Laboratories

31 Maîtriser les Indices de Réfraction perdu n = 1.52 Objectifs n = 1.5 n = 1.52 Huile Air n = 1.0 Eau n= 1.33 n=1.52 Lamelle n = 1.52 n=1.52 Specimen Eau n= 1.33

32 Quel choix de fluorochromes?! Le marquage des cellules par des fluorochromes permet d'accéder à des informations arbitrairement classées en deux catégories - les paramètres structuraux - les paramètres fonctionnels M-H Ratinaud

33 hybridation in situ : réflectance sur l argent avec autofluorescence tissulaire nodule de Medicago : Fugier et Crespi (1994)

34 Glucuronidase report assessed by confocal microscopy develop the GUS reaction only weakly ; chlorhydrate ; fix ; gomme arabique Epi-reflectance confocal image (blue) superposed upon DIC transmission image A tissue-specific promotor of the vegetative apical meristem in Arabidopsis (200 images with z = 0.2 µm) Nathalie Glab and Séverine Domenichini, IBP, CNRS, UMR8618, Orsay

35 Autofluorescence chez la betterave et le pois modifié de Cerovic et al, 1999 phenylalanine tyrosine, tryptophan NAD(P)H, acide férulique, coumarines, alcaloïdes flavines, FAD, FMN chlorophylles, porphyrines (hème), rhodopsine en IR : matériaux phycobiliprotéines

36 Excitation UV sur le plan d une coupe transversale de feuille de Daphniphyllum macropodum et si on irradie par l épiderme en UV, vis, IR? coumarines phénoliques chlorophylle flavines (lignine) Chlorophylle comme sonde pour apprécier les polyphénoles d après leur effet d écran Zoran Cerovic Cerovic et al, 1999 ; Meyer et al Equipe de Biospectroscopie Végétale, Laboratoire d'ecologie Systématique et Evolution (UMR 8079), Université Paris-Sud 11

37 broad bean rye rye NH 3 Naturstoffreagenz A spruce Hutzler P, Fischbach R, Heller W, Jungblut TP, Reuber S, Schmitz R, Veit M., Weissenbo G, Schnitzler JP (1998) Tissue localization of phenolic compounds in plants by confocal laser scanning microscopy. J. Exp Bot., 49,

38 Plastids of live mesophyll of Commelina communis, with 1200 nm excitation THG 400 nm SHG 600 Biphoton Overlay Third Harmonic Second Harmonic autofluorescence Generation Generation des éléments contrastants complémentaires P-C Cheng, National Taiwan University, Taipei. Figure 36 in Feijo, J.A., Moreno, N Imaging plant cells by two-photon excitation. Protoplasma, 22, 1-32

39 Action cross section = absorption cross section multiplied by the fluorescence quantum yield 1 Göppert-Mayer = cm 4. s Fig. 1. Two-photon action cross sections and emission spectra from a basis set of biological molecules that contribute much of the intracellular 2PE intrinsic fluorescence. (a). In buffered (ph 7.2) saline solution, except retinol and cholecalciferol (vit D), which were measured in EtOH. Riboflavin, cholecalciferol, and NADH were measured at 100 µm; retinol, folic acid, phylloquinone, pyridoxine, and nicotinamide were measured at 500 µm. (b) Emission spectra of the compounds shown in a. Zipfel WR, Williams RM, Christie R, Yu Nikitin A, Hyman BT, Webb WW (2003) Live tissue intrinsic emission microscopy using multiphoton-excited native fluorescence and second harmonic generation. PNAS, 100,

40 Aspects spectraux Ratio N*/T* 485/585 nm Intensity Andrey S. Klymchenko A S, Duportail G, Mély Y, Demchenko A P (2003) Ultrasensitive two-color fluorescence probes for dipole potential in phospholipid membranes. PNAS, 100: Fig. 5. Response in emission spectra of F8N1S and PPZ8 to variations of the dipole potential in THP-1 cell plasma membrane produced by the addition of 6-KC (5, 10, 15, 20, 30, 40, and 50 µm). ψ d was modified by the addition of 6-ketocholestanol 10, 20, and 40 µm. Spectra normalized at the T* band for PPZ8 and at the N* band for F8N1S. Dotted line upper panel: addition of 50 µm cholesterol.

41 Exemples de marqueurs fluorescents utilisés en biologie cellulaire et moléculaire modifié d'après Kasten dans Mason (1999) Fluorescent and Luminescent Probes for Biological Activity. Academic Press, Londres (2è éd). Wavelength (nm) Name Excitation Emission Applications Immunocytochemical fluorophores, conjugates and lectins Tracers for various proteins, receptors, mono- and polysaccharides Alexa Fluor family 350, 430, 488, 532, 546, 568, 594, 633, 647, 660, 680 Allophycocyanin (AP) Allophycocyanin cross-linked (AP-XL) AMCA (7-amino-4- methylcoumarin-3-acetic acid) Bodipy (borondipyromethene difluoride dye) CT-120 (coumarin 120 thiolactone) CT-339 (coumarin 330 thiolactone) Coumarin Cyanine incompatible avec VectaShield Cyanine , ε Cy3 de biopuces Cyanine ε Cyanine ε Cy5 de biopuces Cyanine ε Cyanine ε Dimethylfluorescein DTAF (5-(4 6-dichloro- triazinyl) aminofluorescein) Eosin-5-isothiocyanate Erythrosin-5-isothiocyanate FITC(fluorescein-5- isothiocyanate) Tableau 6.

42 Faites la différence! = Cy3.18

43 Quelques fluorochromes utilisés en microscopie confocale - immunofluorescence : FITC, TRITC, lissamine rhodamine, Texas Red, Cy3.5, Cy5.5, Alexa Fluors 488, 568, ADN : iodure de propidium, YOYO, YOPRO, SYTO16, chromomycine, mithramycine; DAPI, Hoechst, DRAQ5, TOTO3, TOPRO3 (oligos Cy3.18, Cy5.18) - mitochondie : sensible au potentiel membranaire: nm Rhodamine 123, DiOC 6 (3), DiOC 6 (5), DiOC 7 (3), JC-1, MitoTracker Red CMXRos (post-fixation possible) ; NAO (peu sensible potentiel) - membranes : Styrenes FM1-43, FM4-64, fusions-gfp, divers anticorps de surface - Viabilité : FDA, exclusion d iodure de propidium, morphologie, avec DIC - réticulum endoplasmique: (µm non spécifique) DiOC 6 (5), GFP-HDEL - appareil de Golgi : GFP-taggée, anticorps, NBD-C 6 -ceramide (pas pour végétaux) - dépendance envers le ph : carboxy-snarf-1, BCECF - dépendance envers le calcium : Fluo-3 ou -4 (± FF), FuraRed, CalciGreen, Indo-1, Cameleon -divers : LysoTracker, Acridine Orange, Neutral Red, Lucifer Yellow, chlorophylle, - Protéines (Auto)fluorescentes Tableau 3.

44 Une famille d excellents fluorophores pour marquer des protéines, anticorps secondaires, etc Fluorophore Absorption* (nm) Emission* (nm) Couleur Coefficient d extinction ( M -1. cm -1 ) AlexaFluor Bleu AlexaFluor Violet AlexaFluor Jaune-vert AlexaFluor Vert AlexaFluor Jaune AlexaFluor Orange AlexaFluor Jaune-orange AlexaFluor Orange-rouge AlexaFluor Rouge AlexaFluor Rouge AlexaFluor Rouge AlexaFluor Rouge AlexaFluor Rouge lointain AlexaFluor Rouge lointain AlexaFluor Rouge lointain AlexaFluor Rouge lointain AlexaFluor Infra-rouge proche *maximum approximatif d absorption et d émission Molecular Probes, Inc

45 Several laser options for microscopy Krypton/Argon 60 mw démodé Argon Ion 100 mw Argon Ion 5W (UV/Vis) refroidi à eau Blue Laser Diode Helium Cadmium Helium Néon-Green Diode Pumped Solid State (DPSS561) Helium Néon Orange Helium Néon-Red Laser blanc *488 nm (15 mw), 568 nm (15 mw) & 647 nm (15 mw) 457 nm (6 mw), 488 nm (40 mw) & 514 nm (40 mw) nm (50 mw), etc. 405 nm ( mw) 442 nm (80 mw) 543 nm (2 mw) 561 nm (50 mw) 595 nm (3 mw) 633 nm (10 mw) nm Accordable fs for multi-photon nm (1 W) Ytterbium fs with spectral selection nm (45%) *le rapport entre les différentes raies a tendance à se dégrader avec le temps Tableau 4.

46 Figure 6. Spectres normalisés d absorbance et d émission Recouvrement des spectres d émission!!! Absorbance relative FITC PE TX Red Emission : Fluorescence relative FITC PE TX Red BP 530 BP 580 BP Longueur d onde (nm) FITC = isothiocyanate de fluorescéine PE = Phycoérythrine TX Red = Texas Red

47 Acquisitions simultanées UV ou violet 405 nm HOECHST nm Alexa Fluor 488 Alexa Fluor , 561, 568 nm DIC Paramecium; Anne Fleury, UPS, Orsay

48 The cross-talk problem Acquisitions simultanées Lasers 488 and UV Acquisitions séquentielles Laser 488 then UV

49 AOTF : Acousto Optical Tunable Filter filtre opto-acoustique accordable Cristal TeO 2 Absorbeur lumière incidente I 1 raie diffractée ordre 1 Transducteur Radio-fréquences I 0 raie diffractée ordre -1 Temps de réponse rapide : 1-2 µs Modulation continue entre 0 95 % Effet bloquant fort : T < 10-5 Accordable pour de nouvelles configurations, et multilignes Robuste Brown et al. (2007)

50 AOBS: Acousto-Optical Beam Splitter change in 2 µs AOBS versus Double Dichroic 488/ nm Transmission % filtre dichroïc classique versus AOBS

51 Tableau 2. ±diffusion exemple, iodure de propidium ne diffuse qu à travers une membrane dégradée ; exclus par une membrane intacte lipophilicité Nile Red, DPH (di-phenyl-hexatriéne) ; DiIC 18 (3) sur membranes neuronales lipophile & polaire amphiphile amphiphile avec charge délocalisée base faible acide faible dérivés estérifiés = ancrage: TMA-DPH (tetra-méthyl-dph), FM1-43, FM4-64 (amino-styryls) bisbenzimide Hoechst (perméant) versus Hoechst (non perméant) exemples avec charges positives, DiOC 6 (3), JC-1, Rhodamine123. Vers la mitochondrie, leurs formes protonées seront captées à l'intérieur électronégatif de cet organite, d après l équation simplifié de Nernst : distribution d une molécule perméante de part et d autre d une membrane chargée V(mV) V = -61,5 log ( [M + ] i / [M + ] e ) soit, -61 mv vaut 10x concentration. exemple, Rouge neutre ou une alcaloïde s accumulent dans un compartiment acide comme la vacuole (piégée par protonation), d après l équation de Waddel & Butler : pour une base faible perméante dans un système à deux compartiments: i, intérieur et e, externe, alors C i / C e = 10pHe - phi soit, Δ1 ph vaut 10x concentration. exemple, Fluorescéine cytosolique s accumule dans un compartiment alcalin (chloroplaste) par son état dissocié et chargé Δ1 ph vaut 10x concentration. fluorescéine di-acétate, assez lipophiles pour traverser une membrane. On compte ensuite sur des estérases cellulaires pour libérer le composé actif sur place.

52 Quelques exemples des composés dérivés de la fluorescéine (1) HO O O HO O O O O CH 3 -C-O O O-C-CH 3 COO - H + COO - H + COO - H + fluorescéine N C S iso-thiocyanate de fluorescéine (FITC) di-acétate de fluorescéine (FDA) - Excitation maximum nm - Emission maximum 521 nm - rendement quantique 0,6 à 0,9 - pka 6,3; acide faible - largement imperméable à la membrane à ph >7 - Réagit avec les amines, sert donc pour étiqueter des protéines - quasi non fluorescent - perméant aux membranes - estérases cellulaires libèrent la fluorescéine acide

53 Quelques exemples des composés dérivés de la fluorescéine (2) O O CH 3 -C-O O O-C-CH 3 O O O O O Cl H Cl COO - H + CH 3 -C-O O-C-CH 3 O R-OOC R-O O O-R COO-R COO - H + R-OOC O di-acétate de 5-carboxyfluorescéine (CFDA) di-acétate de 2,7 -dichlorofluorescin (DCFH-DA) 2,7 -bis(carboxyethyl) -5(6)-carboxyfluorescéine, penta-acétoxyméthyl ester (BCECF-AM) - analogue à la FDA - lactone perméante - et le produit carboxyfluorescéine (pka 6,4) est mieux retenu dans la cellule - analogue à la FDA, réduite - les estérases libèrent un produit non fluorescent qui au cours d une activité cellulaire peroxydasique, devient fluorescent - analogue au FDA - le produit BCECF, avec pka 6,97 et une charge nette -4 à -5 est bien retenu dans la cellule et la dépendance de sa fluorescence sur le ph permet son emploi comme sonde de ph cytoplasmique

54 Perméation, libération, activation O CH 3 -C-O Cl O H O O-C-CH 3 Cl COO - H + Di-acétate de 2,7 -dichlorofluorescin (DCFH-DA) Membrane cellulaire O O CH 3 -C-O O O-C-CH 3 Cl H Cl COO - H + Désacétylation intracellulaire par des estérases HO O OH HO O OH Cl H Cl COO - H + + H 2 O 2 (+ peroxydase) Cl Cl COO - H + 2,7 -dichlorofluorescin (non fluorescent) 2,7 -dichlorofluorescein (fluorescent)

55 SNAP-tag, CLIP-tag 20 kda SNAP-tag petit réactif, éventuellement perméant et fluorescent Ozyme pour SNAP : X-Benzylguanine ; pour CLIP : X-Benzylcytosine

56 Imaging DNA Synthesis Click-iT EdU (Invitrogen) EdU (5-ethynyl-2'-deoxyuridine) analogue de la thymidine Non-radioactive AlexaFluor azide No DNA denaturation required Simplified protocol Small molecule detection Multiplex compatible, including Other antibodies Dyes for cell cycle analysis voir aussi l utilisation d anticorps contre bromo-deoxyuridine chloro-deoxyuridine iodo-deoxyuridine Altered Quiescent Centre cell properties in ccs52a2 mutant roots of A. thaliana. Vanstraelen et al. (2009) PNAS

57 La quantification toute une chaine! Absorption : Loi de Beer-Lambert I a = I o -I t = I o ( ε.c.l ) qui se simplifie à : I f 2,3 φ f. Io. ε. C. l I o, intensité lumineuse incidente I t, intensité lumineuse transmise C, concentration de la molécule absorbante, en mol.l -1 (M) l, trajet optique, en cm I f, intensité d émission

58 iso(s)beste Figure 4 : Spectres d'émission de fluorescence dépendant du ph, de la sonde ratiométrique carboxy-snarf-1, pour différentes excitations 488 (A), 514 (B), 534 (C). (Molecular Probes, Invitrogen)

59 Spectre d émission de fluorescence du FLUO-3 et de Fura-Red microinjectés ensemble

60 J-aggregate-forming dye JC-1 (un carbocyanine) seuillage, débruitage, puis ImgRatio = Img1 / Img2 = une cartographie de la potentiel Nernst Img1 J-aggregates émission 585 nm Img2 monoméric émission 520 nm notre perception Chen & Smiley

61 Anatomy of a quantum dot Michalet, X, Pinaud, F, Bentolila LA, Tsay J M, Doose S, Li J J, Sundaresan G, Wu A M, Gambhir S S, Weiss S (2005) Quantum dots for live cells, in vivo imaging, and diagnostics. Science 307: Violet

62 Dynamiques de la molécule unique : Single Particle Imaging or Tracking quantum dots = boîtes quantiques colloïdales Diffusion dynamics of glycine receptors revealed by single-quantum dot tracking. Dahan M., Triller A. (2003) Science 302: 442

63 afin de réduire la taille du complexe des boîtes quantiques colloïdales motif AP, puis biotine lyase : Howarth et al. 2005

64 On s imagine d ordinaire que rien n est plus aisé que de faire des expériences; et même des Savants du premier ordre ( ) ont traité cette occupation de frivole et de puérile. Cependant, j ose le dire, elle est d une difficulté infinie ; elle demande beaucoup d art, beaucoup de finesse et de sagacité d esprit. Pierre VAN MUSSENBROEK, 1769 (cité dans Valeur 2004) Marije Scholte, ISV, Gif