51, RUE SALVADOR ALLENDE NANTERRE CEDEX. Etude réalisée avec le concours financier de :

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1 51, RUE SALVADOR ALLENDE NANTERRE CEDEX Etude réalisée avec le concours financier de : CAMPAGNE DE MESURES POUR UNE MEILLEURE CONNAISSANCE DES RISQUES MICROBIOLOGIQUES EMERGENTS POUR LA RESSOURCE EN EAU DANS L AGGLOMERATION PARISIENNE LOT N 4 EXPLOITATION DES RESULTATS - SYNTHESE - Marché n / Affaire n Version 2 / 3-5 rue de Metz PARIS Téléphone : Télécopie : prolog@prolog-ingenierie.fr Laboratoire d Etudes et d Expertises - Rue Lucien Cuénot Site Saint Jacques II Maxéville Tél. : Fax : thierry.chesnot@ipl-groupe.fr 3,5 Rue de Metz Paris - Téléphone Télécopie : prolog@prolog-ingenierie.fr

2 SOMMAIRE 1. CONTEXTE ET OBJECTIFS DE L ETUDE MODALITES DE PRELEVEMENT ET METHODES ANALYTIQUES CAMPAGNES DE PRELEVEMENTS Choix des sites de prélèvements Modalités de prélèvement et de transport DETECTION DES PARASITES Norme NF T (juillet 2001), Cryptosporidium spp et Giardia spp DETECTION DES BACTERIES Campylobacter thermotolérantes : Norme ISO (juin 2005) Escherichia coli : Norme NF EN ISO (mars 1999) DETECTION DES VIRUS Entérovirus cultivable (infectieux) : Norme XP T (mars 1996) Virus entériques : Dénombrements de génomes par les méthodes de biologie moléculaire / (RT)-PCR CONTAMINATION PARASITOLOGIQUE DES RESSOURCES (CRYPTOSPORIDIUM, GIARDIA) CRYPTOSPORIDIUM GIARDIA CONTAMINATION BACTERIOLOGIQUE DES RESSOURCES (CAMPYLOBACTER) CONTAMINATION VIROLOGIQUE DES RESSOURCES (VIRUS ENTERIQUES) ENTEROVIRUS Méthode normalisée par culture cellulaire Méthode par PCR ASTROVIRUS HUMAINS ROTAVIRUS ADENOVIRUS VIRUS DE L HEPATITE A (VHA) NOROVIRUS CONCLUSION GERMES NON VIRAUX Cryptosporidium Giardia Campylobacter GERMES VIRAUX ORIGINES ET PERIODES DE CONTAMINATION PERSPECTIVES ANNEXE N 1 LOCALISATION DES PRISES D EAU, DES POINTS DE REJETS PRINCIPAUX ET DES SITES DE PRELEVEMENT... 31

3 LISTE DES TABLEAUX Tableau n 1 Agents pathogènes impliqués dans des épidémies récentes dans 15 pays industrialisés...1 Tableau n 2 Sites de prélèvements retenus (Source AESN)...3 Tableau n 3 Fréquence d isolement de Campylobacter dans les eaux de surface lors des campagnes AESN...13 Tableau n 4 Valeurs caractéristiques de la concentration en génome d Astrovirus dans les ressources superficielles étudiées...17 Tableau n 5 Valeurs caractéristiques de la concentration en génome de Rotavirus dans les ressources superficielles étudiées...19 Tableau n 6 Valeurs caractéristiques de la concentration en Adénovirus 40 et 41 dans les ressources superficielles étudiées...21 Tableau n 7 Valeurs caractéristiques de la concentration en Norovirus dans les ressources superficielles étudiées...23 LISTE DES FIGURES Figure n 1 Oocystes de Cryptosporidium : niveaux mesurés et fréquences de détection lors de la campagne AESN 2008 (n=24)...10 Figure n 2 Kystes de Giardia : niveaux mesurés et fréquences de détection lors de la campagne AESN 2008 (n=24)...11 Figure n 3 Campylobacter : niveaux mesurés et fréquences de détection lors de la campagne AESN 2008 (n=24)...13 Figure n 4 Distribution des cas d infection à Entérovirus par semaine (Réseau de surveillance des Entérovirus, France : période ) Source InVS, 2009a...16 Figure n 5 Astrovirus : niveaux mesurés (maximum et moyenne sur les seuls échantillons positifs) et fréquences de détection lors de la campagne AESN 2008 (n=24)...17 Figure n 6 Rotavirus : niveaux mesurés (maximum et moyenne sur les seuls échantillons positifs) et fréquences de détection lors de la campagne AESN 2008 (n=24)...18 Figure n 7 Adénovirus : niveaux mesurés (maximum et moyenne sur les seuls échantillons positifs) et fréquences de détection lors de la campagne AESN 2008 (n=24)...20 Figure n 8 Norovirus GII : niveaux mesurés (maximum et moyenne sur les seuls échantillons positifs) et fréquences de détection lors de la campagne AESN 2008 (n=24)...23

4 Page 1 1. CONTEXTE ET OBJECTIFS DE L ETUDE En 2004, l Agence de l Eau Seine Normandie a décidé de lancer une étude globale à l échelle de l agglomération parisienne sur les risques émergents pour l alimentation en eau potable, en associant l ensemble des maîtres d ouvrage en charge de l alimentation en eau potable et de l assainissement. Le groupe d experts ainsi constitué s était placé dans une démarche d évaluation de risque appliquée à un ensemble d agents microbiologiques et chimiques dits émergents, en faisant le point à chacune des 4 étapes classiques (identification des dangers / caractérisation des dangers / évaluation de l exposition / caractérisation des risques) sur les données disponibles dans la littérature scientifique et au niveau local, afin de se prononcer sur la faisabilité d une telle évaluation des risques sur l agglomération parisienne. L une des recommandations du groupe d experts a été de mieux caractériser l état des ressources conformément aux recommandations de l OMS. L Agence de l Eau Seine-Normandie, en tant que maître d ouvrage, et ses partenaires (EAU DE PARIS, SEDIF, SIAAP, LYONNAISE DES EAUX, VEOLIA) en tant que cofinanceurs et membres du comité de pilotage, ont décidé en 2008 d engager une nouvelle étude destinée à évaluer les niveaux d exposition aux pathogènes émergents dans les ressources superficielles que sont la Seine, la Marne et l Oise. Dans l étude initiale conduite en 2004 (AESN, 2004), le risque microbiologique et le risque chimique ont été abordés. Dans la présente étude, l attention a été focalisée sur le risque microbiologique. Dans l eau de consommation, si le risque bactériologique a été le premier à être apprécié, les risques parasitologique et virologique ont été pris en considération plus récemment. La perception des risques évolue avec les progrès de la microbiologie, aussi régulièrement des agents pathogènes émergents sont identifiés. En 2004, l étude du contexte de l agglomération parisienne a mis en avant le manque de données concernant certains pathogènes qualifiés d émergents tels que les protozoaires Cryptosporidium et Giardia, mais aussi les virus entériques (en particulier les Norovirus). De même, la bactérie Campylobacter était également identifiée comme un agent bactérien pour lequel il convenait d accroître les connaissances. Le choix des agents proposés peut être mis en relation avec la liste établie dans un ouvrage récent traitant notamment de l eau et des risques émergents. Tableau n 1 Agents pathogènes impliqués dans des épidémies récentes dans 15 pays industrialisés (Adapté de O. Thomas et F. Petit, 2009 s appuyant sur l ouvrage de Hudrey, 2004) Les microorganismes en gras ont été suivis dans la présente étude. Agent pathogène Type de microorganisme Fréquence d'apparition Cryptosporidium Parasite (protozoaire) 20 Campylobacter Bactérie 14 Giardia Parasite (protozoaire) 13 Virus de Norwalk (Norovirus) Virus 12 E. coli Bactérie 7 Agent non identifié / 5 Rotavirus Virus 2 Shigella Bactérie 2 Virus de l'hépatite A (VHA) Virus 1 Salmonella Bactérie 1 Toxoplasma Parasite (protozoaire) 1

5 Page 2 L Agence de l Eau Seine Normandie a organisé entre février 2008 et janvier 2009 des campagnes de prélèvements et analyses régulières, sur 12 points répartis sur les 3 rivières utilisées pour la production d eau potable approvisionnant l agglomération parisienne, sélectionnés du fait de localisations sensibles (rejets, points de captage). Une carte est jointe en fin de document. Ces campagnes étaient non ciblées et s effectuaient selon une fréquence régulière bimensuelle ou mensuelle selon les paramètres, indépendamment des conditions météorologiques et hydrologiques. Les agents microbiologiques recherchés étaient les suivants : Parasites : Giardia et Cryptosporidium (fréquence bimensuelle), selon des méthodes normalisées ; Virus : Norovirus (fréquence bimensuelle), Entérovirus, Adénovirus, Rotavirus, Astrovirus, virus de l Hépatite A (fréquence mensuelle), selon des méthodes de (RT)- PCR quantitative et Entérovirus (fréquence bimensuelle) selon une méthode de culture normalisée ; Bactéries : Campylobacter et E. coli (fréquence bimensuelle), selon des méthodes de culture normalisées. Des paramètres indicateurs physico-chimiques classiques ont en outre été analysés dans le même temps (MES, DCO, NTK, PT). L ensemble des données produites a fait l objet d une analyse permettant d interpréter les résultats du point de vue des niveaux de contamination rencontrés, mais aussi du point de vue de la distribution spatiale et temporelle des germes suivis, en prenant notamment en compte, dans la mesure du possible, les données en lien avec les évènements météorologiques et leurs conséquences sur les déversements dans le milieu récepteur. De même, afin de compléter l analyse des données, les différents éléments utiles à l interprétation des mesures réalisées ont été abordés, tels que l incertitude des méthodes d analyse, la signification sanitaire à accorder aux entités dénombrées (unité cultivable ou unité génome), les différentes possibilités de mise en œuvre des analyses quantitatives de risque. Le présent document constitue la synthèse du rapport complet.

6 Page 3 2. MODALITES DE PRELEVEMENT ET METHODES ANALYTIQUES 2.1. Campagnes de prélèvements Choix des sites de prélèvements Le suivi organisé dans le cadre de la présente étude s appuie sur la réalisation sur une année (de février 2008 à janvier 2009) de 24 campagnes de prélèvements en 12 points répartis sur la Marne (3 sites), la Seine (7 sites) et l Oise (2 sites). Le choix des sites s est fait selon les cas pour les raisons suivantes : proximité avec des prises d eau d usines de production d eau potable afin de caractériser la contamination des eaux brutes ; localisation à l amont et à l aval d un rejet d assainissement pour mesurer son effet sur le milieu ; localisation en entrée ou en sortie de l agglomération de façon à caractériser l impact de l agglomération parisienne. Le tableau ci-dessous présente les points retenus et les raisons de leur choix. Tableau n 2 Sites de prélèvements retenus (Source AESN) Localisation des points et maître d'ouvrage recueillant des données habituellement à ces points Prise d'eau de l'usine d'annet-sur- MARNE (Compagnie Générale des Eaux) Localisation Prélèvement Prise d'eau (RD) Objectif visé par les mesures Contamination à la prise d'eau et point en entrée de l'agglomération MARNE Prise d'eau de NEUILLY-SUR-MARNE (SEDIF) Prise d'eau (RG) Contamination à la prise d'eau et point amont de la STEP Marne Aval Passerelle d'alfortville (SIAAP) 3 points : RG, MILIEU, RD Analyse de l'influence du rejet de la STEP Marne Aval Prise d'eau de MORSANG (LDE) Prise d'eau (RD) Entrée de l'agglomération SEINE Prise d'eau d'orly (EAU DE PARIS) Prise d'eau d'ivry (EAU DE PARIS) Prise d'eau de SURESNES (SEPG) Prise d'eau (RG) Prise d'eau (RG) Prise d'eau (RG) Contamination à la prise d'eau et point amont de la STEP Seine Amont Contamination à la prise d'eau et analyse de l'effet du rejet de la STEP Seine Amont Contamination à la prise d'eau et point amont de la STEP Seine Centre Pont de BEZONS (SIAAP) 3 points : RG, MILIEU, RD Effet du rejet de la STEP Seine Centre Prise d'eau de réalimentation des champs captants de CROISSY (LDE) Prise d'eau (RD) Contamination aux champs captants et amont de la STEP Seine Aval Pont de POISSY (SIAAP) 3 points : RG, MILIEU, RD Effet du rejet de la STEP Seine Aval et aval agglomération OISE Prise d'eau de MERY-SUR-OISE (SEDIF) Pont d'andresy (SIAAP) Prise d'eau (RG) Contamination à la prise d'eau 3 points : RG, MILIEU, RD Effet de la STEP Cergy-Neuville et aval Oise

7 Page Modalités de prélèvement et de transport Il s agit de campagnes de prélèvements non ciblées, réalisées à fréquence bimensuelle ou mensuelle suivant le paramètre, selon un calendrier établi au démarrage de l étude. C est la société ANALY-CO, titulaire du lot n 1 du marché, qui a été retenue pour procéder aux prélèvements et au transport des échantillons. Les tournées de prélèvements ont ainsi été effectuées à compter du mardi 19 février 2008, un mardi matin sur deux, jusqu au mardi 20 janvier Sur les 8 sites correspondant aux prises d eau, les prélèvements ont été effectués en 1 seul point. Sur les 4 autres (Passerelle d Alfortville, Pont de Bezons, Pont de Poissy, Pont d Andrésy), trois échantillons étaient pris (rive gauche, centre, rive droite) et un échantillon moyen constitué. Les échantillons étaient transportés à 4 C en véhicules réfrigérés avec suivi de température. L ensemble des échantillons devait arriver aux laboratoires au plus tard 24 heures après le prélèvement, à l exception des échantillons destinés aux analyses de Campylobacter qui devaient être livrés sous 10 heures. L ensemble des 24 campagnes s est déroulé sans aucun problème particulier. Tous les échantillons ont été livrés sous dix heures aux 2 laboratoires chargés des analyses à savoir : le LSEH du groupe CARSO (Lyon), titulaire du lot n 2 du marché, chargé des analyses selon des méthodes normalisées (Giardia, Cryptosporidium, Campylobacter, Entérovirus, E. Coli, MES, DCO, PT, NTK) ; le CEERAM (Nantes), titulaire du lot n 3, chargé des dénombrements de particules virales selon une méthode de PCR quantitative. Les paragraphes suivants présentent un aperçu des méthodes de dénombrement utilisées, en évoquant les aspects méthodologiques, les incertitudes de mesure et la signification sanitaire des entités mesurées. Le lecteur pourra se référer au document complet et aux différentes références listées pour plus d informations à ce sujet. 2.2 Détection des parasites Cryptosporidium et Giardia sont les deux parasites (protozoaires) qui ont fait l objet d un suivi pendant l étude. Ce suivi consiste à rechercher et dénombrer les formes de résistance de ces parasites qui sont excrétées par les individus infectés et qui persistent dans l environnement. Les oocystes pour Cryptosporidium et les kystes pour Giardia sont détectés suivant une norme classiquement utilisée pour les eaux de surface, les eaux de distribution et les eaux résiduaires Norme NF T (juillet 2001), Cryptosporidium spp et Giardia spp Le couplage de l'immunocapture sur billes et de la révélation par immunofluorescence constitue la base de la technique normalisée par l'afnor. Etant donné les faibles concentrations observées dans l environnement, une étape de concentration est nécessaire. Sur les eaux de surface elle peut être réalisée au maximum sur 20 litres d eau mais classiquement le volume concentré est de 10 litres.

8 Page 5 La norme ne permet pas de définir des incertitudes sur les dénombrements effectués. Elle impose cependant le respect de critères de qualité qui impliquent l obtention d un rendement minimum de 20% sur l ensemble de la méthode. Ce rendement est vérifié ponctuellement par le laboratoire mais les résultats exprimés ne sont pas corrigés du rendement de sorte que cette méthode conduit à la sous-estimation des dénombrements. Le rendement moyen, pour l année 2008 communiqué par le laboratoire en charge des analyses est de 72% en ce qui concerne les oocystes de Cryptosporidium, et de 79% en ce qui concerne les kystes de Giardia (la nature des matrices utilisées pour le calcul des rendements n est pas connue). La méthode NF T n apporte que peu d information sur le potentiel infectieux des oocystes et des kystes, de plus elle ne permet pas non plus de distinguer les espèces les plus pathogènes des autres. Il s agit donc d une méthode de numération globale qui présente l avantage de refléter la vulnérabilité de la ressource face à la présence de réservoirs souvent non identifiés mais qui reste perfectible pour ce qui concerne la mesure du risque d infestation et l évaluation de l impact sanitaire. 2.3 Détection des bactéries Deux types de bactéries ont été intégrés aux analyses réalisées sur l ensemble des prélèvements, il s agit d une part des Campylobacter thermotolérantes en tant que pathogène potentiel, et d autre part de Escherichia coli (E. coli) en tant qu indicateur de contamination fécale. Pour chacune de ces deux bactéries, il existe une norme adaptée à la recherche et au dénombrement dans les eaux de surface Campylobacter thermotolérantes : Norme ISO (juin 2005) Parmi les Campylobacter thermotolérantes, Campylobacter jejuni (C. jejuni) et Campylobacter coli (C. coli) sont les principales espèces d intérêt sanitaire qu il est important de mettre en évidence. C. jejuni et C. coli sont des bactéries thermotolérantes, à coloration de Gram négative, très mobiles, qui nécessitent pour une croissance optimale des conditions micro-aérophiles à C. La norme ISO (juin 2005) intitulée «Qualité de l eau recherche et dénombrement d espèces thermotolérantes du genre Campylobacter», permet un dénombrement semi-quantitatif en prenant en compte certaines exigences (température de croissance sélective et enrichissement sélectif préalable). La méthode de dénombrement met en œuvre une étape de concentration, une étape d enrichissement et une étape de confirmation. Après prélèvement, les échantillons doivent être conservés à l obscurité pendant au maximum 30 heures et la mise en culture doit intervenir le plus rapidement possible. Du fait de la présence d une étape d enrichissement, la méthode ne peut produire que des résultats semi-quantitatifs dont l expression est fonction des conditions d ensemencement pratiquées par le laboratoire (volume mis en culture, réplicats). La mise en œuvre d un témoin positif rendu obligatoire par la norme, permet de s assurer de la validité de l analyse. Cependant, elle ne permet pas de vérifier l efficacité de l étape d enrichissement. En effet, la cultivabilité des Campylobacter issues des échantillons environnementaux peut-être fortement réduite, en particulier parce qu il s agit de bactéries sensibles à la présence d oxygène et dans une moindre mesure à une exposition à la lumière.

9 Page 6 Ainsi, en fonction des pratiques du laboratoire, et notamment en fonction de la gestion des bouillons d enrichissement, certaines espèces de Campylobacter peuvent être sousestimées. L existence de faux négatifs n est donc pas à exclure. La présence d une étape d enrichissement entraîne une incertitude importante sur le dénombrement, a priori largement majoritaire devant les autres sources d incertitude de la méthode. Cette forte incertitude est prise en compte par le mode semi-quantitatif d expression des résultats. Ainsi la contamination est exprimée sur une échelle logarithmique à l aide d intervalles selon 4 niveaux : < 1 UFC/L (limite de détection théorique) -- de 1 à 10 UFC/L -- de 10 à 100 UFC/L -- > 100 UFC/L (limite haute de quantification). Sur la période de l étude, le laboratoire en charge des analyses a déterminé un rendement moyen de 100% de détection pour des concentrations > à 1 UFC/L (la nature des matrices utilisées pour le calcul des rendements par le laboratoire n est pas connue). D une manière générale la présence de Campylobacter thermotolérantes dans un échantillon traduit l existence d un risque sanitaire, cependant certaines espèces telle que C. jejuni sont très majoritairement impliquées dans les pathologies humaines. Les dénombrements issus de la norme ISO ne permettent pas de distinguer les espèces de Campylobacter en présence dans les échantillons positifs Escherichia coli : Norme NF EN ISO (mars 1999) La méthode normalisée (NF EN ISO ) est très couramment utilisée pour le dénombrement des E. coli dans les eaux de surface, mais également dans les eaux résiduaires. Aujourd hui E. coli est considéré comme le meilleur indicateur d une contamination récente du milieu aquatique par du matériel fécal humain ou d animaux à sang chaud (Edberg et al., 2000). Les E. coli sont dénombrés grâce à l activité enzymatique de la β-d-glucuronidase qui leur est caractéristique. La norme NF EN ISO est une méthode miniaturisée basée sur le principe statistique du Nombre le Plus Probable (NPP) : une microplaque de 96 puits contenant un substrat fluorogénique pouvant être hydrolysé par la β-dglucuronidase est utilisée. Des dilutions décimales de l échantillon d eau sont réalisées avec un diluant stérile et les 96 puits de la microplaque sont inoculés à raison de 200 µl avec les différentes dilutions préparées. Les niveaux de dilution à mettre en œuvre ainsi que la répartition du nombre de puits ensemencés par dilution sont fonction de la nature de l eau à analyser. Au terme d une incubation maximale de 48 h à 37 C, les puits positifs sont énumérés sous illumination UV et le NPP est calculé. Le dénombrement réalisé sur le modèle statistique du Nombre le Plus Probable (NPP) intègre le calcul d un intervalle de confiance qui peut-être consulté dans la norme. En fonction de la nature des eaux analysées le seuil de quantification de la méthode est susceptible d évoluer. Dans le cadre des analyses réalisées par le laboratoire, le seuil de quantification est de 38 /100mL. Par ailleurs, selon les données du laboratoire, le rendement moyen associé à cette méthodologie est de 83% (la nature des matrices utilisées pour le calcul des rendements par le laboratoire n est pas connue). 2.4 Détection des virus Dans l environnement hydrique, les virus excrétés par l Homme infecté se trouvent en général en faible densité. Aussi, avant la détection ou la quantification des virus, les étapes de concentration des particules virales sont nécessaires. Elles permettent de rassembler les virus de l échantillon environnemental dans un petit volume.

10 Page 7 Plusieurs méthodes de concentration des virus existent mais les plus utilisées ont recours à l adsorption-élution. Dans ce mécanisme, les propriétés de surface des virus sont utilisées pour les fixer à la surface de supports appropriés (laine de verre, membranes chargées, ) ; les virus sont ensuite élués de ces supports par la modification des propriétés de surface qui est obtenue en jouant sur des paramètres tels que le ph, la force ionique, la concentration en protéines de la solution éluante. Seuls les Entérovirus disposent d une méthode normalisée qui permet leur dénombrement par culture cellulaire in vitro. Les autres virus entériques ont longtemps posé problème pour leur dénombrement, mais le développement des méthodes de biologie moléculaire a ouvert de nouvelles perspectives. Ces méthodes restent cependant encore peu répandues, de sorte qu actuellement, elles sont réalisées par des laboratoires experts dont la compétence spécifique assure la garantie des résultats Entérovirus cultivable (infectieux) : Norme XP T (mars 1996) La norme XP T décrit une méthode basée sur le dénombrement des Entérovirus par culture cellulaire. Classiquement sur les eaux de surface un volume de 10 litres est ainsi analysé. Les échantillons doivent être acheminés en enceinte réfrigérée au laboratoire en moins de 24 h. Au laboratoire, la méthode se décompose en 4 étapes : une étape de concentration, une étape d élution, une concentration secondaire et une étape de mise en culture sur des tapis de cellules sensibles à l infection par les Entérovirus. Le dénombrement des Entérovirus infectieux est finalement réalisé à partir de l observation des effets cytopathogènes (nombre de trous dans le tapis de cellules). Le résultat est ainsi exprimé en Unité CytoPathogène (UCP) en fonction du volume analysé. Plusieurs niveaux d incertitude sont à prendre en considération pour l interprétation des résultats obtenus en culture cellulaire. Il existe un risque de sous-estimation de la concentration car seulement 60 à 70% des Entérovirus peuvent être isolés par culture cellulaire : certains sérotypes ne sont pas ou peu cultivables (Leparc et al., 1994). En effet, la recherche de virus infectieux par culture cellulaire dépend de la sensibilité de la lignée cellulaire employée par rapport aux sérotypes présents. Actuellement aucun consensus n existe quant aux lignées cellulaires à privilégier. La norme utilisée présente donc l avantage de définir un protocole figé fournissant des résultats comparables dans le temps, mais ne garantit pas la détection de l ensemble des Entérovirus potentiellement cultivables. Par ailleurs le rendement de la méthode affecte également la quantification qui est réalisée. En l occurrence, pour la période de l étude, le laboratoire en charge des analyses affiche un rendement moyen de 90% (la nature des matrices utilisées pour le calcul des rendements par le laboratoire n est pas connue). La multiplication des Entérovirus par inoculation sur culture cellulaire constitue le seul moyen de détection apportant la preuve que les virus isolés sont infectieux. Il s agit du point de vue de l évaluation du nombre de particules virales infectieuses, de la méthode de référence. Le risque de faux positifs n est pas exclu (effet identique des Réovirus par exemple) Virus entériques : Dénombrements de génomes par les méthodes de biologie moléculaire / (RT)-PCR La détection des virus entériques par les méthodes de biologie moléculaire s est développée. En effet, si des méthodes de culture cellulaire existent pour les Entérovirus, ce n est par le cas pour la plupart des autres virus entériques. En dehors des Adénovirus, les virus entériques sont tous des virus à ARN. Les méthodes de détection par amplification génique nécessitent de ce fait une étape préliminaire de transcription inverse (ou rétrotranscription) de l ARN viral en ADN. L ADN transcrit ou complémentaire (ADNc), obtenu grâce à une enzyme de rétro-transcription et une amorce anti-sens, peut ensuite être amplifié par les procédés de polymérisation en chaîne (APC ou PCR pour Polymerase Chain Reaction). L ADN amplifié peut être détecté soit par électrophorèse sur gel soit par le suivi d un signal fluorescent.

11 Page 8 Un résultat qualitatif ou semi-quantitatif peut-être obtenu avec les électrophorèses sur gel. Un résultat quantitatif peut-être obtenu par le suivi d un signal fluorescent car les méthodologies actuelles permettent de relier ce signal de manière proportionnelle au nombre de copies d ADN néosynthétisées (PCR quantitative). Comme pour les méthodes de culture cellulaire, les méthodes de biologie moléculaire nécessitent la mise en œuvre d une étape de concentration de l échantillon. Elles nécessitent ensuite une étape d extraction, une étape de purification de l extrait (particulièrement importante dans les échantillons environnementaux) et une étape d amplification. Un risque de faux négatifs existe lié aux phénomènes d inhibition de la PCR par certains composants de la matrice. Pour le moment il n existe pas de méthode normalisée pour réaliser la recherche et le dénombrement de virus entériques par (RT)-PCR. Cependant, un groupe d experts travaille actuellement à l élaboration d un protocole concernant le dénombrement du virus de l Hépatite A et des Norovirus par ces méthodes. Il s agit de la commission CEN/TC275/WG6/TAG4 dont les recommandations actuelles ont été suivies pour la réalisation d une partie des analyses menées au cours de cette étude. Pour les autres virus entériques, les publications scientifiques disponibles font référence. Dans l environnement les virus entériques sont soumis à l action de différents facteurs naturels (température, rayonnement UV, ph, force ionique, micro-organismes et métabolites microbiens) qui peuvent dégrader la capside et /ou le génome viral. Il en résulte une inactivation du virus qui devient incapable d infecter les cellules cibles. Cependant cette perte d infectiosité n est pas systématiquement synonyme d altération du génome viral. De très nombreuses études ont montré qu il était possible de détecter du génome viral sans pour autant avoir la preuve de la présence de virus infectieux. Il apparaît clairement que la détection du génome viral, contrairement à la culture cellulaire, ne permet pas de témoigner du caractère infectieux du virus isolé. Il est donc difficile d interpréter la présence de génome viral en termes de risque pour la santé publique. Deux laboratoires ont pratiqué les analyses et fourni des résultats pendant cette campagne. Ces deux laboratoires ont communiqué l essentiel de leur mode opératoire ainsi que les mesures d assurance qualité utilisées pour la réalisation des analyses. Les principales différences méthodologiques susceptibles d expliquer des divergences de résultats sont largement commentées dans le rapport complet. Il est à noter que lors des campagnes du 28 octobre 2008, du 25 novembre 2008 et du 20 janvier 2009 afin d évaluer la variabilité des méthodes de dénombrement par biologie moléculaire, des analyses ont été conduites sur des échantillons issus de prélèvements identiques réalisés sur les points de Méry-sur-oise et de Neuilly-sur-Marne. Les modalités de prélèvement étaient identiques et deux fractions d échantillons ont été envoyées aux deux laboratoires impliqués dans le suivi des niveaux de contamination. Globalement, la cohérence des dénombrements entre les deux séries de mesures s est révélée satisfaisante, seules quelques discordances ont été mises en évidence. Ces résultats discordants concernent les Adénovirus, les Norovirus de génogroupe II et les Rotavirus. L analyse de ces discordances est réalisée dans le rapport complet.

12 Page 9 3. CONTAMINATION PARASITOLOGIQUE DES RESSOURCES (CRYPTOSPORIDIUM, GIARDIA) La problématique des risques de contamination parasitologique par les eaux de distribution ne se résume pas à Cryptosporidium et Giardia, cependant il est clair que ces deux protozoaires constituent à eux deux l essentiel du problème. Les oocystes de Cryptosporidium et les kystes de Giardia disposent d un réservoir important essentiellement constitué par les jeunes mammifères, et surtout par les jeunes bovins. Ainsi, dans les zones d élevage, les ressources en eau sont plus exposées aux contaminations. La conservation du potentiel infectieux dans l environnement est bien sûr fonction des conditions ambiantes, mais la structure des oocystes et des kystes est particulièrement adaptée au maintien de l infectiosité pendant de longues périodes. En effet, les oocystes et les kystes sont des formes de résistance qui contiennent et protègent des stress environnementaux les formes infestantes. Dans le domaine de la distribution d eau, le risque associé à ces micro-organismes a été identifié dans les pays anglo-saxons depuis les années Depuis 1990, la survenue d épidémies, parfois de grande importance, a également montré la nécessité de prendre en compte la présence de ces parasites dans les ressources d eaux superficielles ou souterraines, par la conception de filières de traitement adaptées aux spécificités de ces micro-organismes, comme leur forte résistance au chlore Cryptosporidium Des dénombrements ont été réalisés de manière bimensuelle sur l ensemble des sites de prélèvement retenus pour l étude. Ces dénombrements ont pu être comparés aux analyses réalisées également par le SEDIF dans le cadre du suivi renforcé de la qualité des eaux brutes sur ses prises d eau, et par le SIAAP dans le cadre du suivi du milieu récepteur sur plusieurs points de l agglomération parisienne, avec un suivi microbiologique renforcé sur la Seine en amont de Paris à Choisy-le-Roi et Ivry, et à Poissy et Triel en aval. La figure ci-dessous fait la synthèse des résultats obtenus sur les 12 sites de prélèvements en termes d Oocystes de Cryptosporidium. Le graphique du haut rend compte de la variabilité des mesures réalisées au cours des 24 campagnes, sous la forme de «boîtes à moustaches», qui renseignent sur les valeurs moyennes et médianes, sur le premier et le troisième quartiles (tels que 25 % ou 75 % des mesures ont une valeur inférieure) et sur les valeurs minimales et maximales. Le graphique du bas rend quant à lui compte de la fréquence de détection positive du micro-organisme au sein de l échantillon des 24 mesures bimensuelles. Les résultats des analyses réalisées dans le cadre des campagnes de prélèvements AESN ont tendance à révéler une faible occurrence de la présence de Cryptosporidium, ainsi qu une faible fréquence d apparition des valeurs maximales dans les ressources d Ile-de- France, au moins dans les conditions météorologiques observées sur cette période. La présence de Cryptosporidium est identifiée selon les sites sur 13% à 40% des 24 échantillons prélevés, et les dénombrements positifs révèlent dans la grande majorité des cas des valeurs à 1 ou 2 oocystes/10 L. Les valeurs maximales sur la période ont été mesurées entre 2 et 20 oocystes/10 L selon les endroits.

13 Page 10 Figure n 1 Oocystes de Cryptosporidium : niveaux mesurés et fréquences de détection lors de la campagne AESN 2008 (n=24) Cryptosporidium (u / 10 L) MARNE SEINE AMONT SEINE AVAL OISE Max 75 % Moyenne Médiane 25% Min 0 Annet Neuilly Alfortvil. Morsang Orly Ivry Suresnes Bezons Croissy Poissy Mery Andresy Fréquence 0% 10% 20% 30% 40% 25% 13% 33% 29% 13% 21% 21% 13% 17% 38% 13% 21% Les périodes durant lesquelles Cryptosporidium a été détecté et les faibles amplitudes des dénombrements ne permettent pas de dégager avec certitude l existence d une saisonnalité. On constate une augmentation de la contamination de l amont vers l aval sur la Marne et sur la Seine Aval, mais qui reste néanmoins peu marquée. Ces résultats semblent indiquer d une part une contamination faible et d autre part une baisse de la contamination par rapport aux données antérieures mesurées sur la période 2000/2003. Néanmoins, les échantillons prélevés par le SEDIF et le SIAAP dans le cadre de leurs suivis respectifs (de la qualité des eaux brutes pour le premier, du milieu récepteur pour le second), sur la même période que les prélèvements AESN (soit de février 2008 à janvier 2009), sont plus souvent positifs (50 à 100 % des échantillons selon les sites), et révèlent des niveaux de contamination médians du même ordre de grandeur (0 à 2 oocystes/10 L), mais des valeurs hautes plus élevées. Au vu de ces résultats, une analyse comparative plus approfondie des conditions d obtention des données existantes (dates des prélèvements, conditions contextuelles, pluviométrie, débit, méthodes analytiques et incertitudes ) permettrait de conclure de manière plus sûre à une diminution de la contamination des ressources à Cryptosporidium. En comparaison des données européennes disponibles, le niveau de contamination des ressources en eau de surface de l agglomération parisienne semble comparable à celui observé dans les ressources des autres pays européens.

14 Page Giardia Les dénombrements ont été réalisés selon les modalités décrites pour Cryptosporidium. En effet, les kystes de Giardia et les oocystes de Cryptosporidium sont dénombrés simultanément dans les mêmes prélèvements grâce à une méthode unique. Les dénombrements ont donc été réalisés de manière bimensuelle sur l ensemble des sites de prélèvement retenus pour l étude. La figure suivante présente pour les trois ressources superficielles d Ile-de-France les résultats des analyses en Kystes de Giardia obtenus dans le cadre des campagnes AESN. Figure n 2 Kystes de Giardia : niveaux mesurés et fréquences de détection lors de la campagne AESN 2008 (n=24) 500 MARNE SEINE AMONT SEINE AVAL OISE 450 Giardia (u/10 L) Max 75 % Moyenne Médiane 25% Min Fréquence 0 0% 20% 40% 60% 80% 100% Annet Neuilly Alfortvil. Morsang Orly Ivry Suresnes Bezons Croissy Poissy Mery Andresy 71% 83% 96% 100% 92% 92% 88% 83% 92% 96% 96% 100% Les résultats des analyses menées sur les Kystes de Giardia dans le cadre des campagnes confirment la présence du parasite la plupart du temps dans les trois ressources d Ile-de-France, avec des tendances à l augmentation des niveaux de dénombrement d amont en aval de la Marne, et entre la Seine amont et la Seine aval témoignant de la pression de l agglomération parisienne exercée sur le milieu. Peu d échantillons sont négatifs, la majorité présente une contamination qui reste inférieure à 100 kystes/10l et quelques prélèvements révèlent la présence de pics de contamination pendant lesquels plusieurs centaines de kystes/10l sont dénombrées (jusqu à 503 kystes/10l le 20/01 dans l Oise). Le niveau de contamination moyen est homogène puisque compris entre 29 et 35 kystes /10L. Sur chacune des rivières le pourcentage d échantillons positifs est très important (de 88% à 98%). En revanche le niveau de contamination le plus élevé varie en fonction du cours d eau, on dénombre des valeurs maximum de 91 kystes/10l sur la Seine amont, 234 kystes/10l sur la Marne, 410 kystes/10l sur la Seine aval et 503 kystes/10l sur l Oise.

15 Page 12 La localisation spatiale des points de prélèvement semble influencer la survenue de pics de contamination, ainsi pour un même cours d eau, certains points de prélèvement sont plus sujets que les autres à ces pics. Par exemple, pour la Marne, Alfortville est le seul point pour lequel la contamination dépasse 100 kystes/10l. Il apparaît que les déversements effectués sur la boucle de la Marne pourraient être en partie responsable de l élévation de la contamination à Alfortville, d autant que l usine d épuration Marne Aval a fonctionné durant la période concernée en mode dégradé en raison de travaux. Au niveau de la Seine, Croissy et Poissy sont les points les plus affectés par les fortes contaminations, tandis que Suresnes et Bezons ne sont concernés que par un ou deux pics. Mery et Andrésy, qui sont les deux points de prélèvement situés sur l Oise, ne sont impactés par un pic de contamination qu à l occasion de la campagne du 20 janvier Par ailleurs, ce pic de contamination contraste fortement avec les valeurs classiquement observées pendant le reste de l étude qui sont restées assez modérées. La survenue des pics de contamination apparaît également influencée par une variation temporelle dans la mesure où globalement les fortes quantités de kystes apparaissent sur la Marne et la Seine aux mêmes dates (19/02-04/03-18/03-27/05-20/01). L Oise qui ne présente qu un seul pic (20/01) ne suit pas les mêmes cycles de contamination, du moins aux sites de prélèvement étudiés pendant cette étude. Les kystes de Giardia sont présents dans la plupart des échantillons tout au long de l année, cependant entre les campagnes du 24 juin et du 28 octobre, aucun échantillon de concentration supérieure à 100 kystes/10l n a été mis en évidence. Si la contamination est continue, il semble cependant que la survenue de pics de contamination n intervienne qu en dehors de la période estivale. Les pics sont pour la plupart mesurés dans des périodes marquées par des épisodes pluvieux de faible intensité, avec des déversements d assainissement sur l ensemble des trois rivières, mais modérés. On pressent donc bien une influence des rejets de l agglomération sur les pics de contamination mesurés, mais cette incidence éventuelle obéit à la juxtaposition de situations et phénomènes (la situation hydrologique du cours d eau au moment des prélèvements, le décalage temporel entre les déversements et les prélèvements, les phénomènes de sédimentation et de relargage, l ampleur en volume et la nature en termes de qualité d eau des déversements, etc.), qui mériterait des investigations complémentaires et plus ciblées. Par ailleurs, on constate apparemment une tendance à la diminution de la contamination avec des niveaux médians et des pics de contamination dans l ensemble plus bas en 2008 que ceux issus des données antérieures sur la période 2000/2004. Cette amélioration pourrait traduire le résultat des progrès accomplis ces dernières années en matière d efficacité des traitements des stations d épuration et de maîtrise des déversements issus des réseaux d assainissement en temps de pluie, par la mise en place notamment d un système de gestion des flux sur la zone de collecte du SIAAP. Ce constat nécessiterait néanmoins d être approfondi par la stricte comparaison des protocoles de mesures et des conditions observées au moment des prélèvements. Le niveau de contamination des ressources superficielles de l agglomération parisienne semble équivalent à celui observé dans les autres cours d eau européens, mais la forte fréquence d échantillons positifs qui se démarque de la plupart des autres études, indique certainement l exposition des eaux superficielles à une source continue de contamination fécale. La remise en suspension des kystes de Giardia présents dans les vases du fond du fleuve par la navigation sur la Seine n est pas à exclure.

16 Page CONTAMINATION BACTERIOLOGIQUE DES RESSOURCES (CAMPYLOBACTER) Au cours de la présente étude les Campylobacter thermotolérants ont fait l objet de recherche et de dénombrements semi-quantitatifs selon la norme ISO (juin 2005). Les résultats des analyses en Campylobacter réalisées sur les échantillons prélevés dans le cadre de la campagne AESN sont synthétisés sur le tableau et la figure n 3. Les fréquences indiquées sur le graphique du bas correspondent aux seuls cas où le résultat est > 1 UFC/L. Pour rappel, les résultats analytiques sont traduits selon 4 classes : dénombrement : < 1 UFC/L, 1 à 10 UFC/L, 10 à 100 UFC/L, et > 100 UFC/L. Tableau n 3 Fréquence d isolement de Campylobacter dans les eaux de surface lors des campagnes AESN Campylobacter thermotolérants (%) UFC / L < 1 1 à à 100 > 100 Marne 21% 8% 46% 25% Seine Amont 24% 18% 28% 31% Seine Aval 60% 9% 18% 13% Oise 24% 9% 38% 30% Figure n 3 Campylobacter : niveaux mesurés et fréquences de détection lors de la campagne AESN 2008 (n=24) Campylobacter (UFC/L) MARNE SEINE AMONT Max 75 % Moyenne Médiane 25% Min SEINE AVAL OISE > à à 10 < 1 Fréquence 0% 20% 40% 60% 80% 100% Annet Neuilly Alfortvil. Morsang Orly Ivry Suresnes Bezons Croissy Poissy Mery Andresy 17% 29% 50% 79% 63% 71% 71% 65% 79% 79% 88% 88%

17 Page 14 Les différentes campagnes montrent que l on trouve la bactérie toute l année, sur l ensemble des ressources, et à des niveaux variables quelle que soit la saison considérée. Le suivi des Campylobacter thermotolérantes entre février 2008 et janvier 2009 ne permet pas la mise en évidence d une saisonnalité dans les résultats de dénombrement. L ensemble des 12 points analysés ont été testés positifs à plusieurs reprises. Pour la totalité des points, les résultats obtenus varient entre la non détection (<1 UFC/L) et des valeurs supérieures au plafond de quantification (>100 UFC / L). Par ailleurs, l évolution de la concentration en Campylobacter sur un point ne suit pas toujours de tendance évidente. En effet, dans certains cas, entre deux séries de prélèvement, la concentration peut passer de la non détection à une valeur supérieure au plafond de quantification et inversement. Dans d autres cas, le même niveau de concentration peut se maintenir sur plusieurs séries de prélèvement. Seul le point de prélèvement de Suresnes (Seine) montre un profil de contamination différent : aucune présence de Campylobacter n a été détectée au cours des 9 premiers mois. En revanche, la contamination semble persistante depuis le mois de novembre Ce double mécanisme de variation des concentrations en Campylobacter pourrait être issu de plusieurs sources de contamination, ponctuelles (lessivage de sols agricoles contaminés) ou permanentes (rejets d élevage, relargage sédimentaire). Les niveaux de contamination mesurés sur la Marne et l Oise sont fortement similaires. Les niveaux de contamination observés sur la Seine amont sont proches des deux précédents. En revanche, sur la Seine en aval de Paris, le profil de contamination apparaît différent, avec une fréquence de dénombrements < 1 UFC/L bien supérieure aux autres ressources, et en corollaire moins de dénombrements > 10 UFC/L ou 100 UFC/L. Sur la Seine, la diminution progressive apparente des concentrations en Campylobacter entre les points situés en amont et en aval laisse à penser que les animaux d élevage du bassin versant (essentiellement concentrés sur la zone amont) pourraient être responsables des niveaux de contamination les plus élevés. Dans cette hypothèse, la capacité auto-épuratoire de la Seine, sans apport nouveau lors de la traversée de l agglomération parisienne, provoquerait vers l aval une diminution progressive de la contamination.

18 Page CONTAMINATION VIROLOGIQUE DES RESSOURCES (VIRUS ENTERIQUES) Dans le contexte de la distribution de l eau, l impact sanitaire des virus entériques doit être envisagé. Si dans la grande majorité des cas les infections provoquées par ces virus sont asymptomatiques, elles peuvent également entraîner soit des gastro-entérites, soit des hépatites. Les virus entériques les plus impliqués sont les Rotavirus, les Calicivirus (Norovirus et Sapovirus), les Astrovirus, les Adénovirus 40 et 41, le virus de l Hépatite A et les Entérovirus. Ces virus qualifiés d entériques ont pour point commun d être excrétés dans les selles des individus infectés, ce qui a pour conséquence une contamination de l environnement et en particulier des ressources en eau. Une fois dans l environnement, les virus dont la multiplication implique la présence d un hôte ne peuvent se reproduire, mais conservent un potentiel infectieux pendant des périodes qui varient de quelques jours à plusieurs semaines en fonction des caractéristiques du milieu récepteur et du type de virus considéré Entérovirus Au cours des campagnes AESN 2008, les Entérovirus ont été suivis d une part avec la méthode normalisée par culture cellulaire et d autre part avec des méthodes de biologie moléculaire Méthode normalisée par culture cellulaire Les résultats de la présente étude révèlent des niveaux de contamination en accord avec les données disponibles dans la bibliographie pour les eaux de rivière mais les valeurs rencontrées, comparables à celles trouvées aux Pays-Bas, semblent cependant se situer dans les valeurs les plus hautes. Les contaminations les plus fortes sont respectivement de 9,6, 31,2 et 21,6 UFP/L pour la Marne, la Seine et l Oise. Les taux d échantillons positifs sont de 3% pour la Marne, et progressent jusqu à 8,5% et 10% pour la Seine et l Oise. Bien que l occurrence et l intensité de contamination en Entérovirus cultivables puissent sembler faibles au premier abord, au regard des données classiquement observées en Europe, la Seine et l Oise présentent en réalité une contamination en Entérovirus relativement importante. La Marne semble moins concernée par cette contamination qui reste très ponctuelle en ce qui la concerne. La question de la saisonnalité peut également se poser. Selon l InVS (Antona et al., 2005), dans les zones tempérées comme en France, les Entérovirus circulent peu en hiver et au printemps, mais tous les ans, une augmentation des diagnostics d infection à Entérovirus est observée en été et automne. De manière intéressante, la mise en relation des informations de l InVS et des dénombrements réalisés montre que les détections d Entérovirus cultivables dans la Seine et dans l Oise se concentrent pendant l été et l automne simultanément à l accroissement de l incidence humaine. Treize des vingt et un échantillons positifs de l ensemble de la campagne, ont été prélevés entre le 27 mai et le 14 octobre. Alors qu avant la dernière campagne du mois de mai, aucune contamination n était visible, on constate qu à partir de fin mai, période qui coïncide avec le début des pics épidémiques, les Entérovirus sont plus fréquemment dénombrés.

19 Page 16 Cependant, l épisode d échantillons positifs observés fin janvier n est pas en accord avec les périodes de recrudescence identifiées. Le pic épidémique de faible ampleur de 2008 est cohérent avec les dénombrements obtenus qui restent dans les valeurs hautes classiquement observables, mais il est à noter que le pic de contamination signalé fin juillet 2008 par l InVS ne semble pas être suivi d un pic de contamination dans les eaux de surface ce qui pourrait s expliquer par l absence de pluie à cette période et donc de déversements directs d eaux usées dans le fleuve. Figure n 4 Distribution des cas d infection à Entérovirus par semaine (Réseau de surveillance des Entérovirus, France : période ) Source InVS, 2009a (SOx = numéro d ordre des semaines) Méthode par PCR On retiendra enfin que pour l ensemble des mesures de RT-PCR effectuées, aucune détection de génome d Entérovirus n a pu être mise en évidence. De même, les analyses PCR réalisées par le laboratoire CAE pour le compte du SEDIF n ont montré aucun résultat supérieur à la limite de détection. Cette absence de détection par RT-PCR pourrait s expliquer par les différences de volume analytique concentré et par la fraction d échantillon effectivement analysée : tandis que les méthodes de culture sont représentatives de la contamination de 10 litres d eau de surface, les méthodes de RT-PCR mettent en jeu la concentration d un seul litre d échantillon. De plus, seule une fraction de l extrait obtenu est effectivement analysée, le rendement global de la méthode doit également être considéré. Il en résulte des limites de détection de l ordre de 10 2 à 10 3 unités génome par litre qui peuvent expliquer l absence de détection par les méthodes de RT-PCR, dans la mesure où il s agit des niveaux effectivement décrits dans la bibliographie. Dans cette hypothèse, il est probable que les concentrations de génome d Entérovirus dans les eaux de surface analysées au cours de l étude soient en permanence inférieures à 10 3 unité génome/l sachant que la situation peut être différente en cas de gros orages, mais aucun prélèvement n a été effectué dans ces conditions.

20 Page Astrovirus humains La présence d Astrovirus est d après les campagnes AESN plus fréquente que celle des autres virus, de 40 à 75 % des échantillons sont positifs d un point à l autre. Tableau n 4 Valeurs caractéristiques de la concentration en génome d Astrovirus dans les ressources superficielles étudiées Astrovirus copies génome /L Min Max Moyenne (sur éch. positifs) % de positifs Marne , , % Seine Amont 56 6, , % Seine Aval 119 2, , % Oise , , % Figure n 5 Astrovirus : niveaux mesurés (maximum et moyenne sur les seuls échantillons positifs) et fréquences de détection lors de la campagne AESN 2008 (n=24). 1.E+07 MARNE SEINE AMONT SEINE AVAL OISE 1.E+06 1.E+05 Astrovirus (copies/l) 1.E+04 1.E+03 1.E+02 Max Moyenne 1.E+01 Fréquence 1.E+00 0% 20% 40% 60% 80% Annet Neuilly Alfortvil. Morsang Orly Ivry Suresnes Bezons Croissy Poissy Mery Andresy 42% 42% 50% 50% 67% 58% 50% 50% 67% 75% 67% 75% Les résultats «positifs» ne montrent pas une grande variabilité d un point à l autre ou d une campagne à l autre. On constate toutefois une augmentation de la contamination d amont en aval sur la Marne et entre la Seine amont et la Seine aval, témoignant de l impact de l agglomération parisienne. Deux périodes de contamination ont été identifiées : entre mi mars et mi avril 2008, puis depuis septembre 2008 jusqu à janvier Les niveaux maximaux mesurés lors des campagnes AESN se situent entre 2 x 10 5 et 3 x 10 6 copies/l. Les moyennes arithmétiques se situent autour de 10 5 copies/l.