Réduction du chrome (VI) par la souche Streptomyces thermocarboxydus NH50 isolée à partir d un sol pollué

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1 N d ordre : 02 ISAL 0030 Année 2002 Thèse Réduction du chrome (VI) par la souche Streptomyces thermocarboxydus NH50 isolée à partir d un sol pollué Présentée devant L institut national des sciences appliquées de Lyon Pour obtenir Le grade de docteur Formation doctorale Sciences et Techniques du Déchet École doctorale École doctorale de Chimie de Lyon (Chimie, Procédés, Environnement) Par Valérie DESJARDIN (Maître ès-sciences) Soutenue le 28 Juin 2002 devant la Commission d examen Jury MM. R. BAYARD J. COVES Rapporteur I. IGNATIADIS Rapporteur P. LEBLOND Président P. LEJEUNE Directeur de thèse R GOURDON Directeur de thèse

2 INSA DE LYON DEPARTEMENT DES ETUDES DOCTORALES ET RELATIONS INTERNATIONALES SCIENTIFIQUES MARS 2002 Ecoles Doctorales et Diplômes d Etudes Approfondies habilités pour la période ECOLES DOCTORALES n code national RESPONSABLE PRINCIPAL CORRESPONDANT INSA DEA INSA n code national RESPONSABLE DEA INSA CHIMIE DE LYON (Chimie, Procédés, Environnement) EDA206 M. D. SINOU UCBL Sec Fax M. R. GOURDON Sec Fax Chimie Inorganique Sciences et Stratégies Analytiques Sciences et Techniques du Déchet M. R. GOURDON Tél Fax ECONOMIE, ESPACE ET MODELISATION DES COMPORTEMENTS (E 2 MC) M.A. BONNAFOUS LYON Sec Fax Mme M. ZIMMERMANN Fax Villes et Sociétés Dimensions Cognitives et Modélisation Mme M. ZIMMERMANN Tél Fax M. L. FRECON Tél Fax EDA417 ELECTRONIQUE, ELECTROTECHNIQUE, AUTOMATIQUE (E.E.A.) M. G. GIMENEZ INSA DE LYON Fax Automatique Industrielle Dispositifs de l Electronique Intégrée M. M. BETEMPS Tél Fax M. D. BARBIER Tél Fax EDA160 Génie Electrique de Lyon M. J.P. CHANTE Tél Fax EVOLUTION, ECOSYSTEME, MICROBIOLOGIE, MODELISATION (E2M2) EDA403 M. J.P FLANDROIS UCBL Sec Fax M. S. GRENIER Fax Images et Systèmes Analyse et Modélisation des Systèmes Biologiques Mme I. MAGNIN Tél Fax M. S. GRENIER Tél Fax INFORMATIQUE ET INFORMATION POUR LA SOCIETE (EDIIS) M. J.M. JOLION INSA DE LYON Fax Documents Multimédia, Images et Systèmes d Information Communicants Extraction des Connaissances à partir des Données M. A. FLORY Tél Fax M. J.F. BOULICAUT Tél Fax EDA 407 INTERDISCIPLINAIRE SCIENCES- SANTE (EDISS) EDA205 M. A.J. COZZONE UCBL Sec Fax M. M. LAGARDE Fax Informatique et Systèmes Coopératifs pour l Entreprise Biochimie M. A. GUINET Tél Fax M. M. LAGARDE Tél Fax MATERIAUX DE LYON UNIVERSITE LYON 1 EDA 034 M. J. JOSEPH ECL Sec Fax M. J.M. PELLETIER Fax Génie des Matériaux : Microstructure, Comportement Mécanique, Durabilité Matériaux Polymères et Composites M. J.M.PELLETIER Tél Fax M. H. SAUTEREAU Tél Fax Matière Condensée, Surfaces et Interfaces M. G. GUILLOT Tél Fax MATHEMATIQUES ET INFORMATIQUE FONDAMENTALE (Math IF) M. NICOLAS UCBL Fax M. J. POUSIN Fax Analyse Numérique, Equations aux dérivées partielles et Calcul Scientifique M. G. BAYADA Tél Fax EDA 409 MECANIQUE, ENERGETIQUE, GENIE CIVIL, ACOUSTIQUE (MEGA) EDA162 M. J. BATAILLE ECL Sec Fax M. G.DALMAZ Fax Acoustique Génie Civil Génie Mécanique Thermique et Energétique M. J.L. GUYADER Tél Fax M. J.J.ROUX Tél Fax M. G. DALMAZ Tél Fax M. J. F. SACADURA Tél Fax En grisé : Les Ecoles doctorales et DEA dont l INSA est établissement principal

3 MARS 2002 Liste des Professeurs de l INSA de Lyon INSTITUT NATIONAL DES SCIENCES APPLIQUEES DE LYON Directeur : STORCK.A Professeurs : AUDISIO S. BABOT D. BABOUX J.C. BALLAND B. BAPTISTE P. BARBIER D. BASTIDE J.P. BAYADA G. BENADDA B. BETEMPS M. BIENNIER F. BLANCHARD J.M. BOISSON C. BOIVIN M. (Prof. émérite) BOTTA H. BOTTA-ZIMMERMANN M. (Mme) BOULAYE G. (Prof. émérite) BOYER J.C. BRAU J. BREMOND G. BRISSAUD M. BRUNET M. BRUNIE L. BUREAU J.C. CAVAILLE J.Y. CHANTE J.P. CHOCAT B. COMBESCURE A. COUSIN M. DAUMAS F. (Mme) DOUTHEAU A. DUFOUR R. DUPUY J.C. EMPTOZ H. ESNOUF C. EYRAUD L. (Prof. émérite) FANTOZZI G. FAVREL J. FAYARD J.M. FAYET M. FERRARIS-BESSO G. FLAMAND L. FLORY A. FOUGERES R. FOUQUET F. FRECON L. GERARD J.F. GERMAIN P. GIMENEZ G. GOBIN P.F. (Prof. émérite) GONNARD P. GONTRAND M. GOUTTE R. (Prof. émérite) GOUJON L. GOURDON R. GRANGE G. GUENIN G. GUICHARDANT M. GUILLOT G. GUINET A. GUYADER J.L. GUYOMAR D. PHYSICOCHIMIE INDUSTRIELLE CONT. NON DESTR. PAR RAYONNEMENT IONISANTS GEMPPM*** PHYSIQUE DE LA MATIERE PRODUCTIQUE ET INFORMATIQUE DES SYSTEMES MANUFACTURIERS PHYSIQUE DE LA MATIERE LAEPSI**** MODELISATION MATHEMATIQUE ET CALCUL SCIENTIFIQUE LAEPSI**** AUTOMATIQUE INDUSTRIELLE PRODUCTIQUE ET INFORMATIQUE DES SYSTEMES MANUFACTURIERS LAEPSI**** VIBRATIONS-ACOUSTIQUE MECANIQUE DES SOLIDES UNITE DE RECHERCHE EN GENIE CIVIL - Développement Urbain UNITE DE RECHERCHE EN GENIE CIVIL - Développement Urbain INFORMATIQUE MECANIQUE DES SOLIDES CENTRE DE THERMIQUE DE LYON - Thermique du bâtiment PHYSIQUE DE LA MATIERE GENIE ELECTRIQUE ET FERROELECTRICITE MECANIQUE DES SOLIDES INGENIERIE DES SYSTEMES D INFORMATION CEGELY* GEMPPM*** CEGELY*- Composants de puissance et applications UNITE DE RECHERCHE EN GENIE CIVIL - Hydrologie urbaine MECANIQUE DES CONTACTS UNITE DE RECHERCHE EN GENIE CIVIL - Structures CETHIL Energétique et Thermique CHIMIE ORGANIQUE MECANIQUE DES STRUCTURES PHYSIQUE DE LA MATIERE RECONNAISSANCE DES FORMES ET VISION GEMPPM*** GENIE ELECTRIQUE ET FERROELECTRICITE GEMPPM*** PRODUCTIQUE ET INFORMATIQUE DES SYSTEMES MANUFACTURIERS BIOLOGIE APPLIQUEE MECANIQUE DES SOLIDES MECANIQUE DES STRUCTURES MECANIQUE DES CONTACTS INGENIERIE DES SYSTEMES D INFORMATION GEMPPM*** GEMPPM*** INFORMATIQUE MATERIAUX MACROMOLECULAIRES LAEPSI**** CREATIS** GEMPPM*** GENIE ELECTRIQUE ET FERROELECTRICITE CEGELY*- Composants de puissance et applications CREATIS** GEMPPM*** LAEPSI****. GENIE ELECTRIQUE ET FERROELECTRICITE GEMPPM*** BIOCHIMIE ET PHARMACOLOGIE PHYSIQUE DE LA MATIERE PRODUCTIQUE ET INFORMATIQUE DES SYSTEMES MANUFACTURIERS VIBRATIONS-ACOUSTIQUE GENIE ELECTRIQUE ET FERROELECTRICITE

4 HEIBIG A. JACQUET RICHARDET G. JAYET Y. JOLION J.M. JULLIEN J.F. JUTARD A. (Prof. émérite) KASTNER R. KOULOUMDJIAN J. LAGARDE M. LALANNE M. (Prof. émérite) LALLEMAND A. LALLEMAND M. (Mme) LAREAL P. LAUGIER A. LAUGIER C. LEJEUNE P. LUBRECHT A. MAZILLE H. MERLE P. MERLIN J. MIGNOTTE A. (Mle) MILLET J.P. MIRAMOND M. MOREL R. MOSZKOWICZ P. MOURA A. NARDON P. (Prof. émérite) NIEL E. NORTIER P. ODET C. OTTERBEIN M. (Prof. émérite) PARIZET E. PASCAULT J.P. PAVIC G. PELLETIER J.M. PERA J. PERRIAT P. PERRIN J. PINARD P. (Prof. émérite) PINON J.M. PONCET A. POUSIN J. PREVOT P. PROST R. RAYNAUD M. REDARCE H. REYNOUARD J.M. RIGAL J.F. RIEUTORD E. (Prof. émérite) ROBERT-BAUDOUY J. (Mme) (Prof. émérite) ROUBY D. ROUX J.J. RUBEL P. RUMELHART C. SACADURA J.F. SAUTEREAU H. SCAVARDA S. SOUIFI A. SOUROUILLE J.L. THOMASSET D. UBEDA S. THUDEROZ C. UNTERREINER R. VELEX P. VIGIER G. VINCENT A. VRAY D. VUILLERMOZ P.L. (Prof. émérite) Liste des Professeurs de l INSA de Lyon LAB. MATHEMATIQUE APPLIQUEES LYON MECANIQUE DES STRUCTURES GEMPPM*** RECONNAISSANCE DES FORMES ET VISION UNITE DE RECHERCHE EN GENIE CIVIL - Structures AUTOMATIQUE INDUSTRIELLE UNITE DE RECHERCHE EN GENIE CIVIL - Géotechnique INGENIERIE DES SYSTEMES D INFORMATION BIOCHIMIE ET PHARMACOLOGIE MECANIQUE DES STRUCTURES CENTRE DE THERMIQUE DE LYON - Energétique et thermique CENTRE DE THERMIQUE DE LYON - Energétique et thermique UNITE DE RECHERCHE EN GENIE CIVIL - Géotechnique PHYSIQUE DE LA MATIERE BIOCHIMIE ET PHARMACOLOGIE GENETIQUE MOLECULAIRE DES MICROORGANISMES MECANIQUE DES CONTACTS PHYSICOCHIMIE INDUSTRIELLE GEMPPM*** GEMPPM*** INGENIERIE, INFORMATIQUE INDUSTRIELLE PHYSICOCHIMIE INDUSTRIELLE UNITE DE RECHERCHE EN GENIE CIVIL - Hydrologie urbaine MECANIQUE DES FLUIDES LAEPSI**** GEMPPM*** BIOLOGIE APPLIQUEE AUTOMATIQUE INDUSTRIELLE DREP CREATIS** LAEPSI**** VIBRATIONS-ACOUSTIQUE MATERIAUX MACROMOLECULAIRES VIBRATIONS-ACOUSTIQUE GEMPPM*** UNITE DE RECHERCHE EN GENIE CIVIL - Matériaux GEMPPM*** ESCHIL Equipe Sciences Humaines de l Insa de Lyon PHYSIQUE DE LA MATIERE INGENIERIE DES SYSTEMES D INFORMATION PHYSIQUE DE LA MATIERE MODELISATION MATHEMATIQUE ET CALCUL SCIENTIFIQUE GRACIMP Groupe de Recherche en Apprentissage, Coopération et Interfaces Multimodales pour la Productique CREATIS** CENTRE DE THERMIQUE DE LYON - Transferts Interfaces et Matériaux AUTOMATIQUE INDUSTRIELLE UNITE DE RECHERCHE EN GENIE CIVIL - Structures MECANIQUE DES SOLIDES MECANIQUE DES FLUIDES GENETIQUE MOLECULAIRE DES MICROORGANISMES GEMPPM*** CENTRE DE THERMIQUE DE LYON Thermique de l Habitat INGENIERIE DES SYSTEMES D INFORMATION MECANIQUE DES SOLIDES CENTRE DE THERMIQUE DE LYON - Transferts Interfaces et Matériaux MATERIAUX MACROMOLECULAIRES AUTOMATIQUE INDUSTRIELLE PHYSIQUE DE LA MATIERE INGENIERIE INFORMATIQUE INDUSTRIELLE AUTOMATIQUE INDUSTRIELLE CENTRE D INNOV. EN TELECOM ET INTEGRATION DE SERVICES ESCHIL Equipe Sciences Humaines de l Insa de Lyon CREATIS** MECANIQUE DES CONTACTS GEMPPM*** GEMPPM*** CREATIS** PHYSIQUE DE LA MATIERE

5 Liste des Professeurs de l INSA de Lyon Directeurs de recherche C.N.R.S. : BERTHIER Y. CONDEMINE G. COTTE-PATAT N. (Mme) FRANCIOSI P. MANDRAND M.A. (Mme) POUSIN G. ROCHE A. SEGUELA A. Directeurs de recherche I.N.R.A. : FEBVAY G. GRENIER S. RAHBE Y. Directeurs de recherche I.N.S.E.R.M. : PRIGENT A.F. (Mme) MAGNIN I. (Mme) MECANIQUE DES CONTACTS UNITE MICROBIOLOGIE ET GENETIQUE UNITE MICROBIOLOGIE ET GENETIQUE GEMPPM*** UNITE MICROBIOLOGIE ET GENETIQUE BIOLOGIE ET PHARMACOLOGIE MATERIAUX MACROMOLECULAIRES GEMPPM*** BIOLOGIE APPLIQUEE BIOLOGIE APPLIQUEE BIOLOGIE APPLIQUEE BIOLOGIE ET PHARMACOLOGIE CREATIS** * CEGELY CENTRE DE GENIE ELECTRIQUE DE LYON ** CREATIS CENTRE DE RECHERCHE ET D APPLICATIONS EN TRAITEMENT DE L IMAGE ET DU SIGNAL ***GEMPPM GROUPE D'ETUDE METALLURGIE PHYSIQUE ET PHYSIQUE DES MATERIAUX ****LAEPSI LABORATOIRE D ANALYSE ENVIRONNEMENTALE DES PROCEDES ET SYSTEMES INDUSTRIELS

6 Remerciements Ces travaux de recherche ont été menés au Laboratoire d Analyse Environnementale des Procédés et des Systèmes Industriels (LAEPSI) et dans l Unité de Microbiologie et de Génétique (UMG) de l INSA de Lyon. Je remercie Monsieur Pierre Moszkowicz (Directeur du LAEPSI) et Madame Nicole Cotte-Pattat (Directrice de l UMG) de m avoir accueillie au sein de leurs laboratoires. Je tiens à remercier Messieurs les Professeurs Rémy Gourdon et Philippe Lejeune, mes deux Directeurs de thèse, pour la confiance qu ils m ont accordée et pour leur aide tout au long de ce travail. Un merci tout particulier à Rémy Grand Chef pour ses chansons, sa bonne humeur et pour la bonne ambiance qui régnait dans l équipe Bio (et aussi pour les multiples relectures de manuscrits, de résumés, de posters, d articles, merci pour ta patience). Je remercie aussi le Professeur Pierre Leblond du Laboratoire de Génétique et de Microbiologie (Nancy) qui m a permis de réaliser une partie de cette étude dans son équipe. Merci pour l accueil qui m a été fait, pour tous les conseils qui m ont été donnés, et pour toutes ces histoires passionnantes sur l instabilité génétique des bras du chromosome de Streptomyces. Merci aussi de m avoir fait l honneur de participer au jury. Un merci tout particulier à Thomas Wenner, pour son aide scientifique et technique mais surtout pour son amitié et les soirées à Nancy. Je remercie aussi Philippe Mazodier, Directeur du Groupe Streptomyces de l Unité de Biochimie Microbienne de l Institut Pasteur à Paris pour ces précieux conseils concernant les manipulations avec Streptomyces. Merci aussi pour l accueil qui m a été fait et merci à Julie Viala, son étudiante, pour son aide. Je remercie aussi le Professeur Claude Roby du Laboratoire de Résonance Magnétique en Biologie Moléculaire du CEA de Grenoble qui m a permis de réaliser les spectres RMN. Merci à Sandra Cortes, son étudiante, qui m a aidée à réaliser les spectres et à les interpréter. Je remercie Monsieur Jacques Covès du Laboratoire de Chimie et Biochimie des Centres Redox Biologiques du CEA de Grenoble pour son accueil dans son laboratoire, pour son aide et aussi pour m avoir fait l honneur de juger ce travail. Je remercie également Monsieur Ioannis Ignatiadis du BRGM d Orléans, qui m a fait l honneur de juger ce mémoire.

7 Je remercie particulièrement Monsieur Rémy Bayard pour l intérêt qu il a porté à cette étude, pour ses conseils et sa disponibilité. Merci pour l agréable ambiance qui a régné dans le bureau pendant les 4 années passées au LAEPSI. Je remercie aussi l ensemble du personnel de l UMG, en particulier Nico, Agnès, Guy et Corinne pour leur aide, leur soutien et leurs conseils. Merci aussi à Véronique, Valérie, Yvette et Jean Michel sans qui ce travail aurait été beaucoup plus fastidieux. Merci aussi à Sylvie Nazaret et Aline Efosse du laboratoire d Écologie Microbienne du Sol de l Université Claude Bernard pour la lyophilisation des échantillons. Merci à Piia, Clotilde, Tina et Sylvie qui ont fait leur stage avec moi. Merci pour leur sérieux, leur rigueur mais aussi pour les bons moments passés ensemble. Merci à l ensemble du personnel du LAEPSI et en particulier aux thésards et étudiants en DEA (Gwénaëlle (pour tous les moments que l on a partagé et pour tous ceux à venir), Soso (qui a travaillé un an sur ce sujet, merci aussi pour le fameux WE au ski (!!) et les bons moments passés en «vacances» à Chania), Manu (pour sa bonne humeur et sa gentillesse, pour tous les problèmes d ordinateur résolus et pour ses pirouettes à Québec), Camille, Catherine, Zo, Fred, Khalil, Enrico, Vincent, Sonia, Aurélie, Céline, Fairouz, Apichat, Bobo, Fabian Papa, Maman, un immense merci pour votre confiance et pour votre aide pendant ces longues années d études loin de vous. Merci aussi à mes deux sœurs, à Sylvie qui a réalisé un nombre impressionnant de «patch», j espère qu elle gardera un bon souvenir de son stage et à Nathalie pour tous les bons moments passés dans sa petite famille. A Djé, tout mon amour, merci de ta confiance et de ton soutien.

8 Liste des Abréviations ADN : Acide desoxyribonucléique. ARN : Acide ribonucléique. ARNm : ARN messager. ARNr : ARN ribosomial. ARNt : ARN de transfert. Cm : chloramphénicol Cr(III) : chrome trivalent Cr(VI) : chrome hexavalent DMSO : Diméthylsulfoxide (CH 3 ) 2 S. EDTA : Ethylènediamine tétra-acétate. ESR : Electron Spin Resonance EXAFS : Extented X-ray Absorption Fine Structure. FMN : flavine mononucléotide. G : glucose. Gm : gentamycine LB : Luria Broth. NAD+, NADH : Nicotinamide adénine dinucléotide (oxydé, réduit). NADP, NADPH : Nicotinamide adénine dinucléotide-phophate (oxydé, réduit). RMN : Résonance Magnétique Nucléaire. RPE : Résonance Paramagnétique Electronique. SDS : Sodium Dodécyl Sulfate. TES : acide N-tris[hydroxymethyl]methyl-2-aminoethanesulfonique ; acide 2-[(2-hydroxy-1,1- bis[hydroxymethyl]ethyl)amino]ethanesulfonique. Tsr : thiostrepton VB : Vogel-Bonner. Y : glycérol. YEME : Yeast Extract-Malt Extract.

9 RÉSUMÉ Le chrome est l un des métaux les plus largement utilisés dans l industrie. Aujourd hui, suite à un non respect ou à l insuffisance des lois en vigueur ou à des accidents, un grand nombre de sites et d anciens sites industriels sont pollués par du chrome. Le chrome est présent dans l environnement principalement sous deux formes : le Cr(III) et le Cr(VI). La forme hexavalente, que l on retrouve dans les rejets industriels, est très toxique et très soluble dans l eau. Cette solubilité lui confère une grande mobilité dans les écosystèmes. La réduction du chrome (VI) en chrome (III) permet de limiter sa mobilité et sa toxicité et ainsi de réduire les impacts écotoxicologiques potentiels. Le sol, pollué ou non, contient une microflore abondante qui peut dans certains cas métaboliser les substances polluantes et ainsi réduire le caractère toxique de certains composés. De plus en plus de travaux de recherche tentent d exploiter ce phénomène de «dépollution naturelle» afin de mettre au point des procédés de traitement biologique des rejets pollués. Ces procédés pourraient être utilisés en complément des procédés physicochimiques, thermiques et électrochimiques déjà existants. A partir d un sol, provenant d un site de l agglomération lyonnaise pollué par des ions chromate, une nouvelle souche bactérienne, capable de réduire le Cr(VI) a été isolée. Cette souche a été identifiée comme appartenant au genre Streptomyces et à l espèce thermocarboxydus. Elle a été appelée NH50. L objectif de ce travail a été de caractériser cette souche bactérienne afin de déterminer d une part si les mécanismes de résistance Cr(VI) et de réduction du Cr(VI) étaient similaires à ceux décrits chez d autres bactéries présentant les mêmes phénotypes et d autre part si l on pouvait envisager de l utiliser dans un procédé de traitement biologique. Les résultats obtenus ont montré que Streptomyces thermocarboxydus NH50 possède un niveau de résistance aux ions chromate supérieur à celui d autres Streptomyces étudiés. La présence d un plasmide linéaire, qui est absent chez les autres souches étudiées, suggère que le ou les gènes responsables de la résistance au Cr(VI) soient localisés sur l ADN extra-chromosomique. Les différentes expériences de conjugaison et de mutagenèse n ont cependant pas permis de démontrer ni d exclure la participation du plasmide, en tant que support génétique, dans le phénomène de résistance au chrome. L étude de la réduction du Cr(VI) en culture pure par la souche NH50 a montré que l activité chromate réductase est localisée dans les surnageants de culture. Il s agit de molécules de faible masse moléculaire (< 1000 Daltons). D après les spectres RMN du 13 C, la (ou les) molécule(s) réductrices possède(nt) deux fonctions carboxyliques et plusieurs fonctions hydroxyles.

10 L application de surnageants lyophilisés et concentrés dix fois sur du sol pollué (ratio massique Liquide /Solide = 1) a permis de réduire tout le chrome (VI) présent (pollution initiale d environ 2000 mg.kg -1 ) en une quinzaine de jours. En conclusion, cette étude permet d envisager l utilisation des surnageants de culture de la souche Streptomyces thermocarboxydus NH50 dans un procédé de dépollution qui présenterait l avantage de pouvoir s affranchir des problèmes de toxicité des polluants présents qui peuvent compromettre l efficacité des traitements biologiques basés sur l utilisation de cellules vivantes. MOTS-CLES : Bioréduction, Chrome, Streptomyces, Mobilité, Toxicité, Traitement, Sol pollué

11 Cette étude a fait l objet de : COMMUNICATIONS ORALES : Colloque Franco-québécois (Québec, Canada). La pluridisciplinarité dans les problèmes de l environnement : les interactions Air Sol Eau. «Limitation de la mobilité du chrome par l utilisation d une souche de Streptomyces capable de le réduire de manière non-enzymatique en présence de Cu 2+». MARS 2001 First European Bioremediation Conference (Chania, Crête). Utilisation of supernatants of pure cultures of Streptomyces thermocarboxydus to reduce chromium toxicity and mobility in contaminated soils. JUILLET (soumis pour publication dans Air, Soil and Pollution) PUBLICATIONS : Desjardin V., Bayard R., Huck N., Manceau A., Gourdon R (2002) Effect of microbial activity on the mobility of chromium in soils. Waste Managment. 22, p Desjardin V., Bayard R., Lejeune P., Gourdon R. Utilisation of supernatants of pure cultures of Streptomyces thermocarboxydus NH50 to reduce chromium toxicity and mobility in contaminated soils. Water, Air and Soil Pollution : Focus / Bioremediation I. (sous presse).

12 SOMMAIRE BIBLIOGRAPHIE SOMMAIRE I. DISTRIBUTION, CHIMIE ET TOXICITÉ DU CHROME Introduction Répartition naturelle du chrome et sources de pollution Répartition naturelle Répartition dans les roches et les sols Réserves et production minières Répartition dans les eaux Répartition dans l atmosphère Sources industrielles Les sites pollués Exemple d une pollution par le chrome : Le site de Joseph Forest Products à Wallowa County, Oregon, Etats Unis Réactivité chimique du chrome dans l environnement Etats d oxydation Spéciation Le chrome hexavalent, Cr(VI) Le chrome trivalent, Cr(III) Réactions et comportement Le chrome hexavalent a Réduction par le fer b Réduction par les sulfures c Réduction par la matière organique d Réduction photochimique e Réduction biologique Le chrome trivalent Mobilité

13 SOMMAIRE 4. Toxicité du chrome Chez les animaux Chez les végétaux Chez les micro-organismes 28 II. LES SITES POLLUÉS Introduction Inventaire des sites pollués en France (Nov 2000) Réglementation en matière de sites pollués Démarche méthodologique d analyse environnementale Évaluation Simplifiée des Risques (ESR) Evaluation Détaillée des Risques (EDR) Traitements des sites pollués : aspects généraux Méthodes mécaniques Excavation Tri Broyage Méthodes géochimiques Confinement Barrières actives Technique «Pump and Treat» Méthodes chimiques et électrochimiques Mobilisation et extraction Stabilisation / solidification Electromigration Méthodes thermiques Désorption thermique Incinération Vitrification Méthodes biologiques 38 2

14 SOMMAIRE 6. Traitement des sites pollués au chrome Inventaire Techniques de traitement Extraction du chrome a Lavage du sol b Extraction thermique c Electromigration Immobilisation du chrome a Stabilisation b Atténuation naturelle c Amendement en matières organiques d Techniques de Bio-remédiation III. RÉSISTANCE MICROBIENNE AU CHROME ET MÉCANISMES DE RÉDUCTION Résistance au chrome : aspects généraux Mutation du système de transport du sulfate Système d efflux : la protéine ChrA Réduction du Cr(VI) par les bactéries Introduction Cas particulier des bactéries sulfato-réductrices Cycle du soufre Réduction indirecte du Cr(VI) chez les bactéries sulfato-réductrices (BSR) Réduction enzymatique du chrome (VI) par les BSR Cas des autres bactéries Mécanismes biochimiques a En anaérobiose b En aérobiose Influence de divers paramètres Influence de la concentration en Cr(VI) Influence du taux d oxygène dissous sur la réduction du chrome (VI) ph optimum et température optimum Effet d autres métaux

15 SOMMAIRE 3. Application au traitement de solutions ou de sols pollués par du chrome : quelques exemples Traitements anaérobies Culture mixte exogène/cr(vi) en solution Culture mixte + Escherichia coli ATCC33456/Cr(VI) en solution Procédés aérobies Flore endogène/cr(vi) dans le sol Pseudomonas fluorescens LB300/Cr(VI) en solution Pseudomonas mendocina MCM B-180/Cr(VI) dans le sol

16 SOMMAIRE MATÉRIELS ET MÉTHODES 1. Sol pollué et méthodes analytiques Origine Prélèvement du sol et re-contamination en chrome (VI) Extraction du chrome (VI) contenu dans le sol Extraction par l eau Extraction par une solution alcaline Dosage du chrome et du cuivre Cu Dosage du chrome (VI) Dosage du chrome total Dosage du Cuivre Cu Humidité résiduelle des échantillons de sol Milieux de culture Milieux liquides Milieu M Milieu VB (Vogel-Bonner) Milieu LB (Luria Broth) Milieu PEG Milieu YEME (Yeast Extract Malt Extract) Milieux solides M63 et LB R NE Ajout des antibiotiques Isolement de Streptomyces thermocarboxydus NH Isolement de la souche réductrice (effectué par N. Huck en 1997) Identification 83 5

17 SOMMAIRE 4. Bactéries et techniques microbiologiques et biochimiques Transformation d Escherichia coli NM Streptomyces Préparation du stock de spores Cultures Préparation de protoplastes de Streptomyces Transformation des protoplastes Conjugaisons Electrophorèse en champ pulsé Préparation des «inserts» («plugs») Traitement des «inserts» Electrophorèse Etude des molécules réductrices dans les surnageants de cultures Récupération des surnageants Lyophilisation des surnageants Fractionnement des surnageants lyophilisés Dosage des protéines contenues dans les surnageants par la méthode de Bradford Résonance Magnétique Nucléaire du carbone Procédures expérimentales d étude de la réduction du Cr(VI) en présence de sol Milieu dispersé («batch») Microcosmes Lysimètres Lit bactérien 91 6

18 SOMMAIRE RÉSULTATS I. CARACTÉRISATION DE LA SOUCHE Streptomyces thermocarboxydus NH50 ISOLÉE D UN SOL POLLUÉ PAR DU Cr(VI) ET DE SA RÉSISTANCE AU Cr(VI) Historique Introduction Remise en culture de la souche Principales caractéristiques physiologiques et biochimiques de la souche Streptomyces thermocarboxydus NH Aspect des cultures En milieu liquide Sur milieu solide Réduction du chrome (VI) Sensibilité à différents antibiotiques Recherche d un éventuel plasmide Conclusion Résistance au chrome Étude préliminaire Résistance comparé de différentes souches de Streptomyces Détermination de la concentration létale 50 en chrome Résistance à d autres métaux lourds Etude de la résistance au chrome Transport du sulfate Recherche du support génétique responsable de la résistance au chrome a Curage du plasmide b Conjugaison c Mutagenèse Conclusion 121 7

19 SOMMAIRE II. RÉDUCTION DU CHROME (VI) EN SOLUTION PAR NH50 EN CULTURES PURES Introduction Effet de différents paramètres Effet de la taille de l inoculum Effet de la source de carbone Effet d autres métaux Etude de la localisation de l activité réductrice Localisation de l activité réductrice Effet des ions Cu 2+ sur la réduction du Cr(VI) par des surnageants de culture Effet de la présence de Cr(VI) au préalable dans les cultures Effet de la concentration initiale en Cr(VI) sur la réduction par des surnageants de cultures Effet de la température d incubation Etude de la nature de la (des) molécule(s) responsable(s) de la réduction du Cr(VI) Recherche de molécules protéiques Action de protéases Effet du SDS Précipitation du surnageant à l éthanol Lyophilisation Fractionnement des surnageants de culture lyophilisés Etude par Résonance Magnétique Nucléaire du 13 C Conclusion

20 SOMMAIRE III. ETUDE DE LA RÉDUCTION DU CR(VI) EN PRÉSENCE DE SOL POLLUÉ Caractéristiques du sol Réduction du chrome (VI) dans un sol pollué : étude en milieu dispersé (batch) Conditions aérobies Conditions anaérobies Réduction du chrome (VI) par la flore endogène aérobie Effet de la source de carbone Effet d une augmentation de la flore endogène Effet de la concentration initiale en glucose Effet de la concentration initiale en chrome (VI) a Essai avec la flore endogène sans enrichissement b Essai avec la flore endogène enrichie Réduction du chrome (VI) par des flores exogènes aérobies Pseudomonas fluorescens LB Streptomyces thermocarboxydus NH a Enrichissement sous forme de spores b Ensemencement de S. thermocarboxydus NH50 sous la forme mycélienne Conclusions Expériences en microcosmes Effet de l apport d un inoculum de NH50 (sous forme de spores) et de la source de carbone pour un rapport massique C/N/P/Cr(VI) de 100/8/0,5/1, Effet de l apport d un inoculum (NH50 ou LB300) pour un rapport massique C/N/P/Cr(VI) de 100/14/103/55,5 (milieu M63) Etude en microcosmes de la réduction par des surnageants de culture Effet de la dilution des surnageants Utilisation de surnageants lyophilisés et concentrés Effet du cuivre Conclusions 185 9

21 SOMMAIRE 4. Etudes en lysimètres et lit bactérien Etude en lysimètres Evaluation préliminaire de la bio-stimulation et de la bio-augmentation a Aspect du sol dans chacun des lysimètres après 15 jours b Suivi des concentrations en chrome (VI) en solution Comparaison des techniques de bio-stimulation et de bio-augmentation a Aspect du sol dans chacun des lysimètres b Suivi des concentrations en chrome (VI) en solution Evaluation globale du traitement par bilan matière et caractérisation écotoxicologiques a Aspect du sol dans chacun des lysimètres après 15 jours b Suivi des concentrations en chrome (VI) en solution en début de traitement c Aspect de la solution contenue dans les réacteurs d Devenir du chrome après 3 mois de traitement et bilan matière e Evaluation de l écotoxicité du sol et de son percolat avant et après traitement (étude réalisée par POLDEN) Conclusions Traitement des lixiviats en lit bactérien 198 CONCLUSION ET PERSPECTIVES

22 SOMMAIRE ANNEXES 1. Les Streptomyces Caractéristiques du genre Streptomyces Généralités Cycle de différentiation cellulaire Génétique des Streptomyces Le génome Les plasmides Alignement multiple des 7 séquences des membres de la famille CHR Résonances (ppm) des atomes de carbone de différentes molécules. Liste fournie par S. Cortes du laboratoire de Résonance Magnétique en Biologie Moléculaire CEA Grenoble RÉFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES LISTE DES FIGURES LISTE DES TABLEAUX

23 INTRODUCTION INTRODUCTION Le XX ème siècle aura été le siècle pendant lequel l industrie s est le plus développée. Cette croissance exponentielle a permis des progrès considérables pour l Humanité mais a aussi engendré un nombre important de conséquences néfastes pour l environnement et pour l Homme. Le chrome est l un des métaux les plus largement utilisés dans l industrie car il possède un grand nombre de qualités. Il est utilisé notamment dans l industrie des aciers inoxydables, dans la tannerie, pour le traitement du bois Des quantités importantes de chrome ont été rejetées dans l environnement suite à un non respect ou à l insuffisance des lois en vigueur, à de la négligence ou à des accidents. Aujourd hui, beaucoup de sites et d anciens sites industriels sont pollués par du chrome. C est la forme dite hexavalente qui est la plus problématique car sous cette forme, le chrome est très toxique mais aussi très soluble dans l eau. Cette solubilité lui confère une grande mobilité dans les écosystèmes si bien qu une pollution au chrome (VI) d abord très localisée peut concerner ensuite une zone beaucoup plus vaste. Les méthodes mises en œuvre aujourd hui pour traiter les rejets pollués par du chrome (VI) visent généralement à réduire le chrome (VI) en chrome (III) afin de diminuer les impacts écotoxicologiques et l étendue de ces impacts. En parallèle des méthodes physico-chimiques et électrochimiques existantes, de plus en plus de travaux de recherche tentent d exploiter la capacité de la nature à se régénérer elle-même. Le sol est un milieu «vivant». Une microflore très riche, qui a su s adapter aux pollutions les plus diverses, utilise parfois les substances polluantes pour se développer. Un nombre important de bactéries a été isolé de sites pollués au chrome (VI) et une partie d entre elles est capable de réduire le chrome (VI) en chrome (III). Cette capacité à réduire le chrome (VI) et par conséquent sa toxicité et sa mobilité permet d envisager la mise au point de bio-procédés pour traiter les sols (et les effluents) pollués au chrome. C est dans ce contexte qu a été isolée, à partir d un sol pollué de la région lyonnaise, une souche bactérienne de Streptomyces thermocarboxydus, que nous avons appelée NH50. Cette souche est capable de croître dans un milieu contenant des ions chromate et de réduire ces ions sous forme trivalente. 12

24 INTRODUCTION Nous avons dans un premier temps déterminer les principales caractéristiques physiologiques et biochimiques de cette nouvelle souche. Nous avons notamment étudié la résistance au chrome (VI) afin d élucider les mécanismes de résistance au chrome propres à cette souche bactérienne. Cette souche est en effet destinée à être utilisée dans un procédé de biorémédiation pour traiter un sol pollué au chrome (VI). Nous avons, dans un deuxième temps, étudier la réduction du chrome (VI) en culture pure pour définir les conditions optimales afin de réduire le chrome (VI) et déterminer le mécanisme de réduction du chrome. Enfin, dans une troisième partie, nous avons utilisé la souche de Streptomyces thermocarboxydus NH50 pour réduire le chrome (VI) contenu dans un sol (étude en milieu dispersé, microcosmes et lysimètres) afin de mettre au point un procédé de traitement de sol pollué. 13

25 BIBLIOGRAPHIE BIBLIOGRAPHIE 14

26 BIBLIOGRAPHIE DISTRIBUTION, CHIMIE ET TOXICITÉ DU CHROME I. DISTRIBUTION, CHIMIE ET TOXICITÉ DU CHROME 1.Introduction Le chrome a été découvert dans l Oural à Beresovsk dans du minerai de plomb rouge (crocoïte) à la fin du XVIII ème siècle par le chimiste français Nicolas Louis Vauquelin ( ). Ce métal fut nommé ainsi à cause des couleurs éclatantes qu il donne à certains de ses composés (khrôma en grec signifie couleur). Les couleurs du rubis et de l émeraude par exemple sont dues à la présence de Cr(III). Le chrome fut utilisé au début du XIX ème siècle dans les procédés de pigmentation aux bichromates, mis au point par Alphonse Louis Poitevin, pour la photographie. Le chrome a aujourd hui trouvé un grand nombre d applications industrielles qui exploitent ses couleurs mais aussi un grand nombre de ses autres qualités qui sont la solidité, la dureté et la résistance à la corrosion ainsi que les capacités oxydantes de certaines de ses formes. Il n est pas surprenant, compte tenu de toutes ces qualités, que de grandes quantités de chrome soient utilisées de par le monde dans différents procédés industriels et qu en conséquence de grandes quantités de déchets chromés soient produites et éventuellement rejetées dans l environnement. Alors que le chrome en très faible quantité, «à l état de trace», est essentiel pour la vie humaine, l exposition répétée et régulière aux composés chromés peut entraîner de graves dommages pour la santé. Les quantités très importantes de chrome dispersées par certaines activités industrielles présentent aussi un réel danger pour les écosystèmes. 2.Répartition naturelle du chrome et sources de pollution 2.1. Répartition naturelle Le chrome se retrouve dans tous les compartiments de l environnement, aussi bien dans l eau que dans l air et le sol mais aussi par extension dans les organismes vivants Répartition dans les roches et les sols La concentration moyenne en chrome de la croûte continentale est de 125 mg.kg -1 avec des valeurs généralement comprises entre 80 et 200 mg.kg -1 (Losi et al., 1994). Il est largement présent dans les roches ignées où le chrome trivalent peut se substituer à Fe 3+ car leurs rayons ioniques sont très proches (r Fe 3+ = 0,067 nm et r Cr 3+ = 0,064 nm). Il se substitue aussi à Fe 3+ et à Al 3+ dans d autres minéraux 15

27 BIBLIOGRAPHIE DISTRIBUTION, CHIMIE ET TOXICITÉ DU CHROME comme les tourmalines, les micas et les grenats. Les traces de chrome sont souvent responsables de la couleur de ceux-ci comme le vert de l émeraude et le rouge du rubis. La teneur en chrome des sols est largement dépendante de leur nature. La concentration moyenne d un sol est autour de 40 mg.kg -1 avec des variations entre 10 et 150 mg.kg -1. Le Tableau I présente les concentrations en chrome rencontrées dans différents échantillons de roches et minéraux : Tableau I : Concentration moyennes en chrome dans différents minéraux (d après Govindaraju, 1984) Roches/Minéraux Péridots Basaltes Grabbros Argiles Micas Feldspaths Quartz Cr en ppm ou mg.kg / / / / Réserves et production minières Les plus grands pays producteurs de chromite sont l Afrique du Sud avec 1490 milliers de tonnes de métal pour l année 1995, le Kazakhstan avec t.an -1 puis le Zimbabwe ( t.an -1 ), l Inde ( t.an -1 ), la Turquie et l Albanie ( t.an -1 ), la Finlande et le Brésil (175 et t.an -1 respectivement). La France produisait environ t.an -1 de minerai jusqu en 1991 en Nouvelle- Calédonie dans les mines de Tiebaghi et d Alice-Louise, principalement exporté vers la Chine et le Japon. Ces mines sont fermées depuis dix ans maintenant. Aujourd hui la France importe annuellement près de tonnes de chromite extraite en Albanie (41 %), en Turquie (22 %) et en Afrique du Sud (20 %). Les réserves mondiales en chromite ont été estimées en 1990 à 1,4 milliard de tonnes dont 70 % sont situées en Afrique du Sud, 10 % au Zimbabwe, 9 % au Kazakhstan, 4 % en Inde et 1 % en Finlande (www.sfc.fr consulté le 10/09/01) Répartition dans les eaux L altération et l érosion des roches est une source importante de libération du chrome dans l environnement. Les processus d érosion naturels libèrent le chrome qui peut être transporté vers les eaux de surface et les eaux souterraines. Dans les eaux douces, la concentration en chrome est en général comprise entre 0,1 et 6 µg.l -1 avec une moyenne à 1 µg.l -1 alors que l on trouve une moyenne de 0,3 µg.l -1 dans les eaux de mer avec des variations plus importantes des valeurs (0,2 jusqu à 50 µg.l -1 ) (Losi et al., 1994). La concentration en chrome de certaines eaux peut atteindre des valeurs assez élevées, jusqu à 800 µg.l -1 dans les eaux de drainage dans San Joaquin Valley en Californie en raison de l irrigation de zones agricoles contenant des valeurs élevées en chrome (Deverel et Millard, 1988). La concentration dans les eaux est étroitement liée à la concentration des sols adjacents. 16

28 BIBLIOGRAPHIE DISTRIBUTION, CHIMIE ET TOXICITÉ DU CHROME Répartition dans l atmosphère Les teneurs en chrome de l atmosphère varient aussi beaucoup selon la localisation. Des zones comme l Antarctique ou le Groenland présentent des valeurs de l ordre de 10-6 à 10-3 µg.m -3. Ces valeurs sont considérées comme des valeurs basales dues aux poussières constituées de particules de sol amenées par le vent ( tonnes par an) ou dispersées par l activité volcanique ( tonnes par an). En comparaison, des analyses effectuées sur des échantillons collectés en zone urbaine présentent des concentrations pouvant atteindre 0,03 µg.m -3, valeurs largement dépassées dans des zones d industrie de l acier (Losi et al., 1994) Sources industrielles Les concentrations en chrome mesurées dans la pédosphère, l hydrosphère, l atmosphère et la biosphère sont liées pour l essentiel à des émissions d origine industrielle. Le chrome est extrait sous forme de minerai de chromite de formule chimique complexe [(Fe, Mg)O(Cr, Al, Fe) 2 O 3 ] ou plus simplement sous forme de FeCrO 4. Cette chromite est principalement utilisée en sidérurgie et en métallurgie (70 %), dans la production de réfractaire (15 %) et en chimie (15 %). Selon les régions du monde, les minerais sont de qualité différente. Il existe une première catégorie, les minerais dits riches, c est-à-dire contenant entre 48 et 55 % (w/w) de Cr 2 O 3 avec un rapport Cr/Fe supérieur à 3. Ces minerais sont principalement extraits en Turquie, en Albanie et en Grèce. Ils sont destinés à la fabrication des ferrochromes (voir ci-dessous). La deuxième catégorie est constituée des minerais dits pauvres où la teneur en Cr 2 O 3 est de l ordre de 40 % et le rapport Cr/Fe est d environ 1,6. Ils sont extraits en Afrique du Sud. Ils servent à la fabrication de matériaux réfractaires mais aussi, depuis l introduction des procédés AOD (Arc-Oxygène-Dégazage, convertisseur d acier carbone en acier inoxydable), à l élaboration des aciers inoxydables. Ils sont également employés pour élaborer des ferrochromes appelés charge-chrome à basse teneur en Cr (50-55 % de Cr et 6-8 % de C). Utilisation du chrome dans l industrie Les ferrochromes : les ferrochromes sont élaborés au four électrique à arc. Ils sont le plus souvent utilisés pour la production des aciers, dont les aciers inoxydables, et aussi de la fonte. On en distingue 3 grands types en fonction de leur composition chimique : le charge-chrome (50 à 55 % de Cr, 6 à 8 % de C et 2 à 5 % de Si), le ferrochrome carburé (60 à 65 % de Cr, 4 à 8 % de C) et le ferrochrome bas carbone raffiné et suraffiné (67 à 75 % de Cr, 0,02 à 0,5 % de C). Dans le monde en 1994, 3124 milliers de tonnes de ferrochromes (charge-chrome et carburé) ont été produites dont près d un tiers par l Afrique du Sud. Ensuite, on trouve la Chine, l Inde, la Finlande, le Japon, le Kazakhstan, la Russie et le Zimbabwe qui produisent entre 150 et 250 milliers de tonnes 17

29 BIBLIOGRAPHIE DISTRIBUTION, CHIMIE ET TOXICITÉ DU CHROME chacun. A partir de minerais importés, la France ne produit que 22 milliers de tonnes qu elle exporte en quasi totalité vers l Allemagne et la Belgique. Elle en importe 10 fois plus en provenance d Afrique du Sud (61 %), de Finlande (9 %) et de Suède (8 %) (www.sfc.fr). Le chrome métal : Le chrome métal de couleur gris acier est très dur, cassant, brillant, résistant à la corrosion et facilement polissable. Il est obtenu par aluminothermie à partir d oxyde de chrome ou par électrolyse à partir de ferrochrome. La réaction mise en jeu dans l aluminothermie est la suivante : Cr 2 O Al 2 Cr + Al 2 O 3 équation 1 Dans le monde, tonnes de chrome sont produites annuellement. La France en utilise tonnes et en exporte plus de tonnes. La société Delachaux est le premier producteur européen de chrome par aluminothermie et occupe le 3 ème rang mondial (www.sfc.fr). Le chrome métal est utilisé dans les superalliages (en présence de nickel et de cobalt), dans la fabrication des pigments et de bandes magnétiques ainsi que pour les soudures électriques et l électronique. Pour le chromage des pièces métalliques, le chrome a deux utilisations : le dépôt de chrome décor effectué par électrolyse qui a pour but de recouvrir d une faible épaisseur les pièces métalliques essentiellement nickelées. La couche finale, n ayant qu un rôle esthétique, permet d éviter le ternissement de la surface de nickel par sulfuration. Lorsque la couche de chrome atteint une épaisseur de plusieurs dixièmes de mm, on parle de chrome dur et dans ce cas le chrome sert directement à protéger la pièce métallique. Le chrome apporte une excellente résistance à l usure, aux frottements, à la corrosion, une grande dureté de surface et des propriétés antiadhérentes. On retrouve la technique du chromage dans l industrie automobile, l aéronautique, pour les arbres de transmission des machines-outils, pour les appareils de mesure et les moules pour plastique. Le chrome est aussi utilisé pour ses propriétés fongicides dans le traitement du bois. L ancienne technique pour protéger le bois consistait à carboniser le bois mais ce procédé rendait celui-ci extrêmement cassant. L utilisation du sulfate de cuivre et de chlorure de zinc posait un problème de délavabilité. L ajout de chrome améliore significativement la fixation des composants actifs comme le cuivre et l arsenic. Les mélanges les plus utilisés sont l ACC (Arsenic Cuivre Chrome) et le BCC (Bore Cuivre Chrome) Le stockage inadapté et des structures défaillantes sont à l origine de graves pollutions industrielles. Le sol est le plus touché avec tonnes de chrome rejeté par an. Viennent ensuite les eaux de surface qui récupèrent environ tonnes par an et l atmosphère avec tonnes par an. 18

30 BIBLIOGRAPHIE DISTRIBUTION, CHIMIE ET TOXICITÉ DU CHROME 2.3. Les sites pollués La contamination des sols existait bien avant l ère industrielle. Les catastrophes naturelles, comme les éruptions volcaniques, les inondations, les incendies de forêt, de même que les phénomènes courants, tels l altération atmosphérique, la combustion et l érosion, libèrent des contaminants qui peuvent se répandre dans le sol. Depuis, ce sont principalement les diverses activités humaines, telles que l agriculture, la fabrication, l exploitation minière et l élimination des déchets, qui ont été et sont responsables de la dispersion de grandes quantités de contaminants dans l environnement. On trouve dans le sol des contaminants d origine naturelle, par exemple des métaux, tels que le plomb, le mercure et le cadmium, des éléments radioactifs, tels que l uranium et le radon. L activité humaine est responsable de leur dispersion et/ou de leur concentration en certains sites. D autres contaminants du sol proviennent exclusivement de l activité humaine. Il s agit notamment de composés organiques de synthèse, tels les pesticides, ainsi que du pétrole et de ses sous-produits. A partir du sol, ces substances peuvent aller jusqu à contaminer les aliments, l air ou l eau. La majorité des sols de la planète a été contaminée par les activités humaines, même si le degré de contamination varie d un endroit à un autre. Bien que les sols aient une capacité inhérente d épuration, ce processus d atténuation naturelle est très lent et parfois il ne s agit que d un déplacement de la pollution d un compartiment à l autre de l environnement. Dans la majorité des cas, les anciens sites d enfouissement de déchets dans de nombreux pays industrialisés constituent des installations assez simples où l on superpose des couches de détritus en ne prenant guère de précautions pour empêcher les lixiviats de s infiltrer dans le sol environnant. Au Canada, le ministère de l environnement a dénombré plus de décharges publiques actives, désaffectées ou abandonnées, sans compter les sites d enfouissement privés. Durant le dernier siècle, le développement de l industrie a été exponentiel. Aujourd hui, nous devons assumer cet héritage technologique et ses conséquences environnementales préjudiciables pour l Homme et pour son patrimoine naturel. Il convient aujourd hui d évaluer les risques consécutifs à ce développement technologique de la fin du millénaire et trouver des solutions afin de préserver notre patrimoine naturel pour les générations futures Exemple d une pollution par le chrome : Le site de Joseph Forest Products à Wallowa County, Oregon, Etats Unis Une industrie de traitement du bois, située sur un site de 75 hectares, a été détruit en 1974 par un incendie. Des milliers de litres de produits pour traiter le bois se sont écoulés directement dans le sol. La compagnie fit faillite en 1984 et ne put assumer l assainissement du site demandé par le Département de la qualité de l environnement de l état d Oregon. Des analyses de l EPA (Environmental Protection Agency) 19

31 BIBLIOGRAPHIE DISTRIBUTION, CHIMIE ET TOXICITÉ DU CHROME en 1985 révélèrent de hautes concentrations en arsenic et en chrome dans les sols. De plus, cette contamination avait atteint les nappes phréatiques de la région. Les premières investigations démontrèrent que l eau potable, fournie par une entreprise située près du site, était menacée par la contamination. L EPA décida d excaver plus de mille tonnes de sol fortement contaminé et installa une barrière autour de la zone de traitement, afin d y interdire l accès. Ces mesures assurèrent une qualité de l eau pendant que l EPA dirigeait une analyse de risque et prévoyait un plan de traitement à long terme du site. Le site fut placé sur la NPL (National Priorities List des États Unis) le 31 mars En septembre 1992, l EPA entreprend le traitement du site qui inclut l excavation des terres polluées, la démolition des anciens bâtiments, la mise en décharge du sol pollué et des débris, l élimination des containers de stockage et le suivi de la qualité de l eau. Le traitement du site s est achevé en mai Au total, plus de 6000 tonnes de sol et de débris ont été envoyées en décharge. La qualité de l eau a été suivie encore pendant trois ans. La dernière investigation du site date de septembre 1998 et a confirmé que le site ne présentait plus de risques. Le site a été rayé de la NPL le 4 novembre 1999 (www.epa.gov). 3.Réactivité chimique du chrome dans l environnement 3.1. Etats d oxydation L isotope le plus abondant est le 52 Cr. Comme d autres métaux de transition, le chrome peut exister sous plusieurs formes de valence pouvant aller de 2 à +6. Les formes les plus couramment rencontrées dans les valeurs de ph et de potentiel redox trouvées dans l environnement sont les formes 3+ et 6+ (Cr(III) et Cr(VI)). La forme (III) est considérée comme la forme la plus stable Spéciation Le chrome hexavalent, Cr(VI) Le chrome hexavalent est un puissant oxydant. On le retrouve sous des formes d oxyanions qui sont très solubles dans l eau et qui répondent aux équations suivantes selon le ph (Nieboer et Jusys, 1988): H 2 CrO 4 H + + HCrO 4 - avec Ka 1 = 10-0,6 équation 2 HCrO 4 - H + + CrO 4 2- avec Ka 2 = 10-5,9 équation 3 Les deux équations ci-dessus montrent qu à faibles ph, proche de 0, H 2 CrO 4 est l espèce dominante alors qu entre 0,6 et 6 environ, c est HCrO 4 -. Pour des ph > 6, c est l ion chromate CrO 4 2- qui prévaut. Etant donné qu on ne retrouve pas de ph proche de 0 dans les matrices environnementales, seuls 20

32 BIBLIOGRAPHIE DISTRIBUTION, CHIMIE ET TOXICITÉ DU CHROME HCrO 4 - et CrO 4 2- sont présents dans les systèmes naturels. Au-dessus d une concentration de 10 mm environ (520 mg.l -1 ), on observe la dimérisation du chromate CrO 4 2- en dichromate Cr 2 O 7 2- surtout à de faibles valeurs de ph. 2 CrO H + Cr 2 O H 2 O [Cr 2 O 7 2-]/[CrO 4 2-] 2 [H + ] 2 = 10 14,6 équation 4 équation 5 Dans les conditions généralement rencontrées dans les eaux polluées au chrome, l ion chromate est prédominant. Ainsi pour une concentration en ions CrO - 4 de l ordre de 5 mg.l -1 à ph 7, l équation 5 donne un rapport [Cr 2 O 7 2-]/[CrO 4 -] de 0,04. C est pour cette raison que la chimie de l environnement se limite souvent à l étude de l ion chromate plutôt que l ion dichromate. La solubilité du Cr(VI) dans l eau peut être très importante mais tout dépend du cation auquel il est associé. K 2 CrO 4 (carapataïte) présente une solubilité de 38,96 g.l -1 à 20 C alors que les complexes PbCrO 4, CaCrO 4 et BaCrO 4 présentent des solubilités beaucoup moins importantes de l ordre de 0, g.l -1, 0,2 g.l -1 à 18 C et de g.l -1 à 25 C respectivement. (Pascal, 1957) Le chrome trivalent, Cr(III) Le chrome trivalent est la forme la plus stable mais ayant des propriétés chimiques plus complexes que le chrome hexavalent. Le chrome trivalent a peu d affinité pour l oxygène, c est pour cette raison qu il a tendance à former nombre de complexes avec des ligands organiques ou non. Parmi les ligands suivants OH -, SO 4 2-, CO 3 2-et NO 3 -, seul OH - se complexe de façon significative avec le Cr(III) aux concentrations retrouvées dans l environnement. Dans les conditions environnementales courantes, le Cr(III) se retrouve en solution aqueuse sous forme de Cr 3+, Cr(OH) 2+, Cr(OH) 0 3 et Cr(OH) 4 -. Les formes ioniques donnent une coloration verte aux solutions. La solubilité de la forme solide Cr(OH) 0 3 la plus fréquemment rencontrée aux ph naturels est connue pour être très faible. Certains composés, notamment des composés organiques, peuvent former des complexes avec le chrome trivalent, prévenant ainsi sa précipitation à de faibles valeurs de ph. La spéciation du chrome (VI) et (III) dépend de plusieurs paramètres comme le ph, leur concentration et la disponibilité en ligand. Dans les milieux naturels, le chrome hexavalent est principalement sous la forme de CrO 2-4 et la majeure partie du chrome trivalent est incluse dans des hydroxydes ou dans des complexes avec des ligands organiques. Le comportement du chrome (VI) et (III) et l inter-conversion entre les deux formes peut être mieux comprise si l on considère les propriétés environnementales du chrome. 21

33 BIBLIOGRAPHIE DISTRIBUTION, CHIMIE ET TOXICITÉ DU CHROME 3.3. Réactions et comportement Le chrome est connu pour intervenir dans différentes réactions chimiques et biologiques qui peuvent modifier sa spéciation et par conséquent son comportement dans l environnement. Il peut y avoir oxydation du chrome (III) ou réduction du chrome (VI) Le chrome hexavalent Le chrome hexavalent est un oxydant puissant et peut être facilement réduit en présence d un réducteur selon l équation suivante : HCrO H e - Cr H 2 O ε 0 = + 1,195 V (Handbook, 82 nd Ed, 2001) équation 6 Le Cr (VI), sous forme de chromate, peut oxyder la forme réduite de tous les couples dont le potentiel standard est inférieur à 1,195 V. Par conséquent, la réduction du Cr(VI) peut avoir lieu en condition standard en présence de fer ferreux Fe(II) puisque le potentiel standard du couple Fe 3+ /Fe 2+ est de 0,77 V (Handbook, 82 nd Ed, 2001). La présence de composés soufrés réducteurs ou de matière organique telles que les acides fulviques et humiques augmente la réduction du chrome hexavalent surtout si le taux d oxygène est faible. La réduction peut être aussi photochimique ou biologique. a Réduction par le fer Le fer (II) semble être le plus important des réducteurs possibles du Cr(VI) dans l environnement. Il existe sous forme dissoute comme cations libres ou intégré dans le réseau cristallin de phases minérales comme la magnétite (Fe 2+ 2Fe 3+ O 4 ), la biotite (K(Mg,Fe 2+ ) 3 (Al,Fe 3+ ) Si 3 O 10 (OH,F) 2 ), la pyrite (FeS 2 ), chloritoïde (Fe 2+, Mg, Mn) 2 Al 4 Si 2 O 10 (OH) 4 ). Les études menées sur la réduction du Cr(VI) par le Fe(II) en solution ont montré que, outre les concentrations respectives des deux espèces, le ph et la température influençaient la vitesse de réaction. Les ph pour lesquels on observe des cinétiques de réaction les plus rapides sont compris entre 6 et 8 (Buerge et Hug, 1997 ; Sedlak et Chan, 1997). L élévation de la température permet d augmenter la vitesse de réaction (Sedlak et Chan, 1997 ; Pettine et al., 1998). L oxygène dissous quant à lui ne semble pas entrer en compétition avec le chrome pour l oxydation du fer. La cinétique de réaction entre le chrome (VI) et les ions ferreux est mille fois plus rapide à ph 8 que la réaction entre l O 2 et les ions Fe 2+ (Buerge et Hug, 1997). 22

34 BIBLIOGRAPHIE DISTRIBUTION, CHIMIE ET TOXICITÉ DU CHROME Des études ont été menées sur le pouvoir réducteur de phases minérales porteuses de Fe(II), en particulier la magnétite. Elles ont montré que les ions Fe(II) en superficie du minéral réduisent le Cr(VI) en Cr(III) probablement sous forme de oxy-hydroxyde de chrome, qui forme alors un précipité à la surface de la magnétite. Cette couche «passive» en surface empêche l accessibilité aux autres ions ferreux et limite ainsi la réduction. Pour une biotite contenant 11,7 % en poids de fer ferreux, les études ont montré que ce minéral se dissout en relarguant Fe(II). La réduction du chrome hexavalent a donc lieu en solution (Eary et Rai, 1989). b Réduction par les sulfures Les sulfures sont aussi des candidats potentiels pour la réduction du chrome(vi). Ils peuvent être associés au fer (II) sous forme de sulfures de fer dans la pyrite et dans la mackinawite (Fe 9 S 8 ), ou à d autres métaux dans les minéraux, ou être seuls sous forme d H 2 S. Dans le cas de la mackinawite (Patterson et al., 1997), le minéral se dissout en relarguant des ions Fe 2+ surtout à ph acide. Pettine et al. (1994 et 1998) ont montré que les sulfures peuvent réduire les ions chromate en présence de concentration de l ordre du micromolaire en H 2 S et en milieu anoxique. Ils ont aussi montré que la formation de complexe métal-chrome, le métal pouvant être un cation divalent tel que Mg 2+, Pb 2+, Cu 2+, Cd 2+, Ni 2+ et Mn 2+, augmentait de manière significative la vitesse de réduction du chrome (VI). Cette association métal-chrome permettrait aux chromates de réagir plus rapidement avec les sulfures que s ils étaient libres en solution. La vitesse peut être encore plus rapide en présence de Fe 3+. En effet ces ions peuvent être réduits par les sulfures en Fe 2+ qui peuvent à leur tour réduire le Cr(VI). Dans ce cas, les deux réactions faisant intervenir les sulfures et les ions ferreux et ferriques sont beaucoup plus rapides que la réaction entre les sulfures et le Cr(VI). c Réduction par la matière organique La matière organique naturelle (acides humiques (AH) ou fulviques (AF)) contenue dans les sols ou dans les eaux est également susceptible de réduire le chrome (VI) (Bartlett et Kimble, 1976 ; James et Bartlett, 1983 ; Alloway, 1995). Grâce à leur pouvoir chelatant et leur propriété d oxydo-réduction, les matières humiques constituent un système actif d oxydo-réduction (AH ox /AH red E 0 = 0,7 mv). Les acides fulviques sont de meilleurs réducteurs que les acides humiques parce qu ils sont moins sensibles à l inhibition par le Cr(III) et que leur potentiel standard (0,5 V) est plus faible que celui des acides humiques (Palmer et Wittbrodt, 1991). Il semble que la vitesse de réduction du Cr(VI) par les acides fulviques et humiques soit modifiée par la présence de Fe(III). En fait, en présence de Fe(III), deux phénomènes pourraient se produire : le premier serait la réduction plus rapide du Fe(III) en Fe(II) par les acides humiques. C est le Fe(II) formé qui réduirait le Cr(VI). Le deuxième serait la formation de complexes FeCrO + 4 qui iraient en surface des substances humiques où la réaction de réduction aurait lieu (Palmer et Wittbrodt, 1991). 23

35 BIBLIOGRAPHIE DISTRIBUTION, CHIMIE ET TOXICITÉ DU CHROME d Réduction photochimique Des études récentes (Kleber et Helz, 1992 ; Hug et al., 1997) sur la photo-réduction du Cr(VI) dans les milieux naturels ont montré que le mécanisme était indirect. Le couple Fe(II)/Fe(III) transfère les électrons des ligands organiques vers le Cr(VI). Les complexes Fe(III)-ligands organiques absorbent la lumière ce qui produit du Fe(II). Le Fe(II) réduit le Cr(VI) en Cr(V) puis en Cr(IV) et finalement en Cr(III). A chaque étape, le Fe(II) est réoxydé en Fe(III) qui peut de nouveau aller se complexer avec des ligands organiques et reprendre ainsi le cycle. e Réduction biologique La réduction microbienne du chrome (VI) peut être directe ou indirecte. Des souches bactériennes anaérobies isolées à partir de sols ou de boues fortement chargés en chrome sont capables de le réduire. Il est évident que ce type de bactéries préfère réduire le chrome dans des conditions réductrices. L existence de bactéries capables de réduire le chrome en présence d oxygène permet d envisager la bioréduction comme un mécanisme de résistance au chrome. La réduction directe mettrait en jeu une enzyme dont le gène serait porté par un plasmide et la vitesse de cette réaction serait en relation avec la disponibilité en source de carbone. Cet aspect sera développé au chapitre III de la partie bibliographique Le chrome trivalent Si la réduction du chrome hexavalent est possible dans l environnement dans des conditions réductrices rencontrées dans de nombreux milieux peu oxygénés, l oxydation du chrome (III) est moins courante car elle exige la présence d un couple de potentiel redox plus élevé que celui du couple Cr(VI)/Cr(III). Il est généralement admis que l oxydation du chrome (III) ne se produit pas dans les sols. Toutefois il apparaît qu une fraction du chrome (III) présent dans un sol puisse être oxydée en présence d oxyde de manganèse (Losi et al., 1994). Cependant, les concentrations en Cr 3+ en solution sont quasiment nulles dans les conditions environnementales courantes car le chrome trivalent précipite presque complètement sous forme de Cr(OH) 3 ou de CrOOH, souvent conjointement avec le fer à des ph compris entre 5,5 et 12. Le chrome trivalent ainsi immobilisé physiquement sur la matrice du sol ou bien sédimenté dans les milieux liquides est alors protégé de l oxydation. A des ph inférieurs à 5, Cr(III) est présent sous sa forme cationique et peut s adsorber sur des sites échangeurs de cations. 24

36 BIBLIOGRAPHIE DISTRIBUTION, CHIMIE ET TOXICITÉ DU CHROME Mobilité La mobilité du chrome dans les sols dépend du ph et du potentiel d oxydoréduction qui détermine la spéciation du métal et la capacité d échange cationique (pour le Cr(III)) ou anionique (pour le Cr(VI)), ainsi que de la présence d agents chelatants organiques ou minéraux. Compte tenu de la quasi insolubilité de son hydroxyde Cr(OH) 3 et de son oxy-hydroxyde CrOOH et de la forte capacité de sorption cationique des sols et sédiments, le chrome trivalent est quasiment immobile dans la plupart des milieux naturels, spécialement si ceux-ci contiennent de quantités importantes d argiles. Cependant, dans des milieux oxydants pauvres en matières organiques et où les oxydes de manganèse sont présents en grande quantité, la forme hexavalente du chrome peut-être la plus stable, laquelle est soluble sur une large gamme de ph. Ce sont alors les phénomènes de sorption qui sont prépondérants. La sorption regroupe tous les phénomènes de rétention de soluté à la surface des solides impliquant par exemple des mécanismes d échanges d ions, de complexation de surface et de précipitation de surface. Le phénomène de sorption du chrome sans modification de sa valence existe mais est généralement bien moins important que les phénomènes d oxydo-réduction. Les chromates sont peu adsorbés par les groupements oxy-hydroxydes (de Fe, Al ou Mn) et les surfaces silicatées. L adsorption des chromates augmente avec la diminution du ph parce que les groupements OH notamment deviennent protonnés. La migration des chromates dans les sols est donc favorisée à des ph neutres ou alcalins. Certains ions dans le sol peuvent en outre rentrer en compétition avec les chromates pour les sites d adsorption. C est le cas des sulfates et des carbonates. On peut donc diminuer la sorption du chrome en ajoutant des carbonates (CaCO 3 ) ou bien des sulfates ou des phosphates. Dans ces conditions c est un phénomène de compétition qui s opère entre les anions apportés et les ions chromate. C est sur ce principe qu est fondé l extraction du chrome (VI) échangeable dans les sols pollués. En dépit de quelques exceptions, on peut généraliser le comportement du chrome et ses réactions : - Le phénomène de réduction est beaucoup plus fréquent que le phénomène d adsorption du chrome. - La réduction du Cr(VI) en Cr(III) est beaucoup plus fréquente que l oxydation du Cr(III) en Cr(VI), ce qui fait de la forme trivalente la forme la plus stable dans les écosystèmes. - Le Cr(III) est beaucoup moins mobile que la forme hexavalente dans la plupart des sols et systèmes aquatiques compte tenu de la relative insolubilité du Cr(III) à des ph > 5. Ces caractéristiques sont d une grande importance si l on considère les risques potentiels environnementaux et les stratégies éventuelles de bio-remédiation pour des écosystèmes chargés en chrome d origine naturelle ou le plus souvent d origine anthropique. 25

37 BIBLIOGRAPHIE DISTRIBUTION, CHIMIE ET TOXICITÉ DU CHROME 4.Toxicité du chrome Le chrome hexavalent, de par sa solubilité et sa mobilité, s est retrouvé en interaction avec beaucoup d organismes aquatiques et terrestres sans oublier l Homme Chez les animaux À l état de trace, le chrome est un oligo-élément essentiel pour l Homme et les animaux. Il est associé au métabolisme du glucose par son action sur l insuline et serait aussi impliqué dans le métabolisme des graisses. Le chrome métal Cr est biologiquement inerte. (Mertz, 1993 ; Losi et al., 1994 ; Stoecker, 1996 ; Anderson et al., 1997 ; Davis et Vincent, 1997). Il est admis que c est la forme trivalente qui est la forme nutritionnelle. Les organes où la concentration en chrome est la plus élevée sont le foie, les reins, la rate, les ovaires, les testicules et aussi les os. Le chrome (III) semble exercer un rôle important dans le métabolisme des lipoprotéines plasmatiques et des phospholipides. Il diminue le taux de cholestérol total et le cholestérol LDL (Low Density Lipoprotéine) et augmente le taux de HDL (High Density Lipoprotéine), «le bon cholestérol». La déficience en chrome se traduit par une augmentation de l insuline circulante, du cholestérol du sérum, des triglycérides et de l apolipoprotéine B et par une diminution de la tolérance au glucose. Les recommandations journalières sont de 25 µg par jour pour les femmes et de 33 µg par jour pour les hommes. Pour les enfants, l apport journalier doit être compris entre 10 et 40 µg par jour. Les sources alimentaires sont les fruits, les légumes, la levure de bière, le foie, les champignons et les céréales. La viande rouge, la volaille, le poisson et les laitages en contiennent peu (www.nutrition.org/nutinfo). La forme hexavalente n est pas la source nutritionnelle car elle est très toxique et mutagène. En principe, l Homme et l animal absorbent peu de chrome par inhalation, mais pour l essentiel au travers des aliments et de l eau potable. Les composés chromiques absorbés avec les aliments sont relativement inoffensifs, mais les chromates sont fortement toxiques. La résorption dans le tube intestinal dépend beaucoup de la structure chimique du chrome. Les composés organiques sont absorbés à raison de % et le chrome inorganique à raison de 0,5 % environ. La toxicité du chrome (VI) vient de sa grande facilité à traverser les membranes biologiques et de ses propriétés de puissant oxydant. Une fois à l intérieur de la cellule, le chrome (VI) se lie au glutathion et grâce au soufre présent dans cette molécule, il est réduit en chrome V puis en IV. Le chrome est alors piégé à l intérieur de la cellule. Le chrome réduit peut alors aller se lier à l ADN du noyau et entraîne le pontage entre deux guanines de 2 brins d ADN. Ce pontage empêche le déroulement normal de la réplication. La cellule est bloquée en phase «S» du cycle de la mitose. Le pouvoir carcinogène des composés hexavalents du chrome a été démontré par des expériences sur l animal mais aussi par des études épidémiologiques sur des groupes de population 26

38 BIBLIOGRAPHIE DISTRIBUTION, CHIMIE ET TOXICITÉ DU CHROME exposés en milieu professionnel. Les humains peuvent absorber des composés chromés par inhalation, par contact avec la peau et par ingestion. Ces expositions très fréquemment professionnelles, ont pour conséquence de graves ulcérations et perforations du septum nasal mais peuvent aussi entraîner des cancers de l appareil respiratoire et des allergies cutanées. L ingestion peut provoquer des troubles au niveau des organes stockeurs, surtout les reins, causant des dommages à l ADN qui conduisent à des mutations et à une éventuelle cancérisation. Des concentrations de l ordre de 100 mg.kg -1 de masse corporelle sont létales pour l homme. La DL 50 ou Dose létale pour laquelle 50% des individus meurent est de 32 mg.kg -1 pour la souris en injection intrapéritonéale et de 11 mg.kg -1 pour le lapin en intra-musculaire. Tableau II : Doses létales du chrome (VI) pour différentes espèces animales. (DL) chez l Homme, DL 50 chez le rat et concentrations létales CL 50 chez les organismes aquatiques) Organismes Homme Rat Poisson d eau douce Poisson d eau de mer Daphnie Truite commune et «arc-en-ciel» Poissons (toutes espèces confondues) DL (dose létale) ou CL (concentration létale) DL : 0,5-1 g, voie orale (chromate de K) DL : 6-8 g, voie orale (bichromate de Na) DL 50 : 1,8 g.kg -1, voie orale (chlorure chromique) DL 50 :3,25 g.kg -1, voie orale (nitrate chromique) CL 50 : mg.l -1 (Cr(VI)) CL 50 : mg.l -1 (Cr(VI)) CL 50 : 0,05 mg.l -1 (Cr(VI)) CL 50 : 0,2-0,3 mg.l -1 (Cr(VI)) CL 50 : mg.l -1 (bichromate de Na) Source : Chez les végétaux Le chrome ne semble pas être essentiel à la vie des plantes. Sa toxicité vis-à-vis du règne végétal est rare dans les systèmes naturels. Certaines plantes poussent sur des sites hautement contaminés en chrome. Certains auteurs s accordent à dire qu il n y a pas d absorption du chrome par les végétaux ou seulement une absorption racinaire sans passage vers les autres parties de la plante (Losi et al., 1994). Mais une étude récente a montré que la jacinthe d eau cultivée en milieu riche en chrome hexavalent était capable de le réduire au niveau de ses racines. Le Cr(III) est alors stocké au niveau de celles-ci mais aussi dans d autres tissus comme les feuilles et le pétiole sous forme libre ou compléxée avec des oxalates (Lytle et al., 1998). 27

39 BIBLIOGRAPHIE DISTRIBUTION, CHIMIE ET TOXICITÉ DU CHROME La capacité détoxifiante de cette plante permet d envisager son utilisation pour la phytoremédiation de rivières, marécages ou lagunes pollués au chrome (VI) Chez les micro-organismes Le chrome n est pas un métal essentiel pour la croissance des micro-organismes même si certains auteurs ont affirmé le contraire (Horitsu et al., 1987). A notre connaissance, aucune souche bactérienne sauvage ou mutante n a été décrite comme ayant besoin de chrome pour croître. La présence du métal peut être éventuellement tolérée par les micro-organismes. Dans certains cas, l élément peut-être utilisé comme accepteur final d électron(s) s il s agit de Cr(VI). A de fortes concentrations, le Cr(VI) a des effets toxiques et mutagènes. 10 à 12 mg de Cr(VI) par litre peuvent inhiber le développement de bactéries du sol alors que les mêmes concentrations en chrome (III) n ont aucun effet (Ross et al., 1981). Le chrome a un effet toxique sur les bactéries saprophytes et nitrifiantes, sur les champignons filamenteux, les algues et sur le phytoplancton. Le chrome (VI) altère le matériel cellulaire, le métabolisme et les réactions physiologiques. 28

40 BIBLIOGRAPHIE LES SITES POLLUÉS II. LES SITES POLLUÉS 1.Introduction Dans ce chapitre, nous aborderons dans un premier temps le problème des sites pollués dans son ensemble (inventaire, législation et traitement), puis dans un second temps nous présenterons les sites pollués au chrome et les traitements qui peuvent leur être appliqués. 2.Inventaire des sites pollués en France (Nov 2000) En France, le Ministère de l Aménagement du Territoire et de l Environnement a répertorié 3058 sites industriels pollués (recensés en novembre 2000) (Tableau III). Quatre ans auparavant, le Ministère avait recensé 3 fois moins de sites. Cette augmentation notamment est due au fait qu avant 1996, seuls les sites dont l activité avait cessé étaient répertoriés. Aujourd hui, même les sites en exploitation sont comptabilisés. Les polluants les plus fréquemment rencontrés (seuls ou en mélange) sont présentés dans le Tableau IV. Tableau III : Répartition géographique des sites pollués recensés en France en novembre Régions Nombre de sites Régions Nombre de sites Alsace 135 Languedoc-Roussillon 51 Aquitaine 192 Limousin 19 Auvergne 45 Lorraine 246 Basse Normandie 65 Midi Pyrénées 169 Bourgogne 63 Nord-Pas de Calais 390 Bretagne 49 Pays de Loire 85 Champagne Ardennes 136 Picardie 123 Corse 5 Poitou Charente 54 Franche Comté 71 Provence Alpes Côte d Azur 162 Guadeloupe-Guyane-Martinique 16 Centre 104 Haute Normandie 159 Réunion 13 Ile de France 347 Rhône Alpes 358 Source Ministère de l Aménagement du Territoire et de l Environnement TOM 1 29

41 BIBLIOGRAPHIE LES SITES POLLUÉS Tableau IV: Les 10 principaux polluants des sites pollués répertoriés par le Ministère de l Aménagement du Territoire et de l Environnement (novembre 2000) Polluants % de sites répertoriés Hydrocarbures 24,8 Hydrocarbures aromatiques polycycliques (HAP) 10,9 Plomb 8,7 Zinc 7,7 Solvants halogénés 7,3 Chrome 6,7 Cuivre 6,2 Arsenic 5,1 Nickel 4,3 Cadmium 3,3 Les sites inventoriés peuvent être regroupés en 4 catégories : - les sites traités et libres de toute restriction d usage (7,16 % des sites répertoriés) - les sites traités avec restriction d usage (33,16 % des sites). La pollution est compatible avec l usage actuel mais des précautions sont nécessaires avant d envisager de changer d usage ou de faire des travaux - les sites en activités devant faire l objet d un diagnostic (17,56 % des sites). Pour ces sites, la pollution n est pas avérée mais compte tenu du type d activité passée ou présente, il est nécessaire de réaliser un diagnostic - les sites en cours d évaluation ou de travaux (42,12 % des sites) 3.Réglementation en matière de sites pollués Les définitions d un site pollué données en 2001 par le Ministère de l Aménagement du Territoire et de l Environnement sont les suivantes : Site présentant un risque pérenne, réel ou potentiel, pour la santé humaine ou l'environnement du fait d'une pollution de l'un ou l'autre des milieux, résultant de l'activité actuelle ou ancienne. (http://www.environnement.gouv.fr/) ou Site qui, du fait d anciens dépôts de déchets ou d infiltration de substances polluantes, présente une pollution susceptible de provoquer une nuisance ou un risque pérenne pour les personnes ou l environnement. (http://www.senat.fr) 30

42 BIBLIOGRAPHIE LES SITES POLLUÉS Contrairement à d autres pays, la France ne s est pas doté d un cadre législatif spécifique aux sites pollués. Les seules valeurs limites de concentrations des métaux lourds dans les sols sont spécifiques des sols agricoles destinés à l épandage des boues de station d épuration. Les valeurs sont présentées dans le tableau suivant : Tableau V : Valeurs limites de concentration en métaux dans un sol agricole destiné à l épandage de boues de station d épuration (mg.kg -1 de matières sèches) Cd Cr Cu Hg Ni Pb Zn Norme AFNOR NFU Directive 86/278/CEE , Le cadre français actuel résulte d un ensemble de dispositions législatives : - la loi du 15 juillet 1975 sur les déchets : " toute personne qui produit des déchets de nature à porter atteinte à la santé de l'homme et à l'environnement est tenue d'en assurer l'élimination ". - la loi du 11 juillet 1976 sur les installations classées pour la protection de l'environnement (ICPE). " Les installations pouvant présenter des dangers ou inconvénients... pour la santé (...) ou pour la protection de l'environnement... doivent être autorisées. Cette autorisation est subordonnée à la réalisation d'une étude d'impact qui présente les mesures qui suppriment, limitent et compensent les inconvénients de l'installation... ". D'autres mesures ont été ajoutées par la suite, notamment l'obligation d'information de l'acheteur et de remise en état du site. - la loi du 3 janvier 1992 sur l'eau, qui instaure l'obligation de prévention pour éviter la pollution des eaux superficielles ou souterraines. - la loi du 2 février 1995 sur le renforcement de la protection de la nature, qui instaure le principe de précaution. L approche administrative est fondée sur un ensemble de circulaires adressées aux préfets. (Source : «La circulaire du 3 décembre 1993 énonce les principes de la politique nationale de recherche et de réhabilitation des sites pollués, avec la recherche systématique des sites potentiellement pollués, l'usage de la notion de risque, ou fondement de la démarche, et un traitement adapté à l'impact effectif du site sur l'environnement. La circulaire du 3 avril 1996 pose le principe du recensement des sites potentiellement pollués et des sites industriels en activité. 31

43 BIBLIOGRAPHIE LES SITES POLLUÉS La circulaire du 7 juin 1996 traite des procédures de réhabilitation, et précise les conditions de saisine de l'ademe (dans le cas des " sites orphelins "). La circulaire du 16 mai 1997 concerne les sites pollués par des substances radioactives. La circulaire du 10 décembre 1999 décrit les deux catégories de risques à envisager et les objectifs de la réhabilitation.» Les objectifs de réhabilitation sont choisis en fonction de l usage envisagé du site, c est-à-dire celui auquel le détenteur le destine, et selon les techniques disponibles. Le principal problème est l impact, potentiel ou avéré, sur l Homme ou l environnement de la pollution. Le risque est défini comme la combinaison de trois facteurs : le danger, qui prend en compte la quantité de matière polluante et sa nocivité, le transfert des substances polluantes depuis le site vers la ou les cibles, et les caractéristiques de la (ou des) cible(s). C est une étude spécifique au site qui détermine les objectifs de traitement, celui-ci devant réduire le risque à un niveau jugé acceptable. Elle est menée selon la méthodologie de l évaluation détaillée des risques et prend en compte les cibles suivantes : l Homme et la ressource en eau, qui doivent être protégés en priorité, les écosystèmes et les biens matériels. «Cette méthode d appréciation du risque se distingue de celle de certains pays voisins qui appuient leur politique sur des critères de concentrations dans les sols. (...) au-delà d une teneur donnée d un polluant particulier, le sol est considéré comme pollué. De plus en plus, on observe une évolution de cette approche dans les pays étrangers qui tend à se rapprocher de la démarche française. Les valeurs guides utilisées sont établies à partir d évaluation de risques pour des scénarios d exposition. Etre au-delà d une valeur entraîne une action» d après le rapport du Sénat sur les Effets des métaux lourds sur l environnement et la santé du 12 avril Démarche méthodologique d analyse environnementale 4.1. Évaluation Simplifiée des Risques (ESR) Il s agit non pas d évaluer les risques à proprement parler, mais plutôt de classer les sites en différentes catégories. Un ensemble de 49 paramètres (répartition et mobilité des substances, proximité des nappes, perméabilité des sols...) permet de déterminer si le site doit être banalisé (aucune action particulière), à surveiller ou si le site requiert des investigations complémentaires et plus approfondies Evaluation Détaillée des Risques (EDR) Cette deuxième étape a pour but d évaluer l impact potentiel des substances dangereuses sur les différentes cibles concernées en fonction de l usage actuel et prévisible du site. L EDR permet d identifier les sites qui présentent des risques jugés inacceptables et de définir une stratégie de traitement en vue. 32

44 BIBLIOGRAPHIE LES SITES POLLUÉS Dans tous les cas, il revient aux responsables (exploitant à l origine de la pollution, dernier exploitant, détenteur,...) de faire cesser les dommages générés par ces pollutions, en application de la législation relative aux installations classées pour la protection de l environnement. Pour faciliter les décisions des acquéreurs d anciens sites industriels, l article L de la loi n du 19 juillet 1976 relative aux installations classées pour l'environnement a prévu qu un terrain sur lequel une installation soumise à autorisation a été exploitée ne peut être vendu sans que le vendeur informe par écrit l acheteur de cette exploitation et des dangers ou inconvénients importants qui en résultent ". Lorsque le responsable d un site est défaillant (insolvabilité, disparition, etc...) et que la pollution du site présente un risque pour l environnement et la sécurité des personnes, l Etat peut intervenir pour mettre le site en sécurité. Ces interventions sont financées par la TGAP (Taxe Générale sur les Activités Polluantes) et sont toujours associées à un recours juridique contre le responsable. Enfin, aujourd hui, l arrêt d une activité doit obligatoirement s accompagner d une remise en état du site de manière telle qu il ne présente plus de risques pour la santé publique et l environnement. 5.Traitements des sites pollués : aspects généraux Les techniques de traitement de sites et sols pollués sont souvent complexes et coûteuses, le traitement d un site impliquant presque toujours les mises en œuvres simultanées ou successives de plusieurs procédés. On distingue généralement trois catégories de traitements : Les traitements «in situ» (sans excavation) : Ce type de traitements permet de travailler directement sur le milieu sans procéder à l excavation des terres polluées. Le système de traitement est apporté sur place et différents dispositifs mis en place. Voici ci-dessous, une liste non exhaustive des procédés de traitements applicables in-situ. - extraction des polluants par dégazage sous pression réduite, lavage à l eau... - traitement de la nappe par pompage, épuration en réacteur hors sol et réinjection de l eau épurée, - neutralisation chimique et stabilisation physique des terres en utilisant des liants et divers réactifs, - traitement biologique par injection d air, ou d autres accepteurs d électrons et/ou de nutriments afin de stimuler l activité microbienne. 33

45 BIBLIOGRAPHIE LES SITES POLLUÉS Les traitements sur site, après excavation : C est le dispositif de traitement qui est emmené sur place pour traiter les terres polluées. On peut avoir un confinement sur site par extraction des terres, pose de dispositifs d imperméabilisation et remise en place des terres (éventuellement après traitement). Les traitements hors site par extraction : Les déchets et matières polluées sont emmenés à l extérieur du site. Dans le cas des sols pollués, il s agit d enlever le sol à traiter par excavation, de le transporter hors du site jusqu à un centre spécialisé dans la technique choisie où il sera traité. Le sol peut être ultérieurement ramené et remis en place. Le traitement d un site ne se limite pas aux seules opérations de traitement des terres. Les déchets et/ou ouvrages enfouis ou présents en surface doivent être également traités. D autres actions peuvent s avérer nécessaires comme : - les mesures d urgence pour supprimer les risques immédiats, qui doivent être réalisées sans délai - la mise en place d une surveillance, afin de connaître l évolution du site et des risques d impact - l institution de restrictions d usage - l information sur l état du site. La méthode hors site est souvent la plus coûteuse car elle nécessite l excavation, le transport de quantités parfois considérables de sol et le recours à des centres de traitement spécialisés. Les techniques in situ sont souvent les plus économiques car elles nécessitent la mise en œuvre de moyens beaucoup moins importants concernant la gestion du sol à traiter. Qu elles soient mises en œuvre «in situ», sur site ou «hors site», les techniques de traitement des sites pollués peuvent être classées en cinq familles principales souvent complémentaires : méthodes mécaniques, géochimiques, chimiques/électrochimiques, thermiques et biologiques. 34

46 BIBLIOGRAPHIE LES SITES POLLUÉS 5.1. Méthodes mécaniques Les principales techniques mécaniques mises en œuvre sont : Excavation Cette technique permet d abord d isoler les terres polluées du site afin d éviter la propagation de la pollution. Elle est souvent une étape préliminaire à d autres techniques qui seront ensuite appliquées sur le sol Tri Il peut être granulaire ou gravimétrique. Dans le premier cas, il permet de séparer grossièrement les gros constituants (cailloux, galets...) des plus fines particules du sol qui sont beaucoup plus polluées. Dans le cas où il est gravimétrique, il permet de séparer des particules de plus petite taille (50 µm). Le tri a pour principal but de caractériser la taille des particules et le niveau de contamination de chacune des fractions granulométriques de façon à déterminer le procédé de traitement le plus adapté et de réduire au maximum le volume de terre à traiter Broyage Les particules, une fois séparées et caractérisées, peuvent être broyées mécaniquement afin de réduire leur taille et d homogénéiser le sol si le procédé de traitement qui sera appliqué par la suite le nécessite. Ces techniques mécaniques servent en général à «préparer» la terre pour pouvoir ensuite appliquer d autres techniques Méthodes géochimiques Confinement La technique d encapsulation (ou mise en alvéole) est particulièrement adaptée dans le cas de pollution multi-produits en concentrations très importantes. Elle consiste à isoler physiquement le sol par un dispositif de parois, couvertures ou de fonds étanches. Trois types de confinement peuvent être réalisés : mise en décharge hors site, «mise en tombeau» sur site des terres excavées, et couverture et étanchéification in situ de la zone polluée (sans excavation). La contrainte principale est d éviter la dispersion des polluants. Pour cela, il faut éviter toute infiltration et ruissellement d eau dans la zone polluée. Il faut aussi veiller, dans certains cas, à mettre en place des dispositifs de récupération de lixiviats. 35

47 BIBLIOGRAPHIE LES SITES POLLUÉS Barrières actives Cette technique consiste à disposer verticalement à l aval du site des barrières géochimiques qui imposent des conditions «bio-physico-chimiques» conduisant à immobiliser les polluants qui ont tendance à migrer vers l aval. Il est important de connaître parfaitement le comportement du ou des polluants dans les conditions «bio-physico-chimiques» de la barrière mise en œuvre. Ceci demande une très bonne connaissance des caractéristiques hydrologiques et hydrodynamiques du milieu Technique «Pump and Treat» Un dispositif de pompage (série de piézomètres) est installé en aval de la zone polluée. Le pompage de l eau souterraine polluée crée une zone de dépression autour du point de pompage. La dispersion de la pollution est ainsi fortement réduite. Il faut procéder à un suivi dans le temps afin de s assurer de la qualité de l eau pompée, celle-ci devant être traitée avant réinsertion dans le milieu naturel ou en amont du site Méthodes chimiques et électrochimiques Mobilisation et extraction Le sol pollué est aspergé d une phase liquide qui mobilise les polluants. La phase mobile chargée en polluants est récupérée en aval et peut être réinjectée en amont du site après traitement pour des passages successifs. Il convient de maîtriser le lavage afin d éviter que les polluants ne soient entraînés en dehors de la zone de récupération. Cette technique n est applicable que dans le cas de sols suffisamment perméables Stabilisation / solidification La première méthode consiste à transformer un composé relativement soluble en composé insoluble en lui faisant subir un traitement chimique ou en l adsorbant sur une matrice neutre. La seconde technique consiste à mélanger le matériau pollué à différents adjuvants pour en faire un matériau solide, peu perméable et non réactif. Dans les deux cas, le polluant n est pas détruit mais son impact potentiel sur l environnement est fortement diminué. La méthode la plus utilisée consiste à mélanger le sol pollué à du ciment (liants hydrauliques) afin d obtenir un matériau peu lessivable, stable dans le temps. Le ciment est injecté dans le sol par une série de forages dans la zone polluée. On obtient de la sorte une succession de colonnes cimentées. Cette technique a montré une bonne efficacité dans le piégeage de nombreux métaux lourds. 36

48 BIBLIOGRAPHIE LES SITES POLLUÉS Electromigration Cette technique a pour objectif de concentrer certains métaux par migration entre deux électrodes. Les espèces ioniques vont migrer selon leur charge. Cette technique a été testée pour divers métaux comme le plomb, le cuivre, le chrome, le mercure, le zinc, le fer et l arsenic (Acar et al., 1995) Méthodes thermiques Désorption thermique Cette technologie consiste à chauffer le sol de manière à désorber le polluant (c est-à-dire rompre les liaisons polluant-sol) en le faisant passer en phase gazeuse afin de l extraire. Pour les composés organiques volatils ou semi-volatils, la désorption thermique constitue une option intéressante et moins lourde à mettre en place que l'incinération. Le processus comporte deux étapes : une première unité de volatilisation des polluants de même type que celle réalisée dans l'incinération et une seconde de traitement des gaz extraits. Habituellement réalisée dans un séchoir rotatif ou non, le sol souillé est chauffé et éventuellement remué, et les composés organiques volatilisés sont entraînés par un flux gazeux (air ou azote) vers la seconde unité. La température utilisée est de l'ordre de 250 à 450 C. Le temps de résidence à l'intérieur du séchoir sera modulé en fonction de la quantité de polluants volatils qu'il contient ; il peut varier de quelques dizaines de minutes à plusieurs heures. Le flux gazeux entraîne ensuite les composés volatilisés (entraînement à la vapeur) vers la partie de traitement des gaz composée d'un ou plusieurs condensateurs. Préalablement, le flux de gaz passe dans l'eau où il est en partie refroidi ce qui permet de séparer les particules solides qui auraient pu être entraînées avec lui. Dans le condensateur, les composés organiques sont concentrés en phase liquide par refroidissement, environ 90% des polluants sont arrêtés. Le reste des polluants est adsorbé ensuite sur du charbon actif et le gaz porteur ainsi recyclé est renvoyé vers le séchoir. Les particules solides séparées de l'eau de refroidissement sont réenvoyées dans le séchoir. Ce type de traitement s applique principalement pour les pollutions organiques (Norris et al., 1999) Incinération Cette technique consiste à appliquer de hautes températures pour détruire les produits polluants, qui sont convertis en gaz carbonique et en vapeur d'eau, et en différents autres résidus de la combustion. C'est la méthode la plus efficace pour une gamme très large de produits, surtout pour les produits organiques. Cette technique ne détruit cependant pas les métaux que l on retrouve soit dans les effluents gazeux, lorsqu'ils sont volatilisables, soit dans les résidus solides de la combustion (cendres). Techniquement il existe plusieurs systèmes tels que les dispositifs à lit fluidisé ou à circulation, la technique infrarouge ou 37

49 BIBLIOGRAPHIE LES SITES POLLUÉS encore le four rotatif. Ce dernier est le système le plus commun. Dans une première étape, le sol excavé est séché et tamisé, et éventuellement broyé. Généralement, les éléments les plus grossiers, supérieurs à quelques mm, ne seront pas incinérés mais envoyés en décharge. S'il existe un risque d'évaporation de contaminants volatils, des précautions devront être prises pour récupérer les émanations en opérant, par exemple, dans une enceinte complètement fermée où un système d'aspiration collectera les gaz qui seront ensuite traités. L'incinération est habituellement réalisée en deux étapes: la volatilisation et la destruction. La volatilisation est réalisée dans un four rotatif à une température d'environ 400 C, la destruction à plus de 1000 C. Après avoir été préparé, le matériau placé dans le four rotatif est chauffé et remué. Et les matériaux volatilisés sont entraînés dans un flux d'air. A cette température, tous les polluants présents sont volatilisés et quittent le matériau solide. Le sol, une fois débarrassé de ses produits polluants et sorti du four, pourra être remis en place après refroidissement. Par ailleurs le flux gazeux est entraîné au travers de filtres pour retenir les matières solides fines (poussières) Vitrification La vitrification est une technique d immobilisation des polluants. Des électrodes (torches à plasma) sont placées dans le sol afin de générer un courant qui conduit à une élévation importante de la température. C est en se refroidissant que la vitrification à lieu. La température dans le sol peut atteindre 3000 C ce qui peut conduire à la production de gaz toxiques pendant le procédé. Cette technique peutêtre utilisée pour les polluants organiques mais aussi pour certains métaux comme le cadmium, le mercure et le plomb (Mulligan et al., 2001) Méthodes biologiques Ces techniques consistent à utiliser le potentiel biologique du sol ou à apporter des organismes vivants dans ce sol pour réduire voire éliminer la pollution présente. Les organismes utilisés pour ces procédés, peuvent être des micro-organismes endogènes ou exogènes (isolés pour la plupart dans des sites pollués : sols, boues, sédiments ), ou bien encore des plantes. Dans ce dernier cas on parle de phyto-remédiation. L utilisation des plantes pour traiter un sol pollué est un procédé émergent. Cette technologie est basée sur la capacité des plantes et/ou des micro-organismes associés à leur système racinaire à absorber, retenir et transformer les polluants en substances moins toxiques. Un autre effet benefique des plantes est la réduction de l érosion de surface du sol grâce à la couverture végétale. 38

50 BIBLIOGRAPHIE LES SITES POLLUÉS 6.Traitement des sites pollués au chrome 6.1. Inventaire En France, les sites pollués par du chrome sont répartis de façon inégale sur l hexagone. La plus grande densité se retrouve dans la région Nord-Pas-de-Calais au passé industriel sidérurgique important (Tableau VI). Moins de 3,5 % des sites pollués au chrome ont été traités et «banalisés» (pas de restriction d usage). 35 % d entre eux ont été traités avec restriction d accès, et les autres doivent faire l objet d un diagnostic ou sont en cours d évaluation ou de travaux (Ministère de l Aménagement du Territoire et de l Environnement, 2001). Tableau VI : Répartition géographique des sites pollués au chrome recensés en novembre 2000 Régions Nombre Nombre Régions de sites de sites Alsace 10 Languedoc-Roussillon 4 Aquitaine 14 Limousin 1 Auvergne 5 Lorraine 21 Basse Normandie 5 Midi Pyrénées 13 Bourgogne 3 Nord-Pas de Calais 29 Bretagne 2 Pays de Loire 4 Champagne Ardennes 15 Picardie 20 Corse 2 Poitou Charente 5 Franche Comté 4 Provence Alpes Côte d Azur 5 Guadeloupe Guyane Martinique 1 Centre 11 Haute Normandie 15 Réunion 2 Ile de France 28 Rhône Alpes 6 TOM 0 Source Ministère de l Aménagement du Territoire et de l Environnement Les entreprises générant ce type de pollution sont le plus souvent celles du traitement de surface, du traitement du bois, les fabriques d engrais, de produits chimiques, des ferrochromes et les tanneries. Dans les fiches de la base de données BASOL du Ministère de l Environnement, il est rarement précisé la spéciation du chrome. Lorsqu un site est pollué au chrome il peut l être par la forme trivalente (sous forme de trioxyde de chrome) ou sous forme hexavalente. 39

51 BIBLIOGRAPHIE LES SITES POLLUÉS Les fiches de la base de données BASOL renseignent aussi sur l état du site à savoir s il a été traité, s il est sujet à restriction d usage etc Cependant, peu d information est donnée concernant le traitement exact qui a été appliqué sur certain d entre eux. Le Tableau VII présente les 9 sites pollués par du chrome classés «libres d accès» par le Ministère. Tableau VII : Les 9 sites pollués au chrome classés «libres d accès» par le Ministère de l Aménagement du Territoire et de l Environnement, novembre Lieu (département) Activité Traitement des déchets Traitement des terres polluées Utilisation actuelle du site St LOUBES (33) Ancien centre de stockage et conditionnement de gaz liquéfiés Installations démontées Stationnement de véhicules VILLEUNEUVE SUR LOT (47) Ancienne usine à gaz Incinérations des déchets Stockage des terres en DC2 et traitement thermique Parc de promenade AVRANCHES (50) Usine de production de bandes magnétiques Confinement sur site des boues des lagunes Recouvrement du sol par une couche de béton pour le protéger ST ELLIER DU MAINE (53) Dépôts sauvages OM, DIB, DIS Evacuation des déchets et stockage en DC1 et 2 Recouvrement du sol par une couche de terre Terres agricoles VILLEURBANNE (69) Ancienne usine de traitement de surface Excavation des terres et stockage en décharge de classe 1 EU (76) Ancienne usine de traitement de surface Evacuation des déchets Traitement non spécifié NIORT (79) Ancienne usine de traitement de surface Evacuation et stockage en DC1 Excavation et stockage en DC1 Maison de retraite AILLEVILLIER ET LYAUMONT (70) Ancienne usine de traitement de surface Traitement biologique et stockage en DC1 Nouvel examen à effectuer en cas de changement d usage du site ST GEORGES LES BAILLARGEAUX (86) Décharge d OM Confinement OM : ordures ménagères, DIB : déchets industriels banaux, DIS : déchets industriels spéciaux, DC1 et DC2 : décharge de classe 1 et 2. 40

52 BIBLIOGRAPHIE LES SITES POLLUÉS 6.2. Techniques de traitement Certaines des techniques décrites dans le paragraphe 5 sont applicables aux sols pollués par les métaux lourds et plus particulièrement par le chrome. Traiter la pollution au chrome (VI) in situ apparaît difficile. Cette difficulté réside dans le fait que le chrome sous la forme hexavalente est très mobile. Lors d une pollution avec des ions chromate, il convient de réagir rapidement afin de limiter la dispersion de la pollution. En effet, le chrome (VI) peut être entraîné vers les zones plus profondes d un sol par les eaux de percolation. Les méthodes de confinement apparaissent comme des mesures d urgence si, bien sûr, les volumes considérés sont compatibles avec cette technique. Une fois le sol pollué isolé physiquement des autres compartiments de l environnement, il est possible de le traiter. Deux approches sont alors enviseageables : la première consiste à laver le sol pour récupérer un effluent qui sera chargé en chromates. C est cet effluent liquide qui sera alors traité. La seconde approche consiste à réduire le chrome (VI) dans le sol. Dans ce dernier cas, le sol contiendra encore du chrome mais sous forme trivalente. Sous cette forme, le chrome est très peu mobile et présente une toxicité réduite Extraction du chrome a Lavage du sol Cette technique permet de récupérer les métaux solubles dont le chrome (VI) dans la phase liquide après lavage des terres polluées. On peut utiliser des additifs pour améliorer l extraction comme des bases, des acides, des surfactants, des agents chélatants. Les métaux dont le chrome, contenus dans la solution de lavage, peuvent être récupérés par des procédés electrochimiques, par précipitation ou échange d ions, afin que la solution de lavage soit réutilisée. Il faut s assurer, avant de remettre le sol en place, de l absence de solution de lavage et de ces additifs dans celui-ci (Mulligan et al., 2001). b Extraction thermique Il existe un procédé appelé Cement Lock développé par l Institut of Gas Technology aux Etats Unis qui a été utilisé sur des sédiments contenant 377 mg de Cr(VI).kg -1. Ces sédiments ont été placés dans un réacteur à C pour être fondus, puis refroidis. Le produit est ensuite pulvérisé pour être mélangé à du ciment afin de produire un ciment utilisable en construction. Les gaz issus de ce procédé de traitement sont filtrés pour éliminer les particules qui peuvent contenir des métaux, puis passés sur charbon actif pour retenir les métaux lourds restants (Mulligan et al., 2001). c Electromigration 41

53 BIBLIOGRAPHIE LES SITES POLLUÉS Cette technique consiste à utiliser un courant de faible intensité (1 V/cm) entre une cathode et une anode pour faire migrer des ions et de petites particules chargées. La distance entre les électrodes peut être de plus de 3 m si le gradient de potentiel de 1 V/cm est respecté. Cette technique est applicable à d autres métaux comme le cuivre, le zinc, l arsenic, le cadmium et le nickel (Mulligan et al., 2001). Le Hecho et al. (1998) a décrit une technique qui peut être applicable aux sols pollués au chrome. La méthode consiste à extraire le sol et à l incuber en conditions alcalines afin de limiter l adsorption des anions chromate entre deux électrodes. L agent alcalinisant neutralise les ions H 3 O + à l anode et l hypochlorite qui est ajouté à la cathode migre vers l anode et oxyde le chrome qui se trouve sous la forme trivalente. Les essais en laboratoire ont montré que pour que le rendement du procédé soit intéressant, il faut contrôler les valeurs de ph afin de rester dans la gamme qui favorise la désorption du chrome (VI) (ph supérieur à 8). Le facteur limitant de cette technique est le pouvoir tampon du sol qui, s il est important, limite l efficacité Immobilisation du chrome a Stabilisation Le procédé de stabilisation/solidification conduit à l immobilisation des métaux en incluant les particules de sol auxquels ils sont liés, dans un agent solidifiant. Ces agents peuvent être la chaux, et le ciment. Pour le chrome, la forme hexavalente est réduite avant par ajout d agents réducteurs ou pendant la phase de mélange avec l agent stabilisant. Ensuite, des monomères liquides, qui polymériseront, ou du ciment sont injectés pour solidifier le mélange. Les blocs produits à partir de ces procédés de stabilisation/solidification peuvent être réutilisés dans différents domaines comme remblai. Il conviendra d étudier le relargage des métaux lourds contenus dans des blocs de sol stabilisés en fonction de l usage et des conditions environnementales (scénario) (Mulligan et al., 2001). L ambassade de France en Finlande rapporte sur son site internet (http://www.france.fi) une expérimentation de stabilisation de 4000 tonnes de sol pollué au chrome (ni la concentration ni la spéciation ne sont indiquées). Ce sol a été introduit dans la composition de ciments. Ce procédé ECO-CONCRETE est développé par la société LOHJA RUDUS. b Atténuation naturelle Il existe dans les sols des agents réducteurs qui peuvent transformer le chrome (VI) en chrome (III). Il s agit de la matière organique, des acides humiques et fulviques, des ions Fe 2+ L atténuation naturelle n est pas une technique utilisable seule mais elle peut l être en complément d une autre comme le confinement. En fonction du temps de confinement, des conditions de stockage, la quantité de Cr(VI) dans le sol pourra évoluer et le traitement consécutif au confinement devra tenir compte de l atténuation naturelle qui aura éventuellement eu lieu. c Amendement en matières organiques 42

54 BIBLIOGRAPHIE LES SITES POLLUÉS Losi et al. (1994) ont étudié en laboratoire l influence de la quantité de matières organiques sur la réduction du chrome (VI) dans un sol. Ils ont pour cela ajouté du fumier et irrigué le sol avec une solution contenant 1 mg.l -1 de Cr(VI). Leurs résultats ont montré que si la quantité de fumier est suffisante, la concentration en chrome (VI) de l eau de ruissellement est nulle. Ils ont aussi prouvé que la réduction était beaucoup plus efficace si le sol contenait la microflore indigène. Il semble que deux processus se produisent : d une part, une réduction chimique due à la présence de matières organiques et d autre part une réduction par les bactéries et champignons qui utilisent les matières organiques (source d énergie) pour leur développement. d Techniques de Bio-remédiation La découverte d organismes pouvant utiliser le chrome et le rendre moins toxique à ouvert la voie à la mise au point de procédés de bio-remédiation notamment pour le traitement des effluents liquides. Pour que ces processus biologiques s établissent, les organismes requièrent la présence de sels minéraux en tant que nutriments, de sources de carbone, d azote et de phosphore pour leur métabolisme énergétique. D autres facteurs comme la température, le ph, etc ont une influence sur l efficacité de ces processus. Bio-réduction par les bactéries et les champignons La première étude sur la réduction du chrome (VI) par une culture bactérienne a été écrite en 1977 par Romanenko et Koren'kov. La souche isolée a été classée comme étant un Pseudomonas dechromaticans. Depuis les années 80, les chercheurs se sont intéressés aux nombreuses autres bactéries capables de réduire le chrome hexavalent (Gvozdiak et al., 1986) et proposent des techniques utilisant ces bactéries réductrices de chrome pour le traitement des effluents liquides et plus récemment des sols pollués (Losi et al., 1994 ; Salunkhe et al., 1998). Différents paramètres ont été évalués pour plusieurs types de bactéries pour accélérer le processus afin de développer des techniques efficaces de bio-remédiation exploitant ces micro-organismes. Le principal axe de recherche pour le traitement des effluents pollués est la mise au point de bio-réacteurs où se déroulerait une phase de réduction du Cr(VI) par des bactéries immobilisées sur des surfaces, suivie d une phase de décantation ou de filtration des précipitats de chrome trivalent. Le principal avantage de ce système serait d être moins coûteux et de ne pas nécessiter de réactifs chimiques. L inconvénient majeur est l utilisation d organismes vivants dans des conditions environnementales difficiles (toxicité du chrome présent et des autres polluants). De plus, si l on considère que la réduction doit avoir lieu dans le sol, il faut tenir compte de la complexité de sa matrice et de sa diversité. Il est impossible de prévoir le comportement d une souche bactérienne vivante dans ce type de milieu dont les paramètres sont difficilement maîtrisables (ph, granulométrie, porosité, potentiel redox, taux d oxygène, taux de matières organiques, autres polluants ). La réduction directe du chrome hexavalent par les bactéries représentent un mécanisme naturel 43

55 BIBLIOGRAPHIE LES SITES POLLUÉS potentiellement utilisable pour la détoxification des eaux et sols contaminés par du chrome. Cervantes et al (2001) décrivent, dans une synthèse bibliographique sur les interactions du chrome avec les micro-organismes, des études de laboratoire menées sur des champignons qui ont porté sur leur capacité à réduire le chrome hexavalent. Les résultats suggèrent l utilisation de ces organismes pour des procédés de bio-remédiation des sols pollués au chrome. La phytoremédiation A la différence du cadmium ou du mercure, il y a assez peu d exemples de phytoremédiation de sols pollués par du chrome. Dans leur synthèse bibliographique, Cervantes et al. (2001) décrivent le cas de la jacinthe d eau qui peut accumuler de grandes quantités de chrome. 44

56 BIBLIOGRAPHIE RÉSISTANCE MICROBIENNE AU CHROME ET MÉCANISMES DE RÉDUCTION III. RÉSISTANCE MICROBIENNE AU CHROME ET MÉCANISMES DE RÉDUCTION Dans ce chapitre, nous aborderons le phénomène de résistance au chrome et les mécanismes de réduction du chrome par les micro-organismes. Dans les deux cas, c est du chrome (VI) dont il est question car c est la forme qui est la plus toxique et qui peut être éventuellement réduite. La résistance et la réduction du chrome seront envisagées pour la microflore, terme qui regroupe les bactéries, les moisissures et les levures. Nous avons choisi de traiter séparément les phénomènes de résistance et de réduction du chrome même si ce dernier peut-être un mécanisme de résistance. Mais étant donné que la capacité à réduire le chrome n est pas forcément liée à un phénotype résistant au chrome (Bopp et Ehrlich, 1988), ce phénomène fera l objet d un paragraphe distinct. 1.Résistance au chrome : aspects généraux Avant d aborder plus précisément le phénomène de résistance au chrome, il convient de définir le terme «résistance». La toxicité d un métal pour les micro-organismes est déterminée par sa capacité à inhiber ou perturber la croissance cellulaire. Une souche résistante au métal considéré est capable de croître normalement en présence de ce métal à des concentrations qui seraient toxiques pour les autres micro-organismes. Les termes «résistance» et «tolérance» sont généralement utilisés indifféremment en microbiologie. Lorsque l on dit qu une bactérie tolère tel métal, on peut comprendre qu en dessous d une concentration limite, tout se passe «normalement» (la croissance cellulaire n est pas affectée). En revanche, dans une certaine gamme de concentrations plus élevée, la bactérie pousse (le nombre de colonies sur boîte de Petri ne varie pas comparé à témoin sans métal) mais l aspect des colonies est différent : il peut y avoir changement de couleur, de taille, de morphologie qui traduit une perturbation métabolique. Si dans le premier cas, tolérance et résistance semblent vouloir dire la même chose, dans le second cas, le terme «tolérance» semble plus approprié. Enfin, au-delà d une concentration limite, la croissance devient totalement inhibée. On dira alors que la bactérie ne résiste pas au métal considéré (ou ne le tolère pas) au-delà de cette concentration limite. Plutôt que de parler de résistance dans l absolu, il convient d aborder ce phénomène en considérant les niveaux de concentrations en espèce toxique engendrant une perturbation métabolique. Une bactérie dite sensible pour une concentration de l ordre du mm par exemple peut être résistante à des concentrations de l ordre de la dizaine de µm. En fait la définition de la résistance dépend de la concentration considérée en espèce toxique choisie. Il faut aussi rappeler que la résistance à un métal 45

57 BIBLIOGRAPHIE RÉSISTANCE MICROBIENNE AU CHROME ET MÉCANISMES DE RÉDUCTION dépend de la souche étudiée mais aussi des conditions expérimentales notamment pour les éléments métalliques dont la spéciation chimique dépend des conditions du milieu. En fonction du milieu, le degré ou niveau de résistance varie pour une même souche. Les mécanismes de résistance sont la combinaison de deux processus : l adaptation et la sélection. Le premier processus consiste en des mutations génétiques aléatoires provoquées par la présence de l agent toxique. Celui-ci peut altérer le matériel génétique et seuls les clones dont l altération est bénéfique compte tenu du contexte environnemental survivent. Il est aussi possible que dans une population bactérienne deux types de cellules existent : les résistantes et les sensibles. Dans le cas où l agent toxique est absent, les deux types cellulaires coexistent et lorsqu il est présent à des concentrations inhibitrices, seuls les clones résistants survivent : il s agit du processus de sélection. L adaptation aux agents toxiques se retrouve chez un large nombre d espèces microbiennes terrestres ou aquatiques avec une grande variété de mécanismes y compris la transformation de certaines espèces toxiques (méthylation, déméthylation, oxydation et réduction). Des micro-organismes résistants au chrome ont été isolés à partir d eau de surface, de sédiments ou de sols pollués ou non. Les mécanismes de résistance aux métaux lourds et autres substances toxiques ont un support génétique. La résistance est un phénotype transmissible aux clones issus d une cellule dite «souche». Ce phénotype résistant peut être transféré à une autre bactérie par un contact cytoplasmique que l on appelle conjugaison. Les bactéries sont des organismes procaryotes dont l information génétique est portée par un chromosome, circulaire ou linéaire. Ces bactéries sont parfois porteuses de plasmides, eux aussi pouvant être circulaires ou linéaires. Les moisissures et levures sont quant à elles des organismes eucaryotes. Leur ADN chromosomique peut être composé de plusieurs molécules linéaires confinées dans un noyau. L information génétique responsable de la résistance au chrome peut être chromosomique ou plasmidique. Pour résister au Cr(VI), il existe trois grandes stratégies : empêcher le Cr(VI) d entrer dans la cellule (mutation du système de transport du sulfate), le faire ressortir de la cellule s il y entre (ChrA) ou le réduire en Cr(III). Ce dernier mécanisme sera étudié en détail au 2 de ce chapitre comme nous vous l avons déjà précisé car réduction et résistance ne sont pas systématiquement liées Mutation du système de transport du sulfate Comme nous l avons mentionné au 3.2 du chapitre I, à des ph supérieurs à 6, l espèce dominante du Cr(VI) est sous forme d ions chromate plutôt que dichromates. Aux ph rencontrés dans le monde vivant (proche de 7), l ion chromate est la forme prédominante. C est pour cette raison que l étude de la résistance au chrome hexavalent s est limitée à l étude de la résistance aux chromates. 46

58 BIBLIOGRAPHIE RÉSISTANCE MICROBIENNE AU CHROME ET MÉCANISMES DE RÉDUCTION La résistance aux chromates peut être due à une mutation chromosomique du système de transport du sulfate (Ota et al., 1971). Les ions CrO 2-4 peuvent pénétrer dans les cellules par le même transporteur que les ions SO 2-4 : la sulfate perméase. En effet, les charges des deux ions sont les mêmes et l encombrement stérique de même grandeur. De manière générale, les systèmes de transport sont des ensembles de protéines intégrées dans la membrane de la cellule. Ces protéines se regroupent et s associent de façon à former un pore, sélectif d une ou plusieurs substances, dans la membrane. Si une mutation survient dans un des gènes codant l une des protéines, celle-ci peut présenter par exemple un mauvais repliement qui conduit soit à une mauvaise association des différentes protéines impliquées dans la formation du pore, soit à une mauvaise reconnaissance de la molécule transportée. La protéine peut aussi tout simplement ne plus être exprimée du tout. Chez une cellule sauvage (non résistante), le système de transport du sulfate est fonctionnel. Par conséquent, les ions chromate peuvent pénétrer dans la cellule et perturber suffisamment le métabolisme et l ADN pour provoquer la mort de la cellule. Dans ce cas, la bactérie aura un phénotype sensible. Lorsque que le système de transport du sulfate est muté, les ions sulfate ne peuvent pas pénétrer, pas plus que les ions chromate qui ne peuvent donc pas endommager la cellule. Elle aura dans ce cas un phénotype résistant (Figure 1). Ce mécanisme de résistance a été décrit chez le champignon filamenteux Neurospora crassa (cys) par Marzluf en 1970, chez les levures Saccharomyces cerevisiae (sfp2) (Smith et al., 1995), Candida sp. et Rhodosporidium sp. (Pepi et Baldi, 1992) et chez les bactéries Salmonella thyphimurium (cysa) (Ota, 1971) et Streptomyces coelicolor (cysa) (Lydiate et al., 1988). SO 4 2- CrO 4 2- SO 4 2- CrO 4 2- périplasme Sulfate perméase fonctionnelle membrane interne cytoplasme Bactérie sensible au chrome Action toxique conduisant éventuellement à la mort cellulaire Sulfate perméase mutée Bactérie résistante au chrome Figure 1 : Mécanisme de résistance aux ions CrO 4 2- par mutation du système de transport du sulfate 47

59 BIBLIOGRAPHIE RÉSISTANCE MICROBIENNE AU CHROME ET MÉCANISMES DE RÉDUCTION 1.2. Système d efflux : la protéine ChrA La résistance au chrome chez plusieurs bactéries est liée à la présence d un plasmide (plhb1 chez Pseudomonas fluorescens (Bopp et Ehrlich, 1988), pari180 chez Pseudomonas mendocina (Dhakephalkar et al., 1996), pum505 chez Pseudomonas aeruginosa (Cervantes et Silver, 1992), pmol28 chez Ralstonia metallidurans (ancienne dénomination : Alcaligenes eutrophus)(nies et al., 1990). L analyse de la séquence des plasmides pum505 et pmol28 a révélé un ORF (Open Reading Frame) qui code un polypeptide appelé ChrA. Un ORF ou cadre de lecture ouvert est une séquence d ADN susceptible de coder une protéine ou un polypeptide (nombre de triplets (codons) suffisant, présence de la séquence de reconnaissance des ribosomes, présence de codons d initiation et de terminaison). La séquence d ADN a permis de déduire la séquence protéique. L étude de celle-ci a montré 29 % d identité entre les deux protéines ChrA déduites des séquences situées sur pum505 et pmol28. L expression de la protéine hydrophobe ChrA chez Escherichia coli n a pas conféré le phénotype résistant à l hôte mais a néanmoins montré que ChrA était localisée dans la membrane interne. Compte tenu de la composition en acides aminés et des expériences de fusions traductionnelles avec phoa (gène codant la phosphatase alcaline) et lacz (gène codant la β-galactosidase), Nies et al. (1998) proposent un modèle topologique de la protéine ChrA de R. metallidurans avec 10 passages trans-membranaires. Les expériences de fusions traductionnelles consistent à fusionner le gène phoa ou lacz en amont du codon initiateur du gène chra après X nucléotides (X devant être obligatoirement un multiple de 3 afin de respecter le cadre de lecture). De cette façon, le début du gène chra est traduit et à sa suite, le gène phoa ou lacz dans son intégralité. La protéine hybride obtenue, composée de la partie N-terminale de ChrA et de PhoA ou LacZ en C-terminal va aller s insérer dans la membrane et l activité phosphatase alcaline ou β- galactosidase va être mesurée. En fonction de la présence ou non de l activité, il est possible de déterminer la position de l acide aminé à la jonction de la fusion. Si une activité enzymatique phosphatase alcaline est mesurée, c est que la protéine PhoA se trouve du côté extérieur de la membrane (puisque l enzyme a accès à son substrat). Dans le cas inverse, la protéine est à l intérieur de la cellule, côté cytoplasmique, ainsi que l acide aminé de la protéine ChrA qui la précède. Pour LacZ, c est l inverse : une forte activité β- galactosidase signifie que LacZ est du côté cytoplasmique car le substrat entre dans la cellule. En réalisant des fusions traductionnelles à différents endroits du gène chra, il est possible de déterminer quels acides aminés sont dans le cytoplasme et lesquels sont dans le périplasme. Cette technique apporte des informations importantes mais fait abstraction du rôle éventuel joué par la partie C-terminale dans la topologie entière de la protéine considérée. De plus, les expériences de fusions traductionnelles ont été réalisées avec le gène chra de Ralstonia et exprimées chez un autre micro-organisme : Escherichia coli. Le fait d utiliser un autre micro-organisme pour l expression de la protéine peut introduire un biais, d autant que 48

60 BIBLIOGRAPHIE RÉSISTANCE MICROBIENNE AU CHROME ET MÉCANISMES DE RÉDUCTION l expression de la protéine ChrA intacte (c est-à-dire non fusionnée avec PhoA ou LacZ) chez Escherichia coli ne confère pas le phénotype résistant au chrome. Des homologues de la protéine ChrA ont été recherchés dans les banques de données chez d autres organismes. Seulement 9 protéines présentent une homologie significative avec ChrA de Ralstonia et de Pseudomonas (Tableau VIII). Nous remarquons que les protéines dont la longueur est d environ 400 acides aminés possèdent deux domaines CHR alors que chez les deux dernières souches, il y a deux protéines chacune d environ 200 acides aminés (aa). La séquence consensus de 177 aa (CHR) du transporteur de chromate a été recherchée. Les membres de cette famille sont probablement des transporteurs du chromate et possèdent une ou deux copies de ce domaine. Une comparaison des 9 séquences avec la séquence consensus est présentée en annexe page 214). Nous remarquons qu il y a environ 50 % d identité entre la séquence consensus et les 7 premières séquences, ce qui est relativement important. Les séquences de Borrelia ne présentent que 38 % environ d identité. Ce résultat peut paraître faible mais, si on le compare au pourcentage d identité de la séquence consensus et de la séquence du deuxième domaine (C-terminal), on remarque qu il est plus important. En effet, les deuxièmes domaines CHR de R. metallidurans, de P. aeruginosa, de Synechoccus sp, de Synechocystis sp et de Methanococcus ne présentent qu entre 23 et 32 % d identité avec la séquence consensus. Aucun rôle n est pour l instant établi pour ces homologues sauf pour SrpC qui jouerait un rôle dans le transport du sulfate chez Synechococcus sp. La composition en acides aminés et le profil hydropathique (profil rendant compte des zones de la protéine présentant un certaine hydrophobicité susceptible d être des passages transmembranaires) de ChrA sont similaires, sans pour autant présenter une identité, à ceux de ArsB, protéine de la membrane interne qui permet d expulser l arsénite des cellules et qui confère donc un phénotype de résistance à l arsénite (Alvarez et al., 1999). Il apparaît donc que ChrA serait une protéine d efflux de la membrane qui permettrait de relarguer à l extérieur les ions chromate. Des expériences récentes sur Pseudomonas aeruginosa (Alvarez et al., 1999) ont montré que des vésicules formées à partir de cellules résistantes exprimant ChrA transportent plus de chromates que les vésicules formées à partir de cellules sensibles ne portant pas le gène chra. Cet efflux d ions chromate par ChrA est inhibé par la présence d ions sulfate suggérant que la protéine ChrA reconnaisse aussi SO 2-4 et qu en excès le sulfate entre en compétition avec le chromate. D après Alvarez et al. (1999), la protéine ChrA expulserait les ions chromate en utilisant comme source d énergie le potentiel de membrane. L ajout de nigericine, un agent découplant qui rend la membrane perméable aux protons, diminue fortement le transport des chromates. L absence de NADH qui conduit aussi à une diminution du transport des ions CrO 2-4 suggèrent que le gradient de protons à travers la membrane soit requis pour la translocation des chromates. Le système de relarguage des ions arsenite fait aussi intervenir une protéine membranaire, 49

61 BIBLIOGRAPHIE RÉSISTANCE MICROBIENNE AU CHROME ET MÉCANISMES DE RÉDUCTION ArsB, qui expulserait les anions soit en partenariat avec une ATPase (ArsA) ou soit seule grâce à de l énergie électrochimique (potentiel de membrane). La protéine ArsB peut fonctionner, dans les bactéries dépourvues du gène arsa comme Staphylococcus aureus (Ji et Silver, 1992 ; Silver, 1996), comme transporteur d efflux des ions arsénite chimio-osmotique. La similarité du profil hydropathique entre ChrA et ArsB et l implication du potentiel de membrane dans la translocation des chromates et des ions arsénite suggèrent que le mécanisme d efflux de ChrA soit comparable à celui de ArsB. En revanche l implication d un partenaire ayant une fonction ATPase dans le système d efflux des chromates n est pas envisager par les auteurs (Alvarez et al., 1999). Tableau VIII : Les protéines de la famille CHR N accession Longueur Nombre de abréviation sources GENBANK amino-acides domaines CHR AAA88432 ChrA (Pae) Chromate resistance Pseudomonas aeruginosa CAC42411 ChrA (Aeu) protein A Ralstonia metallidurans Q55027 SrpC (Ssp) Synechococcus sp. PCC BAA18657 Orf 1 (Ssp) Synechocystis sp PCC Q58128 Orf1 (Mja) Methanococcus jannaschii CAB07797 Orf1 (Bsu) homologues ChrA Bacillus subtilis CAB07796 Orf2 (Bsu) Bacillus subtilis AAC66823 OrfBB0452 Borrelia burgdorferi AAC66817 OrfBB0451 Borrelia burgdorferi L expression de la protéine ChrA chez R. metallidurans est régulée par la présence des ions chromate et sulfates (Peitzsch et al., 1998). La souche de Ralstonia utilisée pour cette expérience dans ces travaux présente la capacité de réduire le Cr(VI) en Cr(III) plus efficacement en présence de 30 µm de sulfate qu en présence de 3 mm. Les cellules possèdent le gène chra et le système de transport du sulfate fonctionnel, les ions chromate et sulfate peuvent donc pénétrer à l intérieur de la cellule. Si la cellule ne dispose que de 30 µm de sulfate dans le milieu, les chromates passent la membrane et sont réduits en Cr(III). Dans ce cas, l expression de chra n est pas induite. Si l on apporte beaucoup plus de sulfate (3 mm), les ions chromate et sulfate entrent dans la cellule mais le sulfate semble inhiber la réduction des chromates. Par conséquent, il y aurait davantage de chrome (VI) dans la cellule ce qui induirait la production de ChrA. 50

62 BIBLIOGRAPHIE RÉSISTANCE MICROBIENNE AU CHROME ET MÉCANISMES DE RÉDUCTION L expression de la protéine ChrA permet d expulser le Cr(VI) toxique présent dans les cellules. Chez Ralstonia metallidurans il semble que le premier mécanisme pour lutter contre la toxicité du chrome est de le réduire en sa forme trivalente. Lorsque, compte tenu des conditions environnementales (hautes concentrations en chromate et/ou sulfate), la quantité de Cr(VI) à l intérieur de la cellule devient toxique, l expression de ChrA est induite et la protéine permet de relarguer vers l extérieur les ions chromate (Figure 2). < à 30µM SO 4 2- CrO 4 2- périplasme Sulfate perméase fonctionnelle membrane interne cytoplasme SO 4 2- CrO 4 2- réduction Cr(III) Non toxique ADN du gène chra non induit > à 3 mm SO 4 2- CrO 4 2- CrO 4 2- périplasme membrane interne Sulfate perméase fonctionnelle ChrA cytoplasme SO 4 2- CrO 4 2- Inhibition de la réduction de CrO 4 2- Induction de la synthèse de ChrA ADN du gène chra Protéine ChrA TRANSCRIPTION TRADUCTION ARNm de chra Figure 2 : Mécanismes de résistance aux ions CrO 4 2- par réduction et par la protéine ChrA chez Ralstonia metallidurans 51

63 BIBLIOGRAPHIE RÉSISTANCE MICROBIENNE AU CHROME ET MÉCANISMES DE RÉDUCTION 2.Réduction du Cr(VI) par les bactéries 2.1. Introduction Dans ce paragraphe, nous nous intéresserons plus particulièrement aux phénomènes de réduction bactérienne du chrome (VI) en abordant les mécanismes de réduction et leur utilisation potentielle dans des procédés de traitement de sols ou d effluents pollués au chrome (VI). Nous avons choisi de ne pas inclure la réduction du chrome dans la présentation des mécanismes de résistance au chrome car des bactéries sensibles à une certaine concentration en ions chromate peuvent néanmoins les réduire. Bopp et Ehrlich (1988) ont montré qu une culture de la souche L303 de Pseudomonas fluorescens, Chr S car dépourvue du plasmide conférant la résistance au chrome, pouvait réduire le chrome en aérobiose (0,2 mm), après une nuit d incubation sans chrome, à la même vitesse que les cellules provenant d une culture de la souche LB300 Chr R ayant subi le même traitement. Cette expérience prouve donc que résistance au chrome et réduction du chrome ne sont pas nécessairement en relation l une avec l autre. Une souche qui réduit le chrome (VI) n est pas systématiquement résistante. Si les déterminants génétiques de la résistance au chrome (gènes du système de transport du sulfate et gène de protéine d efflux ChrA) sont assez bien connus, ceux de la réduction le sont beaucoup moins. Certains auteurs pensent que le déterminant est porté par un plasmide. Ce serait le cas pour Pseudomonas mendocina MCM B-180 (Dhakephalkar et al., 1996). Si les déterminants sont assez peu connus c est aussi parce que les mécanismes de réduction du chrome sont nombreux et très diversifiés. Il existe tout d abord le cas particulier des bactéries sulfato-réductrices (BSR) qui réduisent le chrome (VI) avec de l H 2 S en condition anaérobie. C est un processus que l on appelle indirect car c est le métabolite, produit par les bactéries, qui réduit le chrome. Ensuite, chez d autres micro-organismes, il existe la réduction du chrome dite directe car effectuée grâce à des protéines (solubles ou membranaires). Cette réduction peut s effectuer en présence ou en absence d oxygène. Ce type de réduction est aussi appelé réduction enzymatique. Les réactions chimiques dans les systèmes biologiques se déroulent rarement sans catalyseur. Ces catalyseurs sont des macromolécules que l on appelle enzymes. Celles-ci contiennent une fraction protéique que l on appelle apo-enzyme et une fraction minérale et/ou organique qui s appelle co-enzyme. Ce co-enzyme peut être un ion métallique (Fe, Mn, Mg, Cu ) ou une molécule plus complexe comme le NAD par exemple. Mais ce co-enzyme peut aussi être une protéine qui contient elle-même éventuellement un ou plusieurs ions métalliques. C est à ce titre que les cytochromes sont parfois appelés enzymes plutôt que coenzymes. 52

64 BIBLIOGRAPHIE RÉSISTANCE MICROBIENNE AU CHROME ET MÉCANISMES DE RÉDUCTION Même si les déterminants génétiques et les mécanismes de réduction du chrome (VI) sont encore mal connus, ils font l objet de nombreux travaux dans un objectif de recherche fondamentale ou d utilisation de ces bactéries dans des procédés de traitement de sols et d effluents pollués au chrome Cas particulier des bactéries sulfato-réductrices Cycle du soufre La réduction du sulfate (SO 4 2-) en sulfite (SO 3 2-), lui-même réduit en soufre (S 0 ), puis en sulfure (S 2- ) peut servir au métabolisme de synthèse. Dans ce cas il s agit de la réduction assimilatrice. Si par contre le sulfate, le sulfite ou le soufre servent d accepteurs d électrons dans des réactions d oxydo-réduction génératrices d énergie, on parle de réduction dissimilatrice (Figure 3). Les bactéries sulfo- ou sulfatoréductrices sont capables de catalyser la réaction suivante (grâce à une hydrogénase et à des cytochromes) : SO H 2 H 2 S + 4 H 2 O équation 7 Les électrons sont transportés dans la chaîne respiratoire et par l intermédiaire du cytochrome c3 et vraisemblablement transférés à une ferrodoxine qui transforme le sulfate en sulfure qui, en milieu acide donne de l H 2 S. Aérobiose Oxydation dissimilatrice du soufre S 0 Oxydation chimique ou biologique Réduction assimilatrice S 2- S or ganiq ue Sulfat e Thiosulfate... Sulf ur e H 2 S Réduction dissimilatrice S 0 dégradation Réduction assimilatrice S 2- S or ganiq ue Anaérobiose Phot osynt hèse S 0 Photosynthèse Figure 3 : Cycle du soufre chez les bactéries (d après Le Faou et al., 1990) 53

65 BIBLIOGRAPHIE RÉSISTANCE MICROBIENNE AU CHROME ET MÉCANISMES DE RÉDUCTION Réduction indirecte du Cr(VI) chez les bactéries sulfato-réductrices (BSR) La réduction dissimilatrice du sulfate par les bactéries sulfato-réductrices en anaérobiose conduit à la formation d H 2 S. Cette molécule peut réduire le chrome (VI) en chrome (III). Losi et al. (1994) rapportent que la réduction microbienne via la production d H 2 S a été testée en bio-réacteur expérimental utilisant des bactéries sulfato-réductrices d origine marine pour réduire la concentration en chrome (VI) d un effluent Réduction enzymatique du chrome (VI) par les BSR Cette réduction enzymatique, en conditions naturelles, ne représente qu un faible pourcentage du phénomène global de réduction du chrome qui est principalement dû à la production d hydrogène sulfuré. Chez ces bactéries, l hydrogénase permet d oxyder H 2 en H + et les électrons cédés par l hydrogène sont transférés au cytochrome c3 qui les cède alors au chrome (VI) au lieu de réduire le sulfite (Figure 4). Lovley et Phillips (1994) ont déterminé que le transporteur d électrons est le cytochrome c3 en utilisant la fraction soluble des extraits cellulaires de Desulfovibrio vulgaris. En enlevant le cytochrome c3 de la fraction soluble par utilisation d une colonne échangeuse de cations, l activité chromate réductase est perdue. Si l on ajoute le cytochrome c3 au mélange, on restaure l activité. Si l on enlève un des partenaires de la voie de réduction du sulfite c est-à-dire l hydrogénase et/ou l hydrogène, la réduction du chrome n est plus possible. Les auteurs ont également montré que la fraction membranaire récupérée en parallèle de la fraction soluble présentait aussi une activité chromate réductase non négligeable (environ 70 % de réduction en 1 heure, [Cr(VI)] ini = 500 µm) mais les protéines mises en jeu n ont pas été étudiées. Une équipe de chercheurs a démontré récemment (Michel et al., 2001) que le cytochrome c3 qui transporte les électrons de l hydrogène vers le sulfite (Figure 4) pourrait être impliqué directement dans la réduction des chromates. Cette étude a été réalisée avec le cytochrome c3 purifié de Desulfomicrobium norvegicum. D autres enzymes, cytochromes de type c et hydrogénases de bactéries sulfato-réductrices comme Desulfovibrio vulgaris ATCC29579 ont une activité chromate réductase (Lovley et Phillips, 1994 ; Michel et al., 2000). Les auteurs suggèrent que la réduction du chrome (VI) mais aussi du Fe(III), du V(V) et du Mn(IV) puissent être catalysés par ces enzymes à condition qu elles possèdent des centres hèmiques de bas potentiel. 54

66 BIBLIOGRAPHIE RÉSISTANCE MICROBIENNE AU CHROME ET MÉCANISMES DE RÉDUCTION 3 H 2 SO e - 6 e - 6 e - 6 e Hydr ogénase Cytochr ome c3 Fer r odoxine - 6 H + S H 2 O Figure 4 : Couplage entre la réaction de l hydrogénase et la réaction du sulfite chez Desulfovibrio gigas (d après Moura et al., 1984) 2.3. Cas des autres bactéries Plusieurs genres de bactéries peuvent réduire le chrome dans différentes conditions. Certaines bactéries fonctionnent sous un mode strictement aérobie ou anaérobie et d autres peuvent effectuer la transformation du chrome (VI) en (III) dans les deux conditions (Tableau IX). Les premières recherches sur les bactéries pouvant réduire le chrome (VI) en chrome (III) datent de la fin des années 70 (Romanenko et Korenkov, 1977). Cette équipe avait isolé, à partir de boues polluées, une bactérie du genre Pseudomonas. Depuis, d autres genres bactériens ont été isolés de sols pollués ou non comme Microccocus, Escherichia, Enterobacter, Bacillus, Aeromonas, Achromobacter (Tableau IX). Lors des premières études sur le phénomène de bio-réduction du chrome en milieu liquide, sa transformation était suivie par disparition de la coloration jaune des ions chromate en solution aqueuse. Récemment, la corrélation entre la disparition de la forme (VI) et l apparition de la forme (III) vient d être faite pour une souche d Escherichia coli, un isolat CRB5 de Pseudomonas (McLean et Beveridge, 2000) et chez les souches Streptomyces thermocarboxydus NH50 et Pseudomonas fluorescens LB300 (Desjardin et al., 2002). 55

67 BIBLIOGRAPHIE RÉSISTANCE MICROBIENNE AU CHROME ET MÉCANISMES DE RÉDUCTION Tableau IX : Réduction du Cr(VI) par différentes bactéries. (D après Wang et Chen, 1995) organismes condition références Achromobacter eurydice Anaérobie Gvozdyak et al., 1986 Aeromonas dechromatica Anaérobie Kvasnikov et al., 1988 (a) Agrobacterium radiobacter Aérobie Llovera et al., 1993 Bacillus cereus Anaérobie Gvozdyak et al., 1986 Bacillus sp Aérobie Wang et Xiao, 1995 Bacillus subtilis Anaérobie Gvozdyak et al Desulfovibrio vulgaris ATCC Anaérobie Lovley and Phillips, 1994 Enterobacter cloacae Anaérobie Ohtake et al., 1990 Escherichia coli Anaérobie Kvasnikov et al., 1988 (b) Escherichia E. coli ATCC Aérobie et Anaérobie Shen et Wang, 1993 Micrococcus roseus Anaérobie Gvozdyak et al., 1986 Pseudomonas aeruginosa Anaérobie Gvozdyak et al., 1986 Pseudomonas dechromaticans Anaérobie Romanenko et Korenkov, 1977 Pseudomonas chromatophila Anaérobie Lebedeva et Lyalikova, 1979 Pseudomonas mendocina Aérobie Dhakephalkar et al., 1996 Pseudomonas ambigua G-1 Aérobie Horitsu et al., 1987 Pseudomonas fluorescens LB300 Aérobie et Anaérobie Bopp et Ehrlich, 1988 Pseudomonas putida PRS 2000 Aérobie Ishibashi et al., Mécanismes biochimiques La réduction directe du chrome (VI) peut se dérouler en anaérobiose ou en aérobiose. Dans le premier cas, c est généralement un cytochrome qui est impliqué. En présence d oxygène, l activité enzymatique peut-être soluble ou membranaire. Le caractère enzymatique de la réaction n est pas forcément démontré. Mais le fait que des poisons de la chaîne respiratoire ou qu un traitement thermique diminuent l activité chromate réductase suggèrent fortement l implication de protéines enzymatiques dans la réduction du Cr(VI) pour les bactéries décrites dans ce paragraphe. a En anaérobiose Enterobacter cloacae HO1 est aussi capable de réduire le chrome (VI) de manière enzymatique en absence d oxygène via une protéine associée à la membrane (Wang et al., 1990). Cette protéine se situerait à la surface externe de la membrane interne ce qui signifie que la réduction du chrome se produirait dans le périplasme de cette bactérie. Compte tenu de sa très faible solubilité dans l eau à des ph supérieurs à 5 56

68 BIBLIOGRAPHIE RÉSISTANCE MICROBIENNE AU CHROME ET MÉCANISMES DE RÉDUCTION (Cary, 1982), la forme trivalente du chrome ne peut pas traverser la membrane ce qui protège la cellule. Wang et al. (1990) rapportent que des vésicules préparées à partir de cellules d E. cloacae IAM1615 et d E. coli HB101 sensibles aux ions chromate sont incapables de les réduire aussi efficacement que les vésicules d E. cloacae HO1. Chez ces trois souches, il existe une faible activité chromate réductase dans les fractions périplasmiques et cytoplasmiques que l on peut stimuler par l addition de nicotinamide adénine dinucléotide réduit (NADH). Ces résultats indiqueraient, d après les auteurs, que pour E. cloacae HO1, la réduction serait réalisée principalement dans l espace périplasmique au niveau de la membrane interne. Ainsi les chromates seraient réduits avant de pouvoir être toxiques à l intérieur de la cellule. L existence d une éventuelle réduction du chrome dans le cytoplasme laisse penser que les chromates qui n auraient pas pu être réduits dans le périplasme et qui passeraient la membrane interne, seraient pris en charge et transformés en chrome (III) à l intérieur de la cellule. Les deux souches IAM1615 et HB101 seraient sensibles aux chromates car, étant dépourvues du système de réduction lié à la membrane interne (côté externe) d E. cloacae HO1, une grande quantité de Cr(VI) pénétrerait dans le cytoplasme et ne pourrait pas être pris en charge en totalité par l activité chromate réductase cytoplasmique. Bopp et Ehrlich (1988) ont aussi décrit une activité chromate réductase en condition anaérobie chez Pseudomonas fluorescens LB300. Celle-ci n a pu être observée que dans le cas où la concentration en chromate est très faible (< 50 µg de K 2 CrO 4 ) et si la source de carbone est de l acétate. L explication donnée par les auteurs est que l enzyme qui catalyserait la réaction serait réprimée en présence de glucose en absence d oxygène. Ce type de répression a déjà été observé pour le cytochrome a1 d une souche de Pseudomonas aeruginosa (Clarke et Ornston, 1975). Shen et Wang (1993) ont étudié la réduction du chrome chez Escherichia coli ATCC Cette activité serait associée à la chaîne respiratoire située dans la membrane interne. Mais cette réduction est bien moins importante que celle réalisée en aérobiose et en anaérobiose par la fraction soluble. Deux cytochromes b et d de la chaîne respiratoire permettraient de transférer les électrons nécessaires pour la réduction du chrome (VI) grâce à une enzyme soluble dont l absence conduirait à une perte de l activité chromate réductase. Ce type de mécanisme a déjà été décrit pour la réduction du nitrite chez E. coli K-12 (Abou-Joude et al., 1979). Campos et al. (1995) ont décrit une souche de Bacillus sp. QC1-2 capable de réduire le chrome (VI) en anaérobiose comme en aérobiose. Il semble que chez cette souche, l activité chromate réductase soit une enzyme soluble à NADH. 57

69 BIBLIOGRAPHIE RÉSISTANCE MICROBIENNE AU CHROME ET MÉCANISMES DE RÉDUCTION Plus récemment, la souche Shewanella putrefaciens MR-1 (Myers et al., 2000) a été décrite comme pouvant réduire le chrome (VI) en absence d oxygène. Chez cette bactérie, l activité chromate réductase est associée aux membranes. Les expériences de spectrométrie par résonance paramagnétique des électrons (EPR) ont révélé la présence d un pic correspondant au Cr(V). Ce résultat suggère aux auteurs que la réduction du chrome (VI) chez cette souche se fait par au moins deux étapes dont la première impliquerait le transfert d un électron. L ensemble des souches réduisant le chrome (VI) de manière enzymatique en condition anaérobie est présenté dans le Tableau X. Tableau X : Bactéries réduisant les chromates de manière enzymatique en condition anaérobie Souches Localisation probable de l activité chromate réductase Donneurs d électrons Remarques P. fluorescens LB300 Inhibé par la présence de glucose E. coli ATCC33456 Soluble (périplasmique) majoritaire, participation mineure de la chaîne respiratoire (cytochrome c et d) NADH + réserve endogène Références Bopp et Ehrlich, 1988 Shen et Wang, 1993 E. cloacae HO1 Associée à la membrane NADH Wang et al., 1990 D. vulgaris ATCC Majoritairement soluble mais aussi membranaire Participation du cytochrome c3 hydrogénase et H2 Non inhibée par les sulfates (50 mm) Lovley et Phillips, 1994 Bacillus sp. QC1-2 Soluble NADH Campos et al., 1995 Shewanella putrefaciens MR-1 Associée à la membrane NADH et formate (av. NADPH : pas d activité Cr(VI) réductase) Myers et al., 2000 b En aérobiose Parmi les bactéries capables de réduire le chrome de manière directe en aérobiose, nous retrouvons Pseudomonas fluorescens LB300 et Escherichia coli ATCC33456 déjà étudiées pour le même phénomène mais en absence d oxygène. Chez P. fluorescens, Bopp et Ehrlich (1988) décrivent une activité chromate réductase contenue dans la fraction soluble et qui serait constitutive. Pour cette même souche, une activité chromate réductase avait été détectée en anaérobiose (voir de ce chapitre). Cependant, compte tenu que la ou les protéines n ont pas été identifiées, il est difficile de savoir si l activité chromate réductase en aérobiose et en anaérobiose met en jeu les même enzymes. Chez E. coli ATCC33456, le mécanisme en aérobiose semble identique à celui présenté dans le paragraphe précédent. Tout comme en anaérobiose, la fraction soluble ou la fraction membranaire des souches bactériennes réduisant le chrome en présence d oxygène peuvent être impliquées dans la réduction. 58

70 BIBLIOGRAPHIE RÉSISTANCE MICROBIENNE AU CHROME ET MÉCANISMES DE RÉDUCTION Une culture de la souche Bacillus subtilis 168t +, une bactérie Gram positif, est capable de réduire en totalité 0,5 mm de chrome en 24 heures à 30 C en aérobiose (Garbisu et al., 1998). Les auteurs ont déterminé que la fraction soluble permettait de réduire les chromates. Le donneur d électrons peut être du NADH ou du NADPH (nicotinamide adénine dinucléotide (-phosphate) réduit). Il semble que cette activité enzymatique soit exprimée de manière constitutive et non induite par les chromates. Des cellules pré-cultivées dans un milieu contenant du Cr(VI) ne réduisent en effet pas davantage les chromates que des cellules pré-cultivées en absence de chrome. Ni la croissance, ni la réduction du chrome n est affectée par la présence de nitrate (10 mm). Ces résultats suggèrent aux auteurs que le chrome n est pas réduit par le transport d électron de la voie dissimilatrice mais plutôt par un système de détoxification puisque les nitrates qui peuvent servir d accepteurs d électrons n entrent pas en compétition avec les chromates. Le mécanisme de réduction du chrome chez la souche de B. subtilis 168t+ ressemble à celui observé chez Pseudomonas fluorescens LB300 décrit par Bopp et Ehrlich (1988). Pour cette dernière, la fraction soluble réduit le chrome (VI) en chrome (III) en présence de NADH (NADPH non testé). La fraction membranaire, même additionnée de NADH, ne peut réduire le chrome (VI). La fraction soluble d une souche sensible au chrome dérivée de LB300, par perte du plasmide plhb1 conférant la résistance au chrome (voir 1.2 page 48) réduit les chromates aussi efficacement. L activité chromate réductase semble être, comme dans le cas de Bacillus subtilis 168t +, exprimée de manière constitutive. On retrouve le même mécanisme chez P. putida PRS2000 : le NADH et le NADPH peuvent servir de donneurs d électrons et la réaction n est pas affectée par la présence de sulfates dans le milieu (Ishibashi et al., 1990). Les travaux de recherche réalisés avec cette souche suggèrent aux auteurs l implication d une enzyme dont l activité serait détournée en présence d ions chromate. Le ou les substrats «naturels» de l enzyme n ont pas pu être identifiés mais de toute évidence, les sulfates n interviennent pas. L ensemble des souches réduisant le chrome (VI) de manière directe en condition aérobie est présenté dans le Tableau XI. 59

71 BIBLIOGRAPHIE RÉSISTANCE MICROBIENNE AU CHROME ET MÉCANISMES DE RÉDUCTION Tableau XI : Bactéries réduisant les chromates de manière directe en condition aérobie Souche Localisation probable de l activité chromate réductase Donneurs d électrons Remarques Références B. subtilis Fraction soluble NADH Campos et al., 1995 B. subtilis Fraction soluble NAD(P)H Constitutif Garbisu et al., 1998 P. ambigua G-1 Fraction soluble monomère 25 kda et natif 65 kda NAD(P)H et co facteur endogène Non constitutif Suzuki et al., 1992 P. fluorescens LB300 soluble NADH Constitutif Bopp et Ehrlich, 1988 P. putida PRS2000 soluble NAD(P)H Non inhibée par les sulfates P. putida MK1 Soluble (périplasmique) monomère 20 kda, natif 50 kda E. coli ATCC33456 Soluble majoritaire participation mineure de la chaîne respiratoire NAD(P)H NADH + réserve endogène Inhibition non compétitive par les sulfates R. metallidurans Intérieur cellule? Inhibée par les sulfates Ishibashi et al., 1990 Park et al., 2000 Shen et Wang, 1993 Peitzsch et al., 1998 Streptomyces sp 3M Fraction membranaire NAD(P)H Constitutif Das et Chandra, 1990 Il existe deux souches pour lesquelles le mécanisme a été plus précisément décrit. Il s agit des souches de Pseudomonas ambigua G-1 (Suzuki et al., 1992) et de Pseudomonas putida MK1 (Park et al., 2000). L activité chromate réductase des deux souches est contenue dans la fraction soluble. Chez P. ambigua (Suzuki et al., 1992), l enzyme serait une protéine di ou trimérique de 65 kilodaltons (kda) sous sa forme native et la taille du monomère est de 25 kda. Cette enzyme fonctionne dans une gamme de températures et de ph assez large (40-70 C, optimale : 50 C ; ph 6-9, optimal : 8,6). Cette enzyme permet la réaction de réduction du chrome en présence de NADH ou de NADPH et la réduction de 1 mole CrO 2-4 nécessite l utilisation de 3 moles de NADH qui sont oxydées en NAD +. Certains résultats expérimentaux suggérant aux auteurs que l enzyme réduirait le chrome en au moins deux étapes, une analyse spectrométrique ESR (Electron Spin Resonance) a été entreprise et a permis de mettre en évidence la formation d un intermédiaire : le Cr(V). Les auteurs avaient, pendant la purification de l enzyme réduisant le chrome (VI), détecté un autre pic présentant aussi une activité chromate réductase. Ce pic n a pas pu être purifié mais la taille de la protéine native a pu être déterminée. Cette dernière, sous forme native, a une masse moléculaire de 130 kda et ne présente pas le monomère de 25 kda lorsqu elle est dénaturée. Ce résultat suggère fortement l existence d autres activités chromate réductase chez P. ambigua G-1. Chez P. putida MK1 (Park et al., 2000), c est aussi une protéine di ou trimérique de 50 kda qui serait impliquée. La difficulté à déterminer précisément s il s agit d un dimère ou d un trimère réside dans l existence dans certaines protéines de ponts disulfures intra- ou inter-chaînes. Un trimère de monomères de 25 kda ne migrera pas, sur gel de polyacrylamide, à la même distance qu un monomère de 75 kda. 60

72 BIBLIOGRAPHIE RÉSISTANCE MICROBIENNE AU CHROME ET MÉCANISMES DE RÉDUCTION La multimérisation entraîne une migration non proportionnelle à la taille. Cette enzyme fonctionne avec du NADH ou du NADPH. La séquence N-terminale a été déterminée et a montré que le premier acide aminé n était pas une méthionine. En effet, la séquence codante d un ARNm commence toujours par le codon AUG qui correspond à l ARNt portant une méthionine. Ceci suggère fortement la présence d un peptide signal (qui possède la méthionine en première position) qui est clivé lorsque l enzyme est transloquée du cytoplasme vers le périplasme. L absence de méthionine en première position est un argument en faveur d une enzyme à localisation périplasmique. Suzuki et al. ont déposé, en 1995 dans la base de données GenBank, la séquence du gène codant la chromate réductase chez P. ambigua G-1. Park et al. (2000) ont recherché la séquence de ce gène dans le génome de leur souche et ils n ont pas retrouvé d homologues, indiquant que les deux enzymes décrites sont bien différentes. La protéine déduite de la séquence du gène codant la chromate réductase de P. ambigua G-1 (Suzuki et al., 1992) a été comparée aux bases de données et montré 37 % d identité et 56 et 53 % d homologie avec deux autres protéines codée par les gènes ycnd de Bacillus subtilis et ecd de Pseudomonas putida KT2440 respectivement (Park et al. séquences déposées le 6 septembre 2001). Cette comparaison a été effectuée grâce à BLAST version BLAST disponible sur le site internet (National Center for Biotechnology Information) en utilisant la matrice BLOSUM62. La recherche de domaine (RPS-BLAST 2-2-2) a montré l existence possible dans les 3 protéines d un site nitroréductase utilisant le FMN comme co-facteur (Tableau XII). La séquence des gènes chrr n a montré en revanche aucune homologie. Tableau XII : Protéines homologues à la chromate réductase de Pseudomonas ambigua G-1 souches Gène n accession GENBANK Protéine n accession GENBANK Nb d aa domaine Identité et homologie avec consensus nitroréductase (166 aa) Références Pseudomonas ambigua G-1 chrr D83142 ChrR BAA nitroréductase 41 % identité 56 % homologie Suzuki et al., 1992 Pseudomonas putida KT2440 ecd AF flavoprotéine AAL nitroréductase 33 % identité 48 % homologie Park et al., non publié Bacillus subtilis ycnd AF oxydoréductase AAL nitroréductase 37 % identité 55 % homologie Park et al., non publié Le deuxième type de protéine ayant une activité chromate réductase a été retrouvé chez P. putida KT2440 (Park et al., séquence déposée le 6 septembre 2001). Le gène correspondant a été séquencé et a été appelé chrr. La comparaison de la séquence protéique, effectuée avec BLAST, a permis de trouver deux autres protéines présentant 45 et 96 % d identité chez Escherichia coli AMS6 et Pseudomonas putida MK1 respectivement. Les protéines sont composées de 187 acides aminés en moyenne ce qui représente une masse moléculaire d environ 20 kda (taille du monomère décrit pour P. putida MK1 de Park et al., 2000) (Tableau XIII). La séquence des gènes chrr des 3 souches a été comparée. Celles des deux souches de 61

73 BIBLIOGRAPHIE RÉSISTANCE MICROBIENNE AU CHROME ET MÉCANISMES DE RÉDUCTION Pseudomonas présentent 90 % d identité entre elles ce qui n est pas surprenant compte tenu qu il s agit de la même espèce : putida. La séquence de chrr de P. putida MK1 a été comparée à celle d E. coli AMS6. On retrouve une séquence située au milieu du gène qui présente 79 % d identité dans les deux souches. Cette séquence semble très conservée entre les deux genres bactériens. Les séquences protéiques ont été déduites et présentent 76 % d identité (sur une longueur de 21 acides aminés). Nous avons recherché dans les trois séquences protéiques complètes s il existait un domaine fonctionnel connu (grâce à BLAST sur le site internet et seule la séquence ChrR de E. coli a donné un domaine tronqué NAD(P)H déshydrogénase à co-facteur FAD. La séquence consensus pour ce domaine mesure 174 acides aminés et la séquence du gène de E. coli n a d homologie que sur 46 aa dans la partie N-terminale. La comparaison des séquences des protéines ChrR de deux souches de Pseudomonas ne donne aucun domaine conservé connu. Tableau XIII : Protéines homologues à la chromate réductase de Pseudomonas putida MK1 souches Pseudomonas putida MK1 Pseudomonas putida KT2440 Escherichia coli AMS6 Gène n accession GENBANK chrr AF chrr AF chrr AF Protéine n accession GENBANK Chromate réductase ChrR AAK56852 Chromate réductase ChrR AAK56853 Chromate réductase ChrR AAK62985 Nb d aa domaine Identité et homologie avec consensus partielle NAD(P)H déshydrogénase Références 186 Park et al., non publié 186 Park et al., non publié 188 NAD(P)H déshydrogénase partielle (46/174 aa) 35,5 % identité 55,5 % d homologie sur 46 aa Park et al., non publié Les activités chromate réductases décrites jusqu à présent en aérobiose sont localisées, pour l immense majorité, dans la fraction soluble périplasmique. Il semble, d après Peitzsch et al. (1998), que chez Alcaligenes eutrophus la réduction des chromates pourrait avoir lieu à l intérieur des cellules mais ceci n a pas été démontré. Il existe cependant un cas rapporté d activité réductase aérobie liée à la fraction membranaire. Il s agit de Streptomyces sp 3M. L enzyme utilise le NADH et le NAD(P)H et est constitutive. Ces résultats ont été présentés par Das et Chandra en 1990 mais depuis aucune étude sur cette chromate réductase n a été publiée. 62

74 BIBLIOGRAPHIE RÉSISTANCE MICROBIENNE AU CHROME ET MÉCANISMES DE RÉDUCTION 2.4. Influence de divers paramètres Influence de la concentration en Cr(VI) Comme nous l avons décrit dans ce chapitre 2.3, la réduction directe du chrome (VI) chez les bactéries est le résultat d une réduction enzymatique. La vitesse de la réaction répond à l équation 8 suivante v = Vm. C Ks + C équation 8 avec v, la vitesse de réduction du Cr(VI) en mg.l -1.h -1 ; Vm, la vitesse maximale en mg.l -1.h -1, C, la concentration en Cr(VI) en mg.l -1 au temps t et Ks, la concentration en Cr(VI) pour Vm/2. La concentration en ions chromate dans les milieux de culture peut influer sur la vitesse de réaction car le Cr(VI) est le substrat de la réaction. Lorsque la concentration en Cr(VI) est très inférieure au Ks, alors l équation 8 devient : Vm. C v = Ks équation 9 Dans ce cas, la réaction de réduction est d ordre 1. Pour une concentration cellulaire donnée, la vitesse dépend de la concentration en Cr(VI). Lorsque la concentration en Cr(VI) est très supérieure au Ks alors, l équation 8 peut être simplifiée : Vm v = Ks équation 10 Dans ce cas, la vitesse ne dépend que de Vm qui est en relation directe avec la concentration en cellules vivantes dans le milieu de culture. La vitesse de réduction du chrome sera alors d ordre 0. 63

75 BIBLIOGRAPHIE RÉSISTANCE MICROBIENNE AU CHROME ET MÉCANISMES DE RÉDUCTION Ceci n est valable qu à condition que le Cr(VI) ne joue aucun rôle inhibiteur. Or, les ions chromate ont un effet toxique sur les cellules et les équations 8, 9 et 10 ne prennent pas en compte cet effet. Wang et Shen (1997) proposent l équation suivante pour modéliser la réduction du Cr(VI) par les bactéries qui intègre la notion de toxicité du chrome au cours de la réaction. Vm1. C. X v = Ks + C équation 11 avec X = X 0 C 0 C Rc équation 12 avec Vm 1, la vitesse maximale en mg.l -1.cellule -1 ; X, la concentration en cellules (cellule.l -1 ), X 0 et C 0, les concentrations initiales en cellules et en Cr(VI) respectivement et Rc, la capacité maximale de réduction des cellules (mg de Cr(VI).cellule -1 ). Les auteurs Wang et Shen (1997) ont utilisé l équation 11 pour modéliser la réduction du chrome en culture pure. Leur étude montrent que les cinétiques obtenues à partir du modèle proposé, qui prend en compte l effet du Cr(VI) purement cinétique (ordre de réaction) et l effet physiologique (toxicité), coïncident avec celles obtenues expérimentalement avec E. coli ATCC33456, Bacillus sp, Pseudomonas ambigua G-1, Desulfovibrio vulgaris et P. fluorescens LB300. La réduction du chrome est davantage gouvernée par la capacité maximale de réduction (Rc) des cellules que par la croissance cellulaire elle-même. En effet, chez P. ambigua G-1, en dépit d une croissance cellulaire importante (de 150 à 1550 mg de poids sec.l -1 en 24 heures) la vitesse de réduction du Cr(VI) n augmente pas mais décroît rapidement. Pour une concentration initiale en Cr(VI) de 150 mg.l -1, la vitesse apparente de réduction du chrome pendant les 6 premières heures est de 15,4 mg.l -1.h -1 pour une concentration en cellules qui atteint 650 mg de poids sec bactérien.l -1. Cette vitesse apparente chute à environ 2,8 mg.l -1.h -1 pendant les 6 heures suivantes (pour une concentration cellulaire de 900 mg de poids sec bactérien.l -1 ). Si l on exprimait les vitesses par mg de poids sec bactérien, le ralentissement serait encore plus prononcé. En présence de cellules vivantes, il n est pas possible de dissocier l effet cinétique du chrome de son effet toxique. Si la concentration en Cr(VI) est importante, c est l effet toxique qui prédomine. 64

76 BIBLIOGRAPHIE RÉSISTANCE MICROBIENNE AU CHROME ET MÉCANISMES DE RÉDUCTION Influence du taux d oxygène dissous sur la réduction du chrome (VI) L ion chromate, comme la molécule d oxygène, peut être un accepteur d électrons car la valeur de son potentiel standard est relativement élevée (ε CrO 4 2-/Cr 3+ = 1,350 Volts, ε O 2 /H 2 O = 1,229 V). Parmi les organismes capables de réduire le chrome (VI) à la fois sous conditions aérobie et anaérobie, Escherichia coli ATCC réduit plus vite en absence d oxygène (Shen et Wang, 1995). Les vitesses observées par les auteurs sont de 0,50 mmol de Cr(VI).g -1 (poids sec) de cellules par heure en anaérobiose contre 0,27 mmol.g -1 cellule.h -1 en présence d oxygène. En biochimie, on considère généralement les potentiels standards apparents ε qui sont définis à ph 7 et à 25 C. Dans ces conditions, le couple O 2 /H 2 O a un ε de 0,82 V supérieur à celui de CrO 2-4 /Cr 3+ qui est de 0,56 V (Wang et Shen, 1995). Par conséquent, d un point de vue thermodynamique, l oxygène est un accepteur préférentiel des électrons comparé au chrome (Tableau XIV). Tableau XIV : Comparaison des bilans énergétiques selon que Cr(VI) ou O 2 sont utilisés comme accepteurs d électrons (d après Shen et Wang, 1995) réactions G (kj/ électron tranféré 1 Respiration aérobie C 6 H 12 O O 2 6 CO H 2 O Cr(VI) accepteur d e - de l oxydation C 6 H 12 O CrO H + 6 HCO H 2 O + 8 Cr O 2 accepteur d e - du cytochrome d O H cyt d réduits 2 H 2 O + 4 cyt d + oxydés Cr(VI) accepteur d e - du cytochrome d CrO H cyt d réduits 4 H 2 O + 3 cyt d + oxydés + Cr La réaction 2 du Tableau XIV consomme énormément de protons (plus de 4 moles de protons par mole de Cr(VI)) ce qui conduit à une déplétion en H + dans l espace périplasmique. De ce fait, peu de protons restent disponibles pour rentrer dans la cellule. En présence d O 2, la cellule peut réduire l oxygène ou le chrome (VI) disponible. Compte tenu de l appauvrissement en protons et des bilans énergétiques, la réaction 1 sera favorisée. Il apparaît que le chrome (VI) peut entrer en compétition avec l oxygène lorsque l activité chromate réductase impliquée est liée aux protéines de la chaîne respiratoire. Shen et Wang (1993) ont montré que chez E. coli ATCC33456, la réduction du chrome (VI) ([Cr(VI)] ini = 0,27 mm) par des cellules entières était de 100 % en 7 heures d incubation à 35 C en anaérobiose, d environ 78 % pour une concentration en oxygène de 0,15 mm et de seulement 30 % pour une concentration d O 2 de 0,63 mm. Les auteurs de cette étude ont utilisé la représentation de Lineweaver-Burk pour déterminer la vitesse maximale, Vm et la constante d affinité, Ks. 65

77 BIBLIOGRAPHIE RÉSISTANCE MICROBIENNE AU CHROME ET MÉCANISMES DE RÉDUCTION Par la représentation 1/V = f(1/c) avec C la concentration initiale en Cr(VI), ils ont trouvé une Vm de 0,50 mmol de Cr(VI).g -1 (poids sec) de cellules par heure en anaérobiose contre 0,27 mmol.g -1 cellule.h -1 en présence d oxygène et des Ks de 0,12 et 0,041 mm respectivement. En présence d oxygène, la Vm et le Ks sont modifiés ce qui suggèrent aux auteurs que l oxygène est inhibiteur incompétitif. Cependant une inhibition incompétitive implique un changement de la Vm, du Ks sans modification du rapport Ks/Vm. D après les valeurs données par les auteurs, en absence d oxygène le rapport est de 0,24 et en présence de O 2 il est de 0,15. Des trois types principaux d inhibition présentés dans le Tableau XV, la représentation de Lineweaver-Burk obtenue avec les cinétiques d E. coli ATCC33456 est plus proche d un modèle incompétitif que des modèles compétitif et non compétitif. Dans le modèle incompétitif, l enzyme (E) forme un complexe (ES) avec le substrat (S) mais pas avec (I). Une fois le complexe (ES) formé, il peut se transformer en (E) + (P) ou interagir avec l inhibiteur (I) pour former un complexe (ESI) inactif. Le site de fixation à (I) n est accessible qu une fois le complexe (ES) formé. Il semble donc que le site de fixation du Cr(VI) soit différent de lui de l O 2 car si les sites étaient identiques, l inhibition aurait été de type compétitif. Tableau XV : Types d inhibitions réversibles. Vm Ks Représentation de Lineweaver-Burk Compétitive Vm Ks(1+([I]/Ki)) 1/V [I]2 [I]1 1/Vm -1/Ks [I] = 0 1/C Non compétitive Vm.(1+([I]/Ki)) -1 Ks 1/Vm 2 1/Vm 1 1/Vm 1/V [I]2 [I]1 [I] = 0 1/C -1/Ks 1/V Incompétitive Vm.(1+([I]/Ki)) -1 Ks.(1+([I]/Ki)) -1 1/Vm 2 1/Vm 1 1/Vm -1/Ks -1/Ks 2-1/Ks 1 [I]2 [I]1 [I] = 0 1/C 66

78 BIBLIOGRAPHIE RÉSISTANCE MICROBIENNE AU CHROME ET MÉCANISMES DE RÉDUCTION pH optimum et température optimum La valeur de ces deux paramètres coïncide avec les conditions optimales de croissance des bactéries. Pour Enterobacter cloacae HO1 par exemple, le ph optimal se situe entre 6 et 8,5 pour des températures entre 20 et 40 C ou entre 7 et 7,8 pour des températures comprises entre 30 et 37 C (Komori et al., 1989). Chez E. coli la gamme de ph est plus large : 3 à 8 entre 10 et 45 C avec un maximum à 36 C à un ph de 7 (Wang et Shen, 1995). Une étude en milieu riche contenant du peptone et de l extrait de levure a été réalisée avec Thermophilic bacterium TOR 39. Sa température optimale de croissance est comprise entre 50 C et 70 C. Les auteurs (Zhang et al., 1996) ont montré qu à 75 C, la réduction du chrome (VI) par cette bactérie est un phénomène prédominant par rapport à la réduction abiotique à la même température. Des études ont été menées directement sur les enzymes purifiées. Les enzymes solubles de Pseudomonas putida MK1 (Park et al., 2000) et de P. ambigua G-1 (Suzuki et al., 1992) fonctionnent de façon optimale à 80 C et 50 C respectivement. Les ph optimums sont de 5 pour l enzyme de la première souche et de 8,6 pour celle de P. ambigua G Effet d autres métaux Les études appliquées portant sur la réduction du chrome (VI) par les bactéries ont pour but de les utiliser dans le traitement d effluents ou de sols contaminés. Les pollutions au chrome sont souvent associées à d autres pollutions métalliques. Par conséquent, l influence de la présence de ces métaux a été testée afin d apprécier leurs effets. S il s agit d évaluer l effet sur la réaction enzymatique et non pas l effet toxique du métal considéré sur la croissance bactérienne, les travaux sont réalisés sur des extraits cellulaires. Pour P. putida PRS2000, l argent Ag + et le mercure Hg 2+, à des concentrations de l ordre de 20 µm, sont de forts inhibiteurs de la réduction du chrome. En revanche le Cr 3+, à la concentration de 0,2 mm, n a pas d effet. D autres études ont été menées sur des cellules entières afin d'évaluer la toxicité des métaux sur la croissance des micro-organismes et sur la réduction du chrome. La réduction du chrome chez D. vulgaris n est pas affectée par la présence dans le milieu de culture de Ni 2+, Cu 2+, Mn 2+, Zn 2+ (0,1 mm) (Lovley et Phillips, 1994). La réduction du Cr(VI) par une culture de la souche de Pseudomonas CRB5, isolée d un site pollué au chrome (VI), à l arsenic (V) et au cuivre (II), n est pas affectée (% de réduction après 24 heures) par la présence des deux derniers éléments aux concentrations respectives de 0,8 et 0,6 mm (McLean et Beveridge, 2001). 67

79 BIBLIOGRAPHIE RÉSISTANCE MICROBIENNE AU CHROME ET MÉCANISMES DE RÉDUCTION 3.Application au traitement de solutions ou de sols pollués par du chrome : quelques exemples La réduction du Cr(VI) par les bactéries est un moyen envisagé par les chercheurs pour traiter la pollution aux chromates. Beaucoup d études ont été réalisées en milieu liquide. Il est en effet beaucoup plus facile de maîtriser la composition d un milieu de culture et de mesurer différents paramètres lorsque l on travaille en phase liquide avec du matériel biologique vivant. Tout se complique lorsqu il s agit d utiliser les bactéries dans un milieu plus complexe comme le sol. Il faut prendre en considération les différents échanges matrice-liquide qui peuvent s opérer ainsi que les interactions bactéries-matrice. Pour traiter un effluent ou un sol pollué par une méthode biologique, on peut envisager deux approches : la première consiste à utiliser une culture, pure ou mixte, d organismes endogènes ou exogènes que l on apporte au milieu pollué non stérile (la stérilisation d un sol ou d un effluent à l échelle du terrain n est généralement pas envisageable d un point de vue économique). On parle alors de «bioaugmentation). La seconde approche consiste à stimuler la flore endogène en ajoutant certains nutriments ou en optimisant les conditions d aération. On parle alors de «bio-stimulation». L avantage d utiliser la flore endogène est qu elle est déjà adaptée aux conditions environnementales. En revanche, à mesure que l on traite le sol ou l effluent, la ou les souches d intérêt peuvent entrer en compétition avec celles qui, lorsque la pollution était plus importante, étaient minoritaires. Il en est de même pour la flore exogène que l on apporterait sous forme de culture. Mais le fait de posséder les souches d intérêt en culture pures ou mixtes permet d envisager d enrichir plusieurs fois le milieux en cours de traitement, ce qui est moins facile si l on essaye de stimuler l activité de la flore endogène uniquement Traitements anaérobies Culture mixte exogène/cr(vi) en solution Les bactéries anaérobies réductrices (autres que les bactéries sulfato-réductrices) auraient un avantage au niveau de la croissance sur les bactéries non réductrices grâce à leur capacité à utiliser le Cr(VI) dans la respiration anaérobie. Turick et Apel (1997) ont donc proposé pour le traitement d effluents liquides un bio-procédé anaérobie qui incorpore et maintient une population mixte de bactéries réduisant le chrome (VI) en créant un environnement dans un bio-réacteur qui optimise les conditions pour que cette population mixte soit la population dominante. La culture mixte a été obtenue après enrichissement en condition anaérobie d une suspension de sol pollué. Un réacteur d 1,4 litres contenant 1 L de milieu TSB 68

80 BIBLIOGRAPHIE RÉSISTANCE MICROBIENNE AU CHROME ET MÉCANISMES DE RÉDUCTION (Trypsic Soy Broth, 2,5 % de dextrose) et des selles de Berl de 6 mm en porcelaine est ensemencé par la pré-culture mixte choisie par les auteurs. Les selles de Berl vont être colonisées par la biomasse. Pendant toute la durée de l expérimentation, la température est maintenue à 30 C et la concentration en chrome (VI) à l entrée du réacteur supérieure ou égale à 200 mg.l -1 (4 mm de Cr(VI)) par ajout continu de K 2 CrO 4 (afin de tester l effet de l augmentation de Cr(VI)). Les expériences ont montré qu à la sortie du réacteur (temps de rétention dans le réacteur : 48 h), il n y a plus de Cr(VI). Le Cr est retrouvé sous forme (III) dans le surnageant vraisemblablement compléxé avec les molécules organiques du milieu nutritif TSB ou bien adsorbé sur la membrane des cellules mortes. Le consortium bactérien choisi a une grande capacité à réduire le chrome (VI). Les auteurs ont analysé la population mixte et ont remarqué que la nature du ou des isolats dominants varie en fonction du temps. Dans les 100 premières heures, l isolat dominant est une souche identifiée comme étant certainement un Bacillus sp, puis passé ce temps après lequel les concentrations entrantes en chrome étaient plus importantes, ce sont des souches de Microccocus et Rhodococcus plus résistantes au chrome que Bacillus sp qui constituent la population dominante. Ce réacteur, dans les conditions testées, offre donc l avantage de permettre la réduction de concentrations importantes de chrome (VI) et d avoir un système bactérien qui s adapte aux concentrations variables en chrome. Turick et al. (1997) ont tenté d augmenter le rendement du réacteur. Pour cela un autre réacteur d 1,9 litres contenant 0,750 L de milieu liquide a été utilisé, les selles de Berl en porcelaine ont été remplacées par des billes BioSep dont la porosité est beaucoup plus importante. La surface de contact développée est plus grande et permet une colonisation plus importante. Le temps de rétention est de 12 h (contre 48 h dans l expérience précédente) et la température est maintenue à 30 C. Dans ces conditions, la vitesse de réduction est 65 fois plus importante qu avec les selles de Berl et atteint 260 mg.l -1.h -1. La population mixte sélectionnée et le garnissage du réacteur semblent adaptés pour réduire efficacement le Cr(VI). Cette population mixte dans des essais en batch avec comme source de carbone du sucrose présente la même efficacité de réduction qu en milieu TSB (où la source de carbone est du dextrose) ce qui permet d envisager d utiliser de la molasse peu onéreuse pour alimenter le réacteur en carbone. Pour confirmer l efficacité de ce consortium bactérien en présence d autres organismes pouvant provenir de l effluent à traiter, des expériences complémentaires devraient être entreprises en alimentant le réacteur avec un effluent chromé non stérile, pouvant provenir du lavage d un sol, complémenté par une source de carbone. 69

81 BIBLIOGRAPHIE RÉSISTANCE MICROBIENNE AU CHROME ET MÉCANISMES DE RÉDUCTION Culture mixte + Escherichia coli ATCC33456/Cr(VI) en solution Chirwa et Wang (2000) ont étudié simultanément la réduction du chrome (VI) et la dégradation du phénol qui peut être un co-polluant. Ils ont mélangé des organismes anaérobies dégradant le phénol à la souche E. coli ATCC Les essais ont été réalisés en batch dans des tubes de 75 ml à 35 C à l obscurité. La culture mixte anaérobie dégrade le phénol mais ne réduit pas le chrome. E. coli ne dégrade pas le phénol mais peut réduire le chrome en anaérobiose (voir a de ce chapitre page 56). Cette étude a montré que E.coli ATCC33456 utilisait les métabolites résultant de la dégradation du phénol par les bactéries anaérobies ([Phénol] ini = 200 mg.l -1 ), comme donneurs d électrons pour réduire le chrome (VI) ([Cr(VI)] ini = 2 mg.l -1 ) Procédés aérobies Flore endogène/cr(vi) dans le sol Losi et al. (1994) ont testé la possibilité de réduire le chrome présent dans un sol agricole en apportant de la matière organique (sous forme de fumier). Les expériences ont consisté à incuber 50 g de sol stérilisé ou non dans lequel a été ajouté du Cr(VI) (sous forme de K 2 Cr 2 O 7 ) à la concentration de 800 µg.kg -1 et éventuellement de la matière organique (qui correspond à un amendement de 50 tonnes.ha -1 ). Après 3 semaines d incubation (obscurité, 20 C) durant lesquelles l humidité du sol a été contrôlée et maintenue constante, il reste 400 µg.kg -1 de Cr(VI) dans les essais ne contenant pas de matières organiques fraîches (fumier) apportées, que le sol soit stérilisé ou non. En revanche, dans le cas où le sol a été amendé à 50 tonnes.ha -1, s il a été au préalable stérilisé, il reste environ 200 µg.kg -1 et seulement 30 µg.kg -1 s il n a pas été autoclavé. Il apparaît que le sol contient suffisamment de composés organiques et de Fe 2+ pour permettre une réduction de 50 % par des mécanismes chimiques (sol non amendé, stérile). L expérience avec le sol stérile amendé à 50 tonnes.ha -1 montre que l apport de MO (fumier) augmente la réduction du chrome qui atteint 75 % dans ces conditions. Si le sol n est pas stérilisé, la quasitotalité (96,4%) du Cr(VI) présent initialement est réduit. La matière organique apporte des microorganismes exogènes et stimule l activité microbienne endogène qui permet de compléter la réduction chimique du chrome. Les auteurs ont dénombré les micro-organismes présents dans le sol. Lorsque le sol n est pas amendé en MO, il y a dix fois moins de bactéries. La stimulation de la flore endogène permet d obtenir un meilleur rendement de réduction. Cependant, il faut noter que dans cette étude le chrome présent a d une part été apporté pour les manipulations (sol non pollué initialement donc microflore non adaptée à la présence de Cr(VI)) et d autre part est à une concentration relativement faible (< à 1 mg.kg -1 ). 70

82 BIBLIOGRAPHIE RÉSISTANCE MICROBIENNE AU CHROME ET MÉCANISMES DE RÉDUCTION Pseudomonas fluorescens LB300/Cr(VI) en solution Dans cette étude, les auteurs (Chirwa et Wang, 1997) ont utilisé un réacteur (de 12,5 cm de hauteur et 2,54 cm de diamètre soit un volume vide d environ 64 cm 3 ) contenant des billes de pyrex de 3 mm de diamètre ensemencé avec la souche Pseudomonas fluorescens LB300 cultivée en aérobiose. La température est maintenue à 30 C pendant toute l expérience et le débit dans la colonne est compris entre 1,1 et 4,4 ml.h -1. Du chrome (VI) est injecté périodiquement dans le réacteur de façon à avoir une concentration à l entrée de la colonne comprise entre 30 et 100 mg.l -1 afin d évaluer l évolution du système lorsque la concentration en chrome à l entrée du réacteur augmente (au total, environ 230 mg de Cr(VI) auront été injectés sur une période de 118 jours). Une partie des cellules va se fixer sur les billes et l autre reste en suspension. Le fait que la biomasse attachée sous forme de biofilm aux billes de verre augmente lorsque la concentration en Cr(VI) augmente suggère aussi aux auteurs que la réduction s effectuait davantage par les cellules fixées que par celles en suspension. L adhésion des cellules au support solide les protège de l effet toxique du chrome. Quelles que soient les concentrations en Cr(VI) à l entrée, le bio-réacteur permet d obtenir en sortie des concentrations de l ordre de 10 mg.l -1 sans renouveler le réacteur en cellules fraîches. La quasi totalité du chrome (III) est retrouvé dans le surnageant (dont le ph est resté constant à 6,9 ± 0,1 unité durant les 118 jours) ce qui est cohérent avec le mécanisme de réduction utilisé par P. fluorescens LB300 qui réduit le chrome grâce à une enzyme soluble du périplasme, le chrome (III) n est donc pas stocké dans les cellules. De plus les cellules ont une faible capacité à fixer le Cr(III) sur leurs membranes. La forme sous laquelle se trouve le chrome trivalent dans le surnageant du réacteur n a pas fait l objet d investigation. Etant donné qu il est insoluble à des ph supérieurs à 5,5, il est probablement compléxé ou sous forme de CrOOH Pseudomonas mendocina MCM B-180/Cr(VI) dans le sol Cette étude (Salunkhe et al., 1998) a été réalisée afin d évaluer le potentiel de la souche Pseudomonas mendocina a réduire le chrome (VI) présent dans un sol en présence des micro-organismes indigènes. Les expériences ont consisté à incuber 1 g de sol (d origine agricole, non pollué) avec du milieu EG 1 dans différentes conditions d humidité et avec des inocula de «tailles» différentes (la température d incubation n est pas précisée par les auteurs). 1 Composition du milieu EG, en g.l -1 : NH 4 Cl, 0,03 ; K 2 HPO 4, 0,03 ; KH 2 PO 4, 0,05 ; MgSO 4 7 H 2 O, 0,01 ; CH 3 COONa, 2,0 ; extrait de levure, 0,15 ; peptone, 0,5 ; ph 7,5) 71

83 BIBLIOGRAPHIE RÉSISTANCE MICROBIENNE AU CHROME ET MÉCANISMES DE RÉDUCTION Ces deux facteurs semblent particulièrement importants : la taille de l inoculum doit être de 10 7 à 10 8 UFC.g -1 de sol et l humidité doit être supérieure à 80 % pour obtenir plus de 99 % de réduction du chrome (VI) en 24 h (concentration initiale en Cr(VI) dans les sols de 100 mg.kg -1 de sol). Les expériences avec du sol préalablement stérilisé ou non ont montré qu il n y avait qu une faible participation de la flore indigène au processus de réduction du chrome. Ce résultat n est pas surprenant compte tenu du fait que la microflore indigène n est pas adaptée à la présence de chrome. En effet, le sol initial n était pas pollué au Cr(VI). Les auteurs (Salunkhe et al., 1998) ont ensuite testé la capacité d un sol traité par la souche Pseudomonas mendocina à permettre la germination et la croissance de blé (Triticum vulgare). Le sol non contaminé et le sol contaminé non traité ont servi de témoins pour comparaison. En deux semaines, sur le sol pollué non traité, les pousses de blé sont mal formées et chlorotiques, alors que sur le sol pollué mais traité le blé est comparable à celui du sol témoin non pollué et les nouvelles graines sont saines. Le traitement biologique du sol permettrait d immobiliser le chrome dans le sol et de le détoxifier par réduction en chrome (III), complexation de celui-ci avec des molécules organiques et précipitation sous forme d hydroxydes. 72

84 MATÉRIELS ET MÉTHODES MATÉRIELS ET MÉTHODES 73

85 MATÉRIELS ET MÉTHODES 1.Sol pollué et méthodes analytiques 1.1. Origine Un sol de l agglomération lyonnaise a été choisi pour cette étude. Il fait partie des sites contaminés recensés en 1994 par les directions régionales de l industrie, de la recherche et de l environnement. Sur ce site avaient été entreposés des fûts contenant des effluents chromés qui provenaient d une industrie de traitement de surface. Après la cessation d activité de cette entreprise, les fûts ont été abandonnés sur ce terrain. D importantes fuites de ces containers ont conduit à une pollution localisée du site. Aujourd hui, à l endroit où les fûts avaient été stockés, aucune végétation n est visible. Le sol du site pollué est constitué d un horizon de surface limono-argileux d une profondeur de 30 cm qui repose sur une couche argileuse plastique très compacte d environ 2 m d épaisseur. C est la partie superficielle, entre 0 et 30 cm qui a été prélevée, homogénéisée à la main, séchée à température ambiante pendant 24 heures, tamisée à 2 mm et stockée à 4 C. Dans le cadre du contrat avec l ADEME, ce sol a été appelé sol S3. En 1996, les analyses par spectrophotométrie d'absorption atomique des métaux lourds présents dans le sol avaient révélé une forte pollution en Cr, Ni, Pb, Zn et Cu. Les résultats d analyses effectuées sur le premier échantillonnage sont présentés dans le Tableau XVI. Tableau XVI : Quantité de métaux lourds dans le sol exprimée mg.kg -1 de matière sèche (Radovic, 1996). Extraction séquentielle (procédure de Tessier (1979)). Métaux (mg.kg -1 ) Cd Cr Cu Fe Pb Ni Zn Fraction échangeable Fraction liée aux carbonates Fraction liée aux oxydes de Fe et Mn Fraction liée à la matière organique Résidu Total

86 MATÉRIELS ET MÉTHODES Cette zone anciennement protégée de la pluie par un auvent est aujourd'hui à l'exposition des intempéries suite à la chute de cet auvent. Ceci explique les différences de teneurs en chromate obtenues en 1999 lors d un deuxième prélèvement (Gendrault, 1999), bien plus faibles par rapport à celles obtenues lors des prélèvements des années précédentes. Aujourd'hui, on suppose que la majorité du chrome (VI), très soluble dans l'eau, est passée dans les couches inférieures du sol par lessivage Prélèvement du sol et re-contamination en chrome (VI) Un nouveau prélèvement a été effectué sur ce même sol dans le cadre de cette étude. Les cinquante kilogrammes prélevés ont été homogénéisés à la main, séchés à température ambiante pendant 3 jours, puis tamisés à 2 mm. On effectue un tamisage secondaire sur la totalité de l échantillon prélevé sur le site soit environ 35 kg. Pour cela, le sol est déversé sur une bâche en plastique dans une salle ventilée au sol plan bétonné. Après séchage pendant 12h en couche mince à température ambiante, les sols sont homogénéisés par brassage manuel. Les analyses du chrome (VI) présent dans le sol S3 (Gendrault, 1999) nous donnent des concentrations de l ordre de 30 à 80 mg de chrome (VI) par kg de sol soit des concentrations nettement inférieures à celles obtenus en Etant donné la difficulté à disposer d un nouveau site de prélèvement correspondant à ce type de pollution, nous avons alors pris la décision, en accord avec l ADEME et POLDEN, de polluer artificiellement le sol prélevé en 1999 afin d obtenir une concentration en chrome (VI) proche de celle mesurée en Pour cela, le chrome (VI) est apporté sous la forme d une solution de bichromate de potassium (K 2 Cr 2 O 7 ) Trois niveaux de pollution : [Cr (VI)] = 300 mg.kg -1 de sol sec (extraction alcaline), [Cr (VI)] = 1108 et 1216 mg.kg -1 de sol sec (extraction eau ou alcaline, respectivement), [Cr (VI)] = 2000 et 2300 mg.kg -1 de sol sec (extraction eau ou alcaline, respectivement). Le sol est ensuite tamisé et quarté en aliquotes de sol de 250 g par pelletage alterné. Le taux d humidité du sol S3 a été déterminé par mesure du poids sec (étuve 105 C pendant 24h). L échantillonnage secondaire permet de préparer les aliquotes de sol de masse réduite et représentatif de l échantillon initial pour les essais d extraction du chrome (VI) et les essais de bio-immobilisation. 75

87 MATÉRIELS ET MÉTHODES 1.3. Extraction du chrome (VI) contenu dans le sol Extraction par l eau 100 ml d eau distillée sont ajoutés à 5 g de sol (humide ou sec selon les cas) et mis à agiter dans un Erlenmeyer. Le mélange est agité pendant 10 heures à 120 rpm à l obscurité à 30 C puis récupéré et centrifugé à 3000 g pendant 10 minutes. Le surnageant est récupéré et le chrome (VI) dosé par la méthode spectrophotométrique au diphénylcarbazide (voir page 76) Extraction par une solution alcaline Afin d éviter la réduction du chrome (VI) en chrome (III) qui pourrait se produire avec la méthode d extraction par l eau, une extraction par une solution alcaline (Na 2 CO M NaOH 0.5M ph 11.8) sera effectuée sur certains échantillons. A 5 g d échantillon sont ajoutés 80 ml de la solution alcaline. La suspension est mélangée énergiquement à la main pendant 5 minutes et ensuite placée à l obscurité à température ambiante pendant 1 heure. Le volume final est ajusté à 100 ml, le mélange est ensuite centrifugé à 3000 g pendant 10 minutes. Le chrome (VI) est dosé par la méthode spectrophotométrique au diphénylcarbazide (voir page 76) Dosage du chrome et du cuivre Cu Dosage du chrome (VI) Le dosage du chrome (VI) se fait grâce à une réaction colorimétrique avec du diphénylcarbazide. Le mélange réactionnel a un maximum d absorption à 540 nm. Nous avons d abord vérifier que les milieux utilisés n absorbaient pas ou peu à cette longueur d onde. Ensuite il fallait s assurer que l absorbance des échantillons purs ou dilués était comprise dans une gamme où l absorbance est directement proportionnelle à la concentration en chrome (VI). Pour pouvoir appliquer la loi de Lambert-Beer (Abs 540 nm = ε 540 nm.l.c où ε est le coefficient d extinction molaire, l la longueur de la cuve et c la concentration de la solution) les concentrations ne doivent pas être supérieures à 10 µm. Nous avons vérifié que la relation entre l absorbance et les concentrations était bien linéaire dans cette gamme (0 à 10 µm). Les échantillons dont la concentration est de l ordre de 1 mm de Cr(VI) ont été dilués au 1/200. Le domaine d incertitude est de l ordre de 2,5 %. 76

88 MATÉRIELS ET MÉTHODES Une absorbance à 540 nm d un échantillon à 5 µm est en général de 0,200 ± 0,005. Ces 0,005 unités de densité optique représentent 0,12 µmole soit 2,5 % de la concentration initiale. Si bien sûr on travaille avec des échantillons moins concentrés en chrome, il convient de réajuster la dilution de manière à lire une absorbance comprise entre 0,100 (5% d erreur) et 0,200 (2,5 % d erreur). Le milieu minéral M63 contient du Fe 2+ qui peut réduire le chrome hexavalent. Nous avons donc vérifié que la réduction du chrome (VI) par le fer Fe 2+ était négligeable de manière à attribuer le phénomène de réduction à un phénomène biologique et non pas simplement chimique. A la concentration de 3,2 µm, le Fe 2+ présent ne permet pas d observer une réduction significative même si l on incube l échantillon stérile pendant une quinzaine de jours. En effet, si tout le Fe 2+ réagit avec le chrome (VI), il reste 0,9968 mm, soit 99,7 % du chrome présent et nous nous situons dans le domaine d incertitude de l analyse colorimétrique. La solution de diphénylcarbazide est composée de la façon suivante : 0,3 g de Diphénylcarbazide mis en solution dans un volume final de 100 ml d éthanol 95 %. Cette dissolution s effectue à l obscurité pendant 15 minutes. Cette solution est complétée à 500 ml avec de l acide sulfurique à 176 g.l -1. Cette solution est stockée à 4 C pendant 1 mois Dosage du chrome total Pour déterminer le chrome total contenu dans un échantillon, le chrome est converti en chrome (VI) par oxydation avec l hypobromite de lithium en condition acide et en présence de pyrosulfate de potassium. Ensuite, le chrome (VI) est dosé avec le diphénylcarbazide (voir ci dessus) Dosage du cuivre Cu 2+ Le dosage du cuivre Cu 2+ se fait grâce à une réaction colorimétrique avec du 2-2 biquinolyle. Le mélange réactionnel a un maximum d absorption à 546 nm. 1 ml d échantillon à analyser est introduit dans un tube en verre contenant 0,1 g de chlorydrate d hydroxylamine et 0,1 g d acétate de sodium. Puis 1 ml de solution de 2-2 biquinolyle (0,2 g.l -1 dans de l alcool amylique) est ajouté. Le mélange est agité puis après séparation des 2 phases, on récupère la phase supérieure de coloration rose-mauve qui contient les ions Cu 2+ compléxés avec le 2-2 biquinolyle. La gamme étalon est réalisée avec des solutions de CuSO 4 dont les concentrations sont comprises entre 0,8 et 20 µm. 77

89 MATÉRIELS ET MÉTHODES 1.5. Humidité résiduelle des échantillons de sol Une quantité connue de sol est séchée à 105 C pendant environ 24 heures (temps nécessaire en moyenne pour que la masse sèche soit constante). La différence entre la masse avant séchage et après séchage permet de déterminer la quantité d eau présente dans le sol analysé. 2.Milieux de culture Les milieux de cultures doivent contenir une source azotée, une source carbonée, une source de phosphore et de soufre et éventuellement des facteurs de croissance. De manière générale, les milieux de culture sont stérilisés par autoclavage à 120 C pendant 20 minutes et conservés ensuite à température ambiante. Deux cas sont possibles : ou la totalité des composés peut être autoclavée en même temps sous forme de mélange, ou bien certains doivent être ajoutés après autoclavage d un mélange initial. Les composés qui doivent être ajoutés après l autoclavage sont signalés par un astérisque *. Les antibiotiques, lorsqu ils sont ajoutés directement dans le milieu, sont introduits après autoclavage et refroidissement du milieu. Il est possible de les ajouter sur les boîtes de Petri déjà coulées et solidifiées en ajoutant 1 ml d une solution concentrée que l on répartit de manière homogène sur toute la surface de la boîte. Celle-ci est mise à sécher sous la hotte à flux laminaire jusqu à pénétration totale du liquide dans la gélose (environ 30 min). Deux types de milieux minéraux ou milieux minima ont été testés pour observer le phénomène de réduction. Ces milieux permettent un bon développement bactérien de la souche étudiée (Streptomyces thermocarboxydus NH50) mais beaucoup moins rapide qu en milieu riche. Ces milieux ont l avantage de ne contenir que des minéraux et une seule source de carbone qui n interfèrent pas dans les dosages. De plus l appréciation visuelle de la réduction du chrome (disparition de la couleur jaune) est beaucoup plus facile dans un milieu incolore et translucide que dans un milieu riche de couleur marron Milieux liquides Milieu M63 Le milieu minéral synthétique utilisé est couramment appelé au laboratoire M63. Sa composition est la suivante : KH 2 PO M, (NH 4 ) 2 SO 4 15 mm, FeSO µm, MgSO mm, thiamine % ; ph ajusté à 6.8 avec KOH 6 M). 78

90 MATÉRIELS ET MÉTHODES Préparé de la manière suivante pour 1 litre : KH 2 PO 4 13,6 g ; (NH 4 ) 2 SO 4 (solution à 20%) 10,0 ml ; MgSO 4, 7 H 2 O (solution à 20%) 1,0 ml ; FeSO 4, 7 H 2 O (solution à 0,1%) 1,0 ml ; KOH (solution à 130 g.l -1 ) 8,3 ml ; Thiamine (solution à 0.05 %) 1,0 ml Ce milieu est translucide et n absorbe pas à 540 nm (longueur d onde utilisée pour le dosage du chrome). On y ajoute une source de carbone. Selon les cas, il s agit de glucose * (noté G) à la concentration finale de 10 g.l -1 ou de glycérol (noté Y) à 3 g.l Milieu VB (Vogel-Bonner) Ce milieu minéral avait été utilisé par Nathalie Huck pendant son DEA. Il est obtenu en mélangeant deux solutions S1 et S2 volume à volume après autoclavage. S1 est une solution de glucose à 15 g.l -1 et S2 est préparée de la manière suivante (pour 1 litre) : K 2 HPO 4 20 g ; Na 2 HPO 4, 12 H 2 O 12 g ; NH 4 Cl 1,8 g ; MgSO 4, 7 H 2 O 0,4 g ; Acide citrique 4 g Les milieux riches sont utilisés en général pour obtenir de grande quantité de cellules rapidement (1 ou 2 jours) Milieu LB (Luria Broth) Composition pour 1 litre Bactotryptone 10 g ; Extrait de levure 5 g ; NaCl 5 g Le ph est ajusté à 7 avec de la soude. L ensemble des constituants est solubilisé dans l eau déminéralisée en chauffant le mélange jusqu à ébullition pour obtenir un milieu limpide. 79

91 MATÉRIELS ET MÉTHODES Milieu PEG Ce milieu a été utilisé principalement par N. Huck pendant son DEA. C est un milieu riche très proche du milieu LB. Il contient (pour 1 litre) Bactopeptone 10 g ; Extrait de levure 5 g ; Glucose 3 g Milieu YEME (Yeast Extract Malt Extract) Ce milieu très riche, spécifique des Streptomyces (Hopwood, 1985). Composition pour 1 litre Bactopeptone 5 g ; Extrait de levure 3 g ; Extrait de malt 3 g ; Saccharose 340 g Ce milieu est très riche en saccharose et permet de récupérer des mycéliums peu compacts. Le milieu YEME est utilisé pour la préparation de protoplastes de Streptomyces Milieux solides M63 et LB Les milieux M63 et LB peuvent être solidifiés par de l agar-agar ou gélose à 1,5 %. Cet agar-agar permet au milieu de prendre en masse. C est un polygalactoside qui n est pas dégradé pas les bactéries en général. Cependant, les Streptomyces ont la particularité de synthétiser plusieurs agarases ce qui permet un ancrage des colonies dans la gélose. Après remplissage, les boîtes de Petri sont séchées pendant 15 minutes à l étuve à 50 C. Elles sont stockées en chambre froide à 4 C pendant 2 à 3 semaines. 80

92 MATÉRIELS ET MÉTHODES R5 Un autre milieu solide appelé R5 a été utilisé pour permettre la sporulation des Streptomyces. Composition pour 1 litre : Agar-agar 22 g ; Saccharose 103 g ; K 2 SO 4 0,25 g ; MgCl 2, 6H 2 O 10,12 g ; Casaminoacides 0,1 g ; Solution d éléments traces 0,2 ml ; (ZnCl2 0.3 mm, FeCl3 6H2O 0.75mM, CuCl2 2H2O 60 µm, MnCl2 4H2O 50 µm, Na2B4O7 10H2O 27.5 mm, (NH4)6Mo7O24 4H2O 8 µm) Extrait de levure 5 g ; TES 5,73 g (acide N-tris[hydroxymethyl]methyl-2-aminoethanesulfonique ; acide 2-[(2-hydroxy-1,1- bis[hydroxymethyl]ethyl)amino]ethanesulfonique) Ce mélange est chauffé, porté à ébullition pour permettre une dissolution complète de tous les constituants. Après autoclavage et avant de couler les boîtes de Petri, on ajoute dans ce milieu les composés suivants (pour 1 litre) KH 2 PO 4 * (0,5 %) 5 ml CaCl 2 * (5M) 2 ml L-proline* (20 %) 7,5 ml Glucose* (40 %) 25 ml NaOH* (1N) 3,5 ml 81

93 MATÉRIELS ET MÉTHODES NE Ce milieu a été utilisé pour tester la sensibilité des souches de Streptomyces à certains antibiotiques Composition pour 1 litre: Agar-agar 20 g ; Glucose 10 g ; Casaminoacides 2 g ; Extrait de levure 2 g ; Extrait de viande 1 g Ajout des antibiotiques Les antibiotiques peuvent être ajoutés dans les milieux solides (généralement R5) de 2 manières : soit directement dans le milieu liquéfiés par chauffage après refroidissement et avant le coulage des boîtes, ou alors, après avoir coulé les boîtes et étalé des bactéries en ajoutant 1 ml d une solution concentrée d antibiotiques sur les 25 ml de milieu solidifié. Dans ce cas, les boîtes sont mises à sécher sous la hotte à flux laminaire. 3.Isolement de Streptomyces thermocarboxydus NH Isolement de la souche réductrice (effectué par N. Huck en 1997) La souche bactérienne capable de réduire le chrome (VI) en chrome (III) a été isolée au laboratoire en Une suspension de sol contaminé a été enrichie en micro-organismes réduisant les chromates. Ces micro-organismes ont été isolés sur boîte de Petri et testés séparément pour leur aptitude à réduire le chrome. Etape d enrichissement : 2,5 g de sol avaient été incubés avec 100 ml de milieu minimum VB complémenté en glucose. Après 10 jours d incubation à 30 C sous agitation, 100 % du chrome (VI) avaient été réduit. Cette culture a été utilisée pour ensemencer d autres essais contenant 2,5 g de sol et 100 ml de milieu minimum. Ces essais «enrichis» ont permis d obtenir une réduction de 99 % en 3 jours. L isolement à été effectué à partir de la suspension contenue dans ces essais par étalement sur boîte de Petri contenant un milieu riche et 1 mm de chrome (VI). 82

94 MATÉRIELS ET MÉTHODES Les boîtes ont été incubées pendant 4 jours à 30 C. 3 types de colonies ont été obtenus par cette méthode. Chaque type de micro-organisme a été ré-isolé plusieurs fois sur de nouvelles boîtes afin de disposer de souches pures. 100 ml de milieu minimum VB liquide avec du glucose contenant 1 mm de chrome ont été de nouveau inoculés avec chacun des isolats. Dans la moitié des essais, 5 g de sol autoclavés au préalable ont été ajoutés. Un des isolats, en présence de sol, a permis d observer une réduction de 96 % du chrome en trois jours. C est cet isolat qui a été utilisé pour l étude de la bioréduction du chrome. Cet isolat a été appelé NH Identification L identification de la souche réductrice a été effectuée par le laboratoire de John Willison au CEA de Grenoble. Le principe est le suivant : l ADN total de la souche bactérienne est extrait et des amorces complémentaires de la région codant l ARN ribosomique 16S sont ajoutés à la préparation après dénaturation de l ADN. Cette étape de dénaturation permet aux amorces d aller s hybrider avec la séquence qui leur est complémentaire. Grâce à une enzyme appelée ADN polymérase la région codant l ARN 16 S est amplifiée. Ce morceau d ADN amplifié (en grand nombre de copies) est utilisé pour être séquencé. La séquence nucléotidique est ensuite analysée et comparée aux banques de données disponibles sur internet. L analyse a révélé que la séquence codant l ARNr 16S de la souche NH50 était à 99,9 % identique à celle d une souche de Streptomyces thermocarboxydus. 4.Bactéries et techniques microbiologiques et biochimiques 4.1. Transformation d Escherichia coli NM522 La souche NM522 est cultivée à 37 C pendant la nuit. Cette pré-culture est utilisée pour ensemencer 5 ml de milieu LB. La culture est mise à agiter à 37 C jusqu à ce que l absorbance à 600 nm soit comprise entre 0,3 et 0,4. Pour une transformation, 1 ml de cette culture est centrifugée à 4000 rpm pendant 2 min à température ambiante, le surnageant est éliminé et les cellules resuspendues dans 0,1 ml de tampon TSS froid. (Chung et al., 1989). Le tampon TSS (Transformation Storage Solution) est composé de PEG %, MgCl 2 10 mm, MgSO 4 10 mm et DMSO 5 % dans du milieu LB. L ADN (0,1 µg) est mis en contact avec les bactéries compétentes pendant 5 à 30 min sur la glace. Le volume final de la suspension est ajusté à 1 ml avec du tampon TSS et le mélange incubé 1 heure à 37 C. Des aliquotes de ce mélange sont étalés sur des boîtes LB contenant un antibiotique (pour la sélection des clones ayant été transformés par le plasmide). Le rendement attendu est de 10 5 à 10 6 UFC par µg d ADN. 83

95 MATÉRIELS ET MÉTHODES 4.2. Streptomyces Préparation du stock de spores 10 ml d eau stérile sont déposés sur une boîte de Petri contenant du milieu R5 ensemencée par une souche de Streptomyces et incubée pendant 5 à 7 jours jusqu à sporulation des bactéries (pellicule grise ou blanche facilement détachable à la surface du tapis cellulaire ou des clones isolés). La surface de la boîte est grattée avec la pointe d une pipette. La suspension est placée ensuite dans un tube à essai stérile et vortexée 1 min. environ. La suspension est ensuite filtrée sur du coton stérile placé dans une seringue stérile de 10 ml pour éliminer les morceaux d agar. Le filtrat est centrifugé 5 min à 5000 rpm et les spores resuspendues dans 1 ml de glycérol 20%, pour être conservées au congélateur à 20 C ou dans 1 ml d eau stérile dans le cas d une utilisation immédiate Cultures Les milieux liquides sont ensemencés avec des spores de Streptomyces. Les cultures sont réalisées dans des Erlenmeyers de 250 ml contenant 50 ml de milieu liquide ou dans des tubes contenant 5 ml de milieu. Les cultures sont incubées en chambre thermostatée à 30 C à l obscurité sous agitation orbitale d environ 120 rpm. Le chrome est apporté sous forme de chromate (K 2 CrO 4 ) à partir d une solution mère à 1 M. La dilution est de 1/1000 pour obtenir une concentration finale de 1 mm. Cette dilution très faible permet de ne pas modifier la concentration des minéraux composant les milieux liquides. Le cuivre est apporté dans les cultures ou dans les surnageants de culture sous forme de CuSO 4 ou de CuCl 2 à partir de solutions stock 100 mm. Une dilution au 1/1000 permet d obtenir une concentration finale de 0,1 mm Préparation de protoplastes de Streptomyces 100 ml de milieu YEME auxquels ont été ajoutés 0,5 ml de MgCl 2 6H 2 O sont inoculés avec 1 ml de spores fraîches pendant 40 heures à 30 C. Les cellules sont récupérées par centrifugation à 3000 rpm pendant 10 minutes à 4 C. Si les cellules ont du mal à sédimenter, le milieu de culture est dilué par 2 avec de l eau stérile. Le tampon P est préparé comme suit : pour 80 ml de saccharose 10,3 % on ajoute 1 ml KH 2 PO 4 0,5 %, 5 ml CaCl 2 (0,5 M), 10 ml TES 0,25 M ph 7,2. Le tampon P complet est filtré à 0,2 µm et refroidi à 4 C. Le culot de cellules est lavé 2 fois avec du saccharose 10,3 % froid. Après le dernier lavage, les cellules sont resuspendues dans 36 ml de tampon P complet auquel on ajoute 10 ml d une solution de lysozyme à 10 mg.l -1. L incubation se fait à 37 C pendant au moins une heure. On peut suivre la disparition du mycélium au microscope. Lorsque ceux ci sont bien désagrégés, les protoplastes et le mycélium restant sont filtrés sur du coton hydrophile mouillé avec du tampon P glacé contenu dans des seringues sans mettre le piston. Les protoplastes sont alors centrifugés lentement et doucement en évitant 84

96 MATÉRIELS ET MÉTHODES tout choc thermique qui pourraient entraîner leur lyse. La centrifugation à 2700 rpm dure 7 minutes. Ils sont lavés une fois avec du tampon P glacé et repris au final dans 10 ml de tampon P. Ce lavage sert à éliminer le lysozyme. Des aliquotes de 200 µl sont préparées, le reste est jeté. Si des dilutions sont nécessaires, elles s effectuent au tampon P ou au saccharose 10,3 % froid. Les protoplastes peuvent être congelés à 80 C en procédant au préalable à une congélation à 20 C pendant une nuit Transformation des protoplastes Les protoplastes, s ils sont congelés, sont décongelés très rapidement en passant les eppendorfs sous de l eau chaude. Ils sont centrifugés à 1500 g pendant 7 min. et repris dans 100 µl de tampon P. On ajoute la solution d ADN (qui doit représenter moins de 10 % du volume pour éviter une lyse des protoplastes, 5 µl en général) puis immédiatement 0,4 ml de PolyEthylène Glycol 1000 (PEG 1000 de NBS Biological) à 25 % dans du tampon P, préalablement fondu au four à micro-ondes pendant 9 secondes puis filtré sur filtre 0,2 µm. A l aide de la pipette, le tout est mélangé en aspirant et en refoulant très doucement pendant 2 min. Le contenu du tube Eppendorf est ensuite déposé sur une boîte R5 sèche et étalé en évitant d utiliser un râteau (en agitant la boîte). Les boîtes sont mises à sécher sous la hotte à flux laminaire pendant une quinzaine de minutes puis incubées à 30 C pendant une nuit. L antibiotique est ajouté sur la boîte le lendemain et les boîtes sont de nouveau incubées à 30 C Conjugaisons Deux protocoles de conjugaison ont été utilisés. Protocole A. conjugaison avec pré-germination. 1 ml d une suspension de spores de chacune des 2 souches (receveuse et donneuse) est centrifugé. Les spores sont resupendues dans 1 ml de tampon TES (N-[hydroxymethyl]-2-aminoéthane-acide sulfonique) 0,05 M. Après homogénéisation le volume est ajusté à 5 ml avec du tampon TES et le tube est placé à 50 C pendant 10 minutes puis retiré et placé sur la glace. 5 ml de milieu de pré-germination (extrait de levure 10 g.l -1, casaminoacides 10 g.l -1, CaCl 2 0,01 M ajouté après autoclavage à partir d une solution 2,5 M) sont ajoutés. Après une incubation d 1 h 30 à 37 C, la suspension est centrifugée et les cellules sont lavées et resuspendues dans 1 ml de tampon TES 0,05 M. Dans des tubes Eppendorfs stériles, 200 µl d un mélange (v/v) de la suspension pure ou diluée (10-2, 10-4 ) de chacune des souches sont mis en contact pendant 5 heures à 37 C. Le mélange est ensuite déposé sur une boîte de Petri LB 5 mm de Cr(VI) et réparti sur toute la surface. Les boîtes sont mises à sécher sous la hotte à flux laminaire pendant 30 minutes puis à incuber à 30 C pendant 1 nuit. Le lendemain, l antibiotique est ajouté (thiostrepton 10 µg.ml -1 ou chloramphénicol 50 µg.ml -1 pour les croisements avec les souches S. albus hsp18::tsr et TK24 respectivement). Les boîtes sont alors incubées à 30 C pendant 3 à 5 jours. 85

97 MATÉRIELS ET MÉTHODES Protocole B : le principe est de mettre en contact directement les spores. 100 µl de spores de chacune des souches (donneuse et receveuse) sont mises en contact et étalés sur milieu R5 non sélectif. Les boîtes sont incubées à 30 C jusqu à sporulation. Les spores de ce mélange sont récupérées selon le protocole de préparation d un stock de spores. Le mélange est étalé à différentes dilutions sur le milieu sélectif (chrome + antibiotique correspondant) Electrophorèse en champ pulsé Ces expériences ont été réalisées au laboratoire de Génétique et Microbiologie - UMR INRA IFR 110 à Vandoeuvre-les-Nancy dans l équipe du Professeur Pierre Leblond Préparation des «inserts» («plugs») Le mycélium est récupéré par centrifugation d une culture de 48 h en YEME à 30 C. Les cellules sont resuspendues dans du tampon SucTE (saccharose 10,3 %, Tris HCl (ph 8) 10 mm, EDTA 1 mm). La densité optique à 600 nm est ajustée à 2,0 après avoir mélangé dans un volume équivalent de LMPA 1,5 % Traitement des «inserts» Les inserts sont incubés à 37 C pendant 6 à 12 h dans une solution de TE-lysozyme (Tris HCl (ph 8) 10 mm, EDTA 1 mm, lysozyme 2 mg.ml -1 ). Les inserts devenus blancs à cette étape sont ensuite incubés pendant 2 fois 12 heures à 50 C dans une solution contenant du SDS 1 % (w/v) et de la pronase E 5 mg.ml -1. Les inserts, devenus transparents, sont rincés pendant 4 heures à température ambiante dans du tampon TE (Tris HCl (ph 8) 10 mm, EDTA 1 mm) et sont ensuite stockés à 4 C. Les inserts, qui ne sont pas traités par protéinase, sont incubés dans une solution contenant du SDS 2 %. Le reste de la procédure reste inchangé Electrophorèse L électrophorèse en champ pulsé est réalisée dans une cuve system CHEF (Biorad) en gel d agarose entre 0.8 et 1 % (w/v) dans un tampon TBE (Tris-Acide Borique-EDTA) 0,5 X ou TAE (Tris-Acide Acétique-EDTA) 0,5 X. Les tampons sont préparés concentrés : TAE 50 X : trizma base 242 g.l -1, acide acétique 57,1 ml.l -1 et EDTA ph 8 0,05 M. et TBE 10 X : trizma base 108 g.l -1, Acide borique 27,5 g.l - 1, EDTA ph8 0,02 M. L ADN concatémère du phage λ est utilisé comme standard de taille. 86

98 MATÉRIELS ET MÉTHODES 5.Etude des molécules réductrices dans les surnageants de cultures 5.1. Récupération des surnageants Des cultures de Streptomyces de plusieurs jours (entre 10 et 15 jours en général) sont utilisées pour récupérer le surnageant. Si la concentration initiale en Cr(VI) (à j = 0) dans la culture était de 1 mm, le surnageant est appelé SCr. S il n y a pas eu de chrome dans la culture, le surnageant est appelé S. Les cultures sont transvasées dans les tubes de 50 ml et après dépôt des mycéliums au fond des tubes (environ 30 min), la phase liquide est récupérée dans un nouveau tube de 50 ml en prenant soin de ne pas prélever de mycélium. Les échantillons, débarrassés d un maximum de leurs bactéries, sont alors centrifugés à 2000 g pour culoter les derniers mycéliums encore présents. Cette méthode permet d éviter la lyse cellulaire. Ainsi dans les surnageants que nous récupérons, ne seront présentes que les molécules excrétées et non celles contenues dans le cytoplasme de cellules avant la lyse. Les surnageants obtenus sont alors filtrés sur filtre Millipore 0,22 µm qui permet de les stériliser. Les surnageants sont conservés à 4 C après cette étape de filtration. Juste avant utilisation, les concentrations en Cr(VI) sont ajustées : s il s agit d un surnageant SCr, la concentration en Cr(VI) est mesurée, la concentration initiale réajustée à environ 1 mm, puis de nouveau mesurée pour connaître exactement la concentration en Cr(VI) présente. S il s agit d un surnageant S, le Cr(VI) est ajouté puis sa concentration mesurée. Les surnageants sont ensuite aliquotés pour les expérimentations Lyophilisation des surnageants Après filtration du surnageant, 50 ml de S ou SCr sont placés dans une boîtes de culture cellulaire. Les boîtes contenant les surnageants sont placées à 80 C dans une position permettant d obtenir une surface de liquide congelé maximale pour optimiser la lyophilisation. Les boîtes (au maximum 5 par lyophilisation) contenant les surnageants congelés sont placées dans le lyophilisateur (appareil MODULO modèle EDWARDS). L ouverture des boîtes est obturée par du parafilm percé de petits trous. La pression diminue pour atteindre, après quelques heures, la valeur de bars et la température du système est abaissée à 55 C. Les échantillons sont récupérés après 2 jours. Les surnageants lyophilisés sont récupérés sous forme de poudre blanche. 87

99 MATÉRIELS ET MÉTHODES Figure 5 : Boîte de culture cellulaire contenant le surnageant SCr après lyophilisation Fractionnement des surnageants lyophilisés Après lyophilisation, les surnageants sont resuspendus dans un volume d eau dix fois plus petit que le volume initial. Les constituants des surnageants sont alors fractionnés en fonction de leur masse moléculaire en utilisant MACROSEP TM 3kDa et MACROSEP TM 1 kda de Pall Gelman. Ces tubes contiennent une membrane qui ne laisse passer que les molécules dont la masse moléculaire est inférieure à 3000 et 1000 Daltons respectivement. Dans le réservoir, nous récupérerons les molécules qui n ont pas pu passer la membrane pendant la centrifugation. Le volume des deux phases liquides récupérées est alors ajusté au volume initial placé dans le réservoir de façon à ne pas les concentrer. Le protocole d utilisation suivi est celui donné par Pall Gelman avec une modification : le temps centrifugation. En effet le temps indiqué par le fournisseur n était pas suffisant pour obtenir un volume égal à la moitié du volume initial dans la partie inférieure du MACROSEP TM même si le liquide placé dans le réservoir était de l eau distillée. Par conséquent toutes les centrifugations ont été réalisées pendant au moins 6 heures Dosage des protéines contenues dans les surnageants par la méthode de Bradford Le bleu de Coomassie existe sous trois formes (anionique bleu λ max : 595 nm, neutre vert λ max = 650 nm et cationique rouge λ max = 470 nm). C est la forme anionique qui se lie préférentiellement aux protéines. La méthode de Bradford est basée sur le déplacement du maximum d absorption de 470 à 595 nm d une solution bleu acide de Coomassie G250 lorsque le colorant se fixe aux protéines. 88

100 MATÉRIELS ET MÉTHODES Pour chaque série de dosage, il est nécessaire d établir un gamme étalon γ-globuline comprise entre 0,2 mg.ml -1 et 1,4 mg.ml -1. Le dosage s effectue sur des prises d essai de 20 µl, complété avec 980 µl de réactif (dye reagent dilué au 1/5 filtré sur 0,2 µm conservé à 4 C pendant 15 jours). La lecture des absorbances se fait à 595 nm entre 5 et 60 min après le début de la réaction Résonance Magnétique Nucléaire du carbone Ces expériences ont été réalisées au laboratoire de Résonance Magnétique en Biologie Moléculaire dirigé par le professeur Claude Roby (CEA Grenoble). Le spectromètre Bruker AMX 400 est équipé d une tête de mesure large bande pour des tubes d un diamètre de 10 mm. La fréquence utilisée pour les spectres du carbone est de 100,6 MHz. La séquence répétée plusieurs fois pour obtenir le spectre contient une impulsion de 40 (soit une durée de 8,3 µs = P1), un délai de relaxation de 0,278 s appelé D1. Le signal (sinusoïdale amorite = FID) est obtenu en répétant 1000 fois la séquence P1 + D1. Les échantillons contiennent une référence éthanol dans du MDP (Méthylène Diphosphorique Acide) contenu dans un fin capillaire. Un des carbones de l éthanol résonne à 58,24 ppm en présence de MDP. La fréquence de résonance des pics observés dans le spectre carbone d une fraction du surnageant SCr a été comparé à une base de données disponible au laboratoire où ont été réalisées ces expériences. La liste des molécules et la fréquence de résonance des carbones les composants est donnée en annexe. 89

101 MATÉRIELS ET MÉTHODES 6.Procédures expérimentales d étude de la réduction du Cr(VI) en présence de sol 6.1. Milieu dispersé («batch») Les expériences en batch sont réalisées en Erlenmeyer de 250 ml avec des quantités variables de sol pollué avec du Cr(VI) et de milieu liquide M63 contenant une source de carbone. Le glycérol est utilisé à la concentration finale de 3 g.l -1 et le glucose à 10 g.l -1, sauf indication contraire. Si les concentrations en glucose utilisées sont supérieures à 10 g.l -1, le glucose est apporté sous forme de poudre directement dans le sol. La concentration en chrome (VI) en solution est suivie par prélèvement en condition stérile d un échantillon liquide qui est ensuite centrifugé pour sédimenter les particules de sol. La quantité de chrome (VI) total restant dans les échantillons est déterminée par extraction à l eau. Si le sol apporté doit être stérile, il est au préalable autoclavé 2 fois à 120 C pendant 20 minutes. L enrichissement par la flore endogène s effectue en ajoutant dans un nouvel essai 5 ml d un essai en batch où le chrome (VI) a été réduit. L apport de souches bactériennes exogènes (Streptomyces thermocarboxydus NH50 et Pseudomonas fluorescens LB300) peut s effectuer sous forme de spores (400 µl d une suspension stock soit 0, spores) ou de mycéliums pour NH50 ou à partir d une préculture pour la souche LB300. Les mycéliums de la souche NH50 sont obtenus après une culture de 50 ml de 2 jours en milieu LB. Ils sont ensuite récupérés par centrifugation à 2000 g, lavés avec du milieu M63 et resuspendus dans un volume de 100 ml de M63. La préculture de Pseudomonas fluorescens LB300 est obtenue en une nuit dans le milieu LB. 7 ml de cette pré-culture servent à ensemencer 93 ml de milieu liquide Microcosmes Les expériences en microcosmes sont réalisées dans des boîtes de Petri en verre avec des quantités variables de sol pollué avec du chrome (VI). L incubation a lieu à 30 C à l obscurité. Les sels minéraux ((NH 4 ) 2 SO 4 et NaHPO 4 ) sont apportés sous forme de poudre et mélangés au sol ou sont apportés en solution dans le milieu M63. Le glucose est aussi apporté sous forme de poudre lorsque la concentration testée est supérieure à 10 g.l

102 MATÉRIELS ET MÉTHODES 6.3. Lysimètres Les lysimètres sont des casiers en PVC de 50 cm sur 30 cm dans lesquels nous avons placé 2 ou 3 kg de sol pollué. La couche de sol est répartie en couche d épaisseur uniforme sur un géotextile qui permet d éviter l entraînement des fines particules de terre. La surface du sol est arrosée grâce à trois asperseurs situés au sommet du couvercle de PVC qui recouvre le casier. La circulation du liquide se fait en boucle fermée (voir la Figure 39 page 188). Les lysimètres fonctionnent à température ambiante (environ 25 C) Lit bactérien Les colonnes utilisées sont en verre et sont munies d un robinet. Les dimensions sont les suivantes : hauteur 30 cm, diamètre interne 6 cm, volume interne d environ 0,80 L, ces colonnes sont remplies avec le milieu M63Y après avoir placé le garnissage (hauteur de liquide : 20 cm). Avant utilisation, les colonnes, emballées dans de l aluminium, ont été autoclavées à 120 C pendant 20 minutes. Le robinet est quant à lui rincé plusieurs fois à l éthanol puis replacé en bas de la colonne. Les tuyaux Masterflex Tygon ont été autoclavés de la même manière que les colonnes. Le montage a été réalisé en prenant soin de minimiser les contaminations biologiques mais n a pas pu être réalisé sous atmosphère stérile. Une fois installées dans une pièce non thermostatée (température minimum : 22 C, température maximum : 33 C), les colonnes sont emballées dans de l aluminium pour maintenir l obscurité. Le garnissage est soit du bidim, soit des anneaux Raschig en céramique. Les anneaux de céramique ont les dimensions suivantes : 1 cm de haut, diamètre externe de 1,1 cm, diamètre interne de 0,7 cm, pèsent 1,15 g en moyenne et ont une surface spécifique de 440 m 2.m -3. L extrémité du tuyau arrivant en haut de colonne ne plonge pas dans le liquide (voir Figure 6). Nous avons branché la pompe de manière à faire «buller» de l air dans les colonnes deux heures par jour, Streptomyces étant un genre bactérien strictement aérobie. La pompe fonctionne en sens inverse pour réaliser les prélèvements. 91

103 MATÉRIELS ET MÉTHODES coton cardé pompe tuyau Niveau maximal de liquide bulles d air garnissage anneaux de Raschig plaque en inox percée robinet Figure 6 : Schéma d une colonne contenant des anneaux de Raschig en vrac 92

104 RÉSULTATS RESULTATS 93

105 RÉSULTATS CARACTÉRISATION DE LA SOUCHE S. THERMOCARBOXYDUS NH50 ET DE SA RÉSISTANCE AU CHROME I. CARACTÉRISATION DE LA SOUCHE Streptomyces thermocarboxydus NH50 ISOLÉE D UN SOL POLLUÉ PAR DU Cr(VI) ET DE SA RÉSISTANCE AU Cr(VI) 1. Historique 1.1. Introduction Un sol fortement pollué par des ions chromate a été étudié au LAEPSI. Ce sol est issu d un site de l agglomération lyonnaise où se trouvait un atelier de traitement de surface. La pollution provient de fuites de fûts contenant diverses solutions de chromates entreposés pendant des années sur le site. A partir de ce sol, trois types de bactéries capables de résister à 1 mm de chrome (VI) ont été isolés. Un seul de ces trois isolats s est révélé capable de réduire le chrome (VI) en chrome (III) en milieu liquide minéral VB 1 (Vogel- Bonner) avec du glucose comme source de carbone. Cette bactérie a été identifiée comme appartenant au genre Streptomyces et à l espèce thermocarboxydus après analyse par J. Willison, au laboratoire DBMS/BBSI, CEA Grenoble, d une partie de sa séquence d ADN codant l ARNr 16S (Desjardin et al., 2002). La séquence de 1333 paires de bases (pb) est disponible dans la base de données GenBank sous le numéro d accession AJ Cette séquence est identique à plus de 99,9 % à celle d un autre Streptomyces thermocarboxydus : AT37 (appelé aussi DSM44293). Sa séquence complète (1500 pb) est disponible dans la même base de données sous le numéro U Remise en culture de la souche Une ancienne culture sur boîte de Petri de la souche d intérêt a été utilisée. 1 ml de milieu PEG 1 liquide a été déposé sur la gélose. Des tubes contenant 5 ml de PEG liquide avec ou sans 1 mm de Cr(VI) ont été ensemencés avec 50 µl de la suspension récupérée sur la boîte après grattage. Les tubes ont été 1 La composition complète des milieux est présentée dans le chapitre Matériels et Méthodes. 94

106 RÉSULTATS CARACTÉRISATION DE LA SOUCHE S. THERMOCARBOXYDUS NH50 ET DE SA RÉSISTANCE AU CHROME incubés à 30 C sous faible agitation. Après 3 jours d incubation, de petits agrégats blancs se sont formés et ont adhéré aux parois des tubes. L aspect des cultures ressemblait à celui d une culture de Streptomyces en milieu liquide. En effet, ces bactéries se développent en formant des mycéliums visibles à l œil nu. Le reste du liquide est clair et limpide. Une des cultures en PEG 1 à 1 mm de chrome a été utilisée pour ensemencer des boîtes de Petri VB 1 à 0 ou 1 mm de chrome (VI) ainsi que des boîtes PEG à 0 ou 1 mm de chrome (VI). Pour cela, une culture de 5 ml a été centrifugée et le culot resuspendu dans 500 µl de VB liquide. 50 µl de cette suspension bactérienne ont été étalés sur chacune des boîtes. Après 5 jours, aucune colonie n a pu être observée sur les boîtes VB. Par contre des colonies, dont l aspect correspondait à celui de colonies isolées de Streptomyces en milieu solide (ancrées dans la gélose) sont apparues sur les boîtes PEG 0 et 1 mm. La souche a été nommée NH50 : NH pour Nathalie Huck, qui avait isolé cette souche en 1997 (Huck, 1997), et 50 car 1 mm correspond à 50 mg.l -1 de Cr(VI). 2. Principales caractéristiques physiologiques et biochimiques de la souche Streptomyces thermocarboxydus NH Aspect des cultures En milieu liquide Comme nous l avons expliqué dans la partie bibliographique, l aspect des cultures de Streptomyces peut être très différent selon la souche, le milieu et l agitation. Néanmoins, quelques grandes tendances se dégagent : - en milieu très riche, YEME 1 (Yeast Extract-Malt Extract) par exemple qui contient 34 % de saccharose, les mycéliums des Streptomyces sont relativement dispersés. Le milieu est trouble comme celui d une culture d Escherichia coli. Ce phénomène est accentué quand les cultures sont réalisées en Erlenmeyers à «picots» car le mouvement conféré au système contribue à dissocier les mycéliums par un effet mécanique. Lorsque l on cesse d agiter l Erlenmeyer, les mycéliums se déposent au fond et l on peut constater qu au-dessus des mycéliums, le milieu est limpide. Si l on travaille en milieu riche de type LB 1 La composition complète des milieux est présentée dans le chapitre Matériels et Méthodes. 95

107 RÉSULTATS CARACTÉRISATION DE LA SOUCHE S. THERMOCARBOXYDUS NH50 ET DE SA RÉSISTANCE AU CHROME (Luria Broth), les mycéliums se développent de façon diffuse. Si la croissance dure plusieurs jours, le milieu devient complètement trouble et les mycéliums sont bien visibles au microscope. - si l on réalise des cultures de Streptomyces dans un milieu minéral moins riche, de type M63G ou M63Y, les cellules ont tendance à se développer et se fixer sur la paroi du tube ou de l Erlenmeyer au niveau de la butée du liquide en mouvement. Il arrive aussi que les cellules poussent sous forme de tapis cellulaire au fond de l Erlenmeyer ou du tube surtout lorsque celui-ci est peu ou pas agité. Le biofilm se détache au bout de 3 jours quand il devient un peu plus épais. En condition de faible agitation, des mycéliums se développent aussi à la surface du liquide. La souche Streptomyces thermocarboxydus NH50, dans ces milieux, ne synthétise aucun pigment (en milieu M63G, S. lividans TK24 donne une coloration rose correspondant à la synthèse de l actinorhodine) Sur milieu solide Selon la composition du milieu de culture, la morphologie des colonies sur boîte est différente. La caractéristique commune est que les Streptomyces s accrochent à l agar à la différence d autres genres bactériens. Cet ancrage dans la gélose est due à la synthèse d agarases qui permettent au mycélium basal de se développer en creusant l agar. Cet ancrage permet de discriminer les cultures qui sont ou non contaminées par d autres micro-organismes. Pour vérifier qu une culture liquide de Streptomyces est pure, une goutte de celle-ci est déposée sur un milieu gélosé LB. Ce milieu riche non sélectif permet le développement de colonies en une douzaine d heures en général, sauf pour les bactéries du genre Streptomyces qui ont besoin de plus de temps pour que leurs colonies soient visibles à l œil nu sur les boîtes. Donc des colonies qui apparaissent en moins d une journée sont suspectes. Si les boîtes sont incubées pendant 2 jours, il suffit de gratter la surface de la boîte. Si les colonies restent attachées à l agar c est qu il s agit du genre Streptomyces. Dans le cas contraire, il s agit de clones d un autre genre bactérien. - sur milieu R5, les Streptomyces sporulent. Ils développent un mycélium aérien avec des hyphes terminées par des spores. La colonie est alors recouverte d une poudre (les spores) qui peut être blanche, grise ou légèrement rosée selon les souches considérées. La souche S. lividans TK24 présente la particularité de synthétiser un pigment de couleur rose sur ce type de boîte, S. thermocarboxydus NH50 produit des spores de couleur grise et l agar prend une teinte marron autour des colonies (Figure 7). C est à partir de ce type de boîte que l on récupère les sporées pour la mise en conservation. Lorsque l on cultive NH50 sur milieu LB, il n y a pas sporulation. - le milieu M63 permet d obtenir des colonies dont les spores sont en général très blanches ou légèrement grisâtres. L absence de source de carbone dans le milieu M63 n empêche pas le développement des colonies car l agar, lorsqu il est dégradé par l action d enzymes (agarases) produites par le genre 96

108 RÉSULTATS CARACTÉRISATION DE LA SOUCHE S. THERMOCARBOXYDUS NH50 ET DE SA RÉSISTANCE AU CHROME Streptomyces, peut servir de source de carbone. Le milieu R5 est donc utilisé pour préparer des spores ou pour obtenir des colonies sporulantes de manière à pouvoir déposer l empreinte de la boîte sur un velours dans l objectif de réaliser des répliques. Le milieu LB est utilisé pour tester différentes résistances et pour vérifier que la culture n est pas contaminée. Figure 7 : Aspect de la souche S. thermocarboxydus NH50 sur milieu R5 après 4 et 8 jours d incubation à 30 C Réduction du chrome (VI) Streptomyces thermocarboxydus NH50 a été cultivé dans différents milieux liquides pour tester la capacité de cette souche à réduire le chrome (VI). Les deux milieux utilisés par N. Huck (VB et PEG) ont été testés ainsi que les milieux LB et M63. Dans les deux milieux riches (PEG et LB) avec 1 mm de Cr(VI), la souche NH50 avait une bonne croissance et réduisait le chrome hexavalent en quelques jours. Dans ce type de milieux, deux phénomènes se produisent. D une part une réduction abiotique par les matières organiques de l ordre de 25 % du Cr(VI) apporté. D autre part, on observe un phénomène de bio-réduction dû à la présence des bactéries. Les essais avec la souche NH50 réduisent toujours beaucoup 97

109 RÉSULTATS CARACTÉRISATION DE LA SOUCHE S. THERMOCARBOXYDUS NH50 ET DE SA RÉSISTANCE AU CHROME plus vite que les essais stériles. En 3 jours, dans les essais abiotiques, il reste les ¾ du chrome (VI) présent au départ alors que dans les essais avec la souche bactérienne, cette réduction est totale. Ces milieux riches permettent un bon développement bactérien mais ne sont pas adaptés pour apprécier le phénomène de réduction réalisé par les bactéries puisque la réduction abiotique est significative. De plus les milieux riches ont une coloration marron ce qui rend difficile l observation de la disparition du chrome (VI) de couleur jaune. En revanche, en milieu minéral, la disparition de la coloration jaune des ions chromate en solution est visible à l œil nu (voir Figure 8). Par conséquent les milieux riches seront utilisés de préférence pour obtenir de grandes quantités de cellules. Dans les milieux minéraux (VB et M63), contenant du glucose (G) ou du glycérol (Y), le phénomène de réduction abiotique est beaucoup plus faible : 5 à 10 % du chrome est réduit par les composants du milieu en 15 jours. Il a cependant été impossible d obtenir des cultures de la souche NH50 en milieu VB avec du glucose alors qu en M63G, avec et sans chrome (VI), les cellules n ont aucune difficulté à développer un mycélium. Les micro-organismes, lorsqu ils sont cultivés in vitro, peuvent perdre certaines caractéristiques. C est le cas pour les bactéries pathogènes qui peuvent perdre leur caractère de virulence lorsqu elles sont cultivées pendant plusieurs générations dans les milieux de culture standards en laboratoire (Brown et Williams, 1985). Il est donc envisageable que la souche S. thermocarboxydus NH50 ait perdu la capacité à croître en milieu VB. Compte tenu de ces résultats, le milieu M63 sera utilisé pour l étude de la réduction du chrome (VI). Figure 8 : Coloration du milieu M63 glycérol contenant initialement 1 mm de Cr(VI) : à gauche : témoin abiotique et à droite : après 15 jours de culture de la souche Streptomyces thermocarboxydus NH50 (après réduction du Cr(VI)) La souche de Streptomyces thermocarboxydus NH50 se développe en milieu M63 (glucose ou glycérol) 98

110 RÉSULTATS CARACTÉRISATION DE LA SOUCHE S. THERMOCARBOXYDUS NH50 ET DE SA RÉSISTANCE AU CHROME avec ou sans 1 mm de Cr(VI) de la même manière. En revanche pour des concentrations supérieures ou égales à 2 mm, les mycéliums se développent beaucoup plus lentement Sensibilité à différents antibiotiques Un antibiogramme de la souche NH50 a été réalisé à l Institut Pasteur à Paris, cette information pouvant être intéressante si l on s oriente vers une étude génétique de la résistance au Cr(VI) et/ou de sa bio-réduction. En effet, pour tester certaines hypothèses, il est nécessaire d introduire dans la cellule un «vecteur» (qui est une molécule d ADN portant différents gènes). Pour vérifier que le vecteur est bien présent dans la cellule, il faut pouvoir disposer d un «marqueur». En général, il s agit d un gène de résistance à un antibiotique. Pour pouvoir utiliser un vecteur portant le gène de résistance à un antibiotique X, il faut donc, au préalable, avoir vérifié que la souche que l on veut étudier ne présente pas le phénotype «résistant à l antibiotique X». La souche S. thermocarboxydus NH50 a été étalée sur une boîte de Petri contenant du milieu riche NE de façon à former un tapis cellulaire confluent plutôt que des clones isolés. De petits disques imprégnés de différents antibiotiques ont ensuite été déposés à la superficie de l agar et on observe la zone d inhibition de la croissance de la souche S. thermocarboxydus NH50 autour des disques après 5 jours d incubation à 30 C. La charge en antibiotique est indiquée dans le Tableau XVII. Les résultats montrent que la souche NH50 est sensible à la streptomycine, à l hygromycine à la kanamycine, à la gentamycine, le choramphénicol et au thiostrepton (Tableau XVII et Figure 9). Ces différentes sensibilités rendent envisageable l étude génétique de la résistance au Cr(VI) ou de sa réduction en permettant de réaliser une mutagenèse ou des transformations avec différents vecteurs. La souche tolère très bien l acide nalidixique ce qui permet d envisager une conjugaison Escherichia coli - Streptomyces où l acide nalidixique sert à tuer les bactéries Gram négatif, en l occurrence E. coli. La sensibilité à la gentamycine, à la kanamycine et au thiostrepton permet d envisager une mutagenèse au hasard grâce au plasmide psit151, portant les gènes de résistance à ces trois antibiotiques, que l on introduira dans la souche NH50. Nous avons testé la sensibilité de la souche NH50 à ces trois antibiotiques aux concentrations recommandées par le protocole de P.J Dyson (communication personnelle). Les spores ont été étalées sur milieu gélosé R5 et incubées une nuit à 30 C. 1 ml d une solution d antibiotique a ensuite été ajouté le lendemain de manière à avoir une concentration finale de 8 µg.ml -1 pour la gentamycine, 20 µg.ml -1 pour la kanamycine et 0,5 µg.ml -1 pour le thiostrepton. La souche NH50 n a pas pu croître sur les boîtes contenant les différents antibiotiques. La sensibilité au chloramphénicol permet d envisager une expérience de conjugaison entre Streptomyces thermocarboxydus NH50 et S. lividans TK24 (et entre NH50 et S. albus hsp18::tsr à cause de la sensibilité au 99

111 RÉSULTATS CARACTÉRISATION DE LA SOUCHE S. THERMOCARBOXYDUS NH50 ET DE SA RÉSISTANCE AU CHROME thiostrepton déjà mentionnée). Tableau XVII : Antibiogramme de la souche Streptomyces thermocarboxydus NH50 Antibiotiques Charge Zone d inhibition de la croissance en cm Acide nalidixique 30 µg 0 Ampicilline 10 µg 0 Chloramphénicol 30 µg 1,2 Erythromycine 15 UI 0,4 Gentamycine 10 UI 0,5 Hygromycine 100 µg 0,65 Kanamycine 20 µg 0,4 Néomycine 20 µg 0,4 Pristinamycine ND 0,5 Spiramycine 100 UI 0,7 Streptomycine 500 µg 1,1 Thiostrepton 20 µg 0,9 Tobramycine 10 µg 0,5 Viomycine 20 µg 0,3 100

112 RÉSULTATS CARACTÉRISATION DE LA SOUCHE S. THERMOCARBOXYDUS NH50 ET DE SA RÉSISTANCE AU CHROME Figure 9 : Antibiogrammes de la souche S. thermocarboxydus NH50 sur milieu NE après 5 jours Recherche d un éventuel plasmide L électrophorèse en champ pulsé (Pulse Field Gel Electrophoresis ou PFGE) a été utilisée pour déterminer si la souche endogène possède ou non un plasmide. En effet, les Streptomyces peuvent contenir de très grands plasmides de plusieurs centaines de kb. La technique consiste à inclure dans de l agarose des mycéliums de Streptomyces afin d obtenir un «plug» ou «insert». Celui-ci est traité au lysozyme pour rendre la membrane des cellules perméable et permettre la migration dans un gel d agarose sous l influence d un champ électrique de tout l ADN (chromosomique et extra-chromosomique). Il est possible de digérer l ADN c est-à-dire le fractionner en plusieurs fragments grâce à l utilisation d enzyme de restriction. Si l ADN n est pas digéré, le chromosome est beaucoup trop grand pour pénétrer dans le gel. Par contre s il existe des plasmides, compte tenu de leur taille plus réduite (comparé au chromosome), ils pourront entrer dans le gel et migrer à une distance inversement proportionnelle à leur taille. Pour la souche NH50, la migration de l ADN total non digéré a révélé la présence : d une bande proche du puits de dépôt que l on appelle «front de résolution». (voir Figure 10). Cette bande correspond à de grands fragments d ADN chromosomique qui résultent d un clivage non enzymatique. En effet l ADN est une molécule fragile qui sous l action d un champ électrique peut se casser. Ce front de migration est retrouvé dans tous les gels après migration quelque soit la souche bactérienne considérée. Son intensité dépend de la qualité de la préparation : si la préparation de l ADN a été réalisée plusieurs mois avant la migration, l ADN est beaucoup plus fragile et le nombre de fragment sera beaucoup plus important mais elle dépend aussi de la charge dans le puits de dépôt : si les inserts utilisés contiennent beaucoup de mycéliums, le front de résolution sera beaucoup plusimportant. d une molécule d ADN extra-chromosomique que nous avons appelé pln01 (Figure 10) dont la taille a été estimée à 40 kb par comparaison avec un marqueur de taille. Puits de dépôt Front de résolution pln01 migration 101

113 RÉSULTATS CARACTÉRISATION DE LA SOUCHE S. THERMOCARBOXYDUS NH50 ET DE SA RÉSISTANCE AU CHROME Figure 10: Electrophorèse en champ pulsé de la souche S. thermocarboxydus NH50. Programme : 6 V/cm, 20 s-40 s pendant 20 h. (-, sans traitement à la pronase ; +, traitement à la pronase). Pour tester la linéarité de la molécule, deux approches ont été testées. D abord des temps de pulsation différents ont été appliqués. Si la molécule était circulaire, elle aurait une migration aberrante par rapport à un marqueur de taille de molécules linéaires (concatémères du phage lambda) (Kinashi et al., 1987). Or pln01, pour des temps de pulsations différents, migre toujours à la même distance relative du marqueur de taille. La deuxième approche est le traitement à la pronase. En effet pour observer des plasmides circulaires, il n est pas nécessaire de traiter les inserts à la pronase car il n y a pas de protéine liées de manière covalente à ce type de molécule. Sur la Figure 10, on peut observer que l ADN extrachromosomique n est visible que dans l échantillon noté (+), c est-à-dire celui qui a été débarrassé des protéines terminales par traitement à la pronase. Les deux approches suivies indiquent donc que l ADN extra-chromosomique de la souche NH50 est une molécule linéaire. L analyse de l ADN (+), c est-à-dire traité à la pronase, de la souche S. thermocarboxydus AT37 (dont la séquence du gène codant l ARN16S est identique à plus de 99,9 % à celle de NH50) a révélé l absence de molécules extra-chromosomiques. AT37 ne possèdent donc pas le plasmide pln Conclusion La souche bactérienne isolée au laboratoire capable de résister à 1 mm de Cr(VI) sur milieu gélosé et capable de le réduire en milieu liquide a été identifiée comme étant un Streptomyces thermocarboxydus. Elle a été nommée NH50. Elle possède un grand nombre des caractéristiques du genre des Streptomyces : formation de mycéliums et sporulation sur milieu approprié, formation de mycéliums en milieu liquide, ancrage dans la gélose et dégagement d une odeur de «sous-bois» très caractéristique de ce genre bactérien. La souche NH50 est capable de réduire le chrome en milieux liquides minimum et riche. L antibiogramme de la souche a révélé une sensibilité pour le chloramphénicol, la kanamycine, la gentamycine et le thiostrepton ce qui permet d envisager une étude génétique utilisant ces différents antibiotiques comme marqueurs de sélection. L analyse de l ADN de cette souche a révélé la présence d une molécule d ADN extra-chromosomique (plasmide) linéaire d environ 40 kb qui est absente dans la souche Streptomyces thermocarboxydus AT

114 RÉSULTATS CARACTÉRISATION DE LA SOUCHE S. THERMOCARBOXYDUS NH50 ET DE SA RÉSISTANCE AU CHROME 3. Résistance au chrome Les plasmides des Streptomyces peuvent porter les gènes de résistance à différents antibiotiques (ainsi que les gènes de synthèse des antibiotiques) mais aussi des gènes de résistance à des métaux lourds. La souche S. thermocarboxydus NH50 ayant été isolée à partir d un sol pollué au chrome et à d autres métaux (plomb...) pourrait donc avoir ses gènes de résistance au chrome sur le plasmide linéaire pln01 identifié précédemment. Cette hypothèse a donc été testée. Nous avons étudié la résistance au chrome de la souche S. thermocarboxydus NH50 et nous l avons comparée à celle d autres souches de Streptomyces. Comme la souche NH50 a été isolée d un sol pollué par de nombreux métaux outre le chrome, nous avons aussi testé la toxicité de ceux-ci. Ensuite, différentes approches ont été suivies pour trouver le déterminisme du phénotype de résistance au chrome (VI). Des expériences de curage du plasmide pln01, de conjugaison et de mutagenèse ont été entreprises dans cet objectif Étude préliminaire Résistance comparé de différentes souches de Streptomyces Des boîtes de Petri contenant exactement 25 ml de milieu LB ont été utilisées pour cette expérience. Un tapis de différentes souches de Streptomyces (voir Tableau XVIII) a été étalé et un puits de 0,5 cm de diamètre a été pratiqué dans l agar, au centre de la boîte. 100 µl d une solution de Cr(VI) 1M ont été déposés dans le puits et ont diffusé dans l agar. Les boîtes ont été incubées pendant 5 à 7 jours à 30 C. La zone d inhibition a ensuite été mesurée. Les résultats sont reportés dans le Tableau XVIII. Tableau XVIII : Diamètres (cm) des zones d inhibition et de ralentissement de la croissance de différentes souches de Streptomyces sur boîtes de Petri de milieu LB contenant 100 µl de Cr(VI) 1 M (sous forme de K 2 CrO 4 ) après 7 jours à 30 C. Zone d inhibition 1 Zone de ralentissement de la croissance 2 S. lividans TK24 2,6 2,6 S. glaucescens DSM ,4 6,2 S. griseus 3,5 6,5 pas de tapis mais des colonies isolées S. albus 3,8 5 pas de tapis mais des colonies isolées S. thermocarboxydus NH50 0 4,2 1 : absence de tapis cellulaire. 2 : tapis cellulaire moins dense. 103

115 RÉSULTATS CARACTÉRISATION DE LA SOUCHE S. THERMOCARBOXYDUS NH50 ET DE SA RÉSISTANCE AU CHROME On note que parmi les 5 souches testées, NH50 est la seule souche qui puisse pousser sur toute la superficie de la boîte (pas de zone d inhibition). Pour les autres souches, on observe une zone comprise entre 2,4 et 3,8 cm où aucun clone n est apparu. L existence d une zone d inhibition de la croissance bactérienne pour 4 autres souches de Streptomyces montre que la souche NH50 est bien plus résistante au chrome que les autres. Pour 3 des 4 autres souches, on observe, outre une zone d inhibition totale, une zone de ralentissement de la croissance où des colonies, parfois isolées pour les souches S. griseus et S. albus, arrivent tout de même à pousser. Pour les deux souches S. griseus et S. albus, il peut s agir de mutants du système de transport du sulfate sélectionnés par la présence de chrome. Pour la souche NH50, il existe aussi une zone de ralentissement de la croissance dans laquelle le tapis bactérien est moins dense que celui du pourtour de la boîte. La concentration testée en Cr(VI) (1 M) n empêche pas le développement de la souche NH50, mais le ralentit un peu Détermination de la concentration létale 50 en chrome Cette concentration, appelée CL50, correspond à la concentration en chrome (VI) pour laquelle 50 % des bactéries meurent. Un nombre connu de spores est étalé sur boîte de Petri LB sans chrome et avec des concentrations croissantes en chrome. Les colonies sont comptées après incubation à 30 C pendant 5 à 7 jours. Comme le montre le Tableau XIX, c est la souche NH50 qui se montre la plus résistante puisque sa CL50 est 5 à 50 fois plus élevée que celles des autres souches testées. Pour les souches S. lividans et S. albus, il suffit d 1 mm de chrome pour tuer des cellules. La souche S. thermocarboxydus AT37, qui est la souche la plus proche (génotypiquement pour l ARN16S) de la souche S. thermocarboxydus NH50, montre un niveau de résistance au chrome relativement important par rapport aux souches S. lividans et S. albus mais tout de même inférieur d un facteur 5 à celui de la souche NH50. Tableau XIX : Concentration létale 50 (CL50) de Cr(VI) (apporté sous forme de K 2 CrO 4 ) pour 4 souches de Streptomyces sur milieu solide LB. souches de Streptomyces CL50 (mm de Cr(VI)) S. thermocarboxydus NH50 50 S. lividans TK24 1 S. thermocarboxydus AT37 10 S. albus 1 Le même type d expériences a été réalisé avec d autres milieux (M63, R5...). Les résultats s avèrent différents selon le type de milieux en ce qui concerne la valeur de la concentration inhibitrice en Cr(VI), mais les résultats relatifs sont les mêmes : NH50 est toujours la souche la plus résistante testée parmi les 4 souches de Streptomyces testées. Par exemple, sur le milieu R5, NH50 pousse sans aucune difficulté avec 104

116 RÉSULTATS CARACTÉRISATION DE LA SOUCHE S. THERMOCARBOXYDUS NH50 ET DE SA RÉSISTANCE AU CHROME 2 mm de Cr(VI), les clones deviennent très petits sur un milieu contenant 5 mm de chrome (VI) et ne poussent plus du tout à 10 mm de chrome. En parallèle AT37 ne pousse plus à 5 mm de chrome alors que sur milieu LB, il fallait atteindre la concentration de 10 mm de chrome pour avoir 50 % de létalité. La composition du milieu influe donc sur le niveau de résistance au chrome. Dans un milieu très riche comme le milieu R5, les ions métalliques peuvent se complexer avec les composants organiques du milieu (extrait de levure par exemple) (Ramamoorthy et Kushner, 1975). Ainsi, une partie des ions chromate est piégée. La concentration en ions chromate libres est inférieure à la concentration ajoutée dans le milieu. Pour la suite des expériences nous choisirons de tester la résistance au chrome sur boîte contenant du milieu LB car les différences de phénotypes sont beaucoup plus facilement observables (moins d ambiguïté quant à l analyse des résultats) que sur le milieu R Résistance à d autres métaux lourds Le sol, à partir duquel a été isolée la souche NH50, contenait des quantités importantes de cadmium et de cuivre (14 et 552 mg.kg -1 de matières sèches respectivement) 1. La souche NH50 pourrait être résistante à certains des autres métaux présents dans ce sol. Pour tester cette hypothèse, nous avons comparé les niveaux de résistance au cadmium et au cuivre de la souche NH50 à ceux d autres bactéries du genre Streptomyces. Des boîtes de Petri contenant exactement 25 ml de milieu LB ont été ensemencées avec des spores de Streptomyces afin d obtenir après croissance un tapis cellulaire. 100 µl d une solution à 0,1 M de cadmium ou de cuivre (sous forme de CdCl 2 et CuCl 2 ) ont été déposés dans le puits au centre de la boîte. L incubation se fait dans les mêmes conditions que pour les expériences avec le chrome (voir 3.1.1). On remarque que les deux métaux testés entraînent une inhibition de la croissance plus ou moins importante pour toutes les souches testées y compris pour la souche S. thermocarboxydus NH50 (Tableau XX). Si NH50 se différencie des autres souches de Streptomyces testées par son niveau de résistance au chrome (VI) plus élevé, son niveau de résistance au cadmium Cd 2+ et au cuivre Cu 2+ est quasi identique à celui des autres souches testées. NH50 est notamment aussi sensible au cadmium et au cuivre que la souche AT37 dont elle est très proche. 1 Ces valeurs sont au moins 4 fois plus importantes que les teneurs maximales autorisées si le sol était un sol agricole destiné à l épandage de boues de stations d épuration. (voir Bibliographie, Chapitre II, 3) 105

117 RÉSULTATS CARACTÉRISATION DE LA SOUCHE S. THERMOCARBOXYDUS NH50 ET DE SA RÉSISTANCE AU CHROME Tableau XX : Diamètre (cm) de la zone d inhibition de la croissance de différentes souches de Streptomyces sur boîtes de Petri de milieu LB contenant 100 µl de Cd 2+ (sous forme de CdCl 2 ) et Cu 2+ (sous forme de CuCl 2 ) après 7 jours à 30 C Cadmium Cuivre S. lividans TK24 4,3 5,0 S. glaucescens DSM ,0 5,1 S. thermocarboxydus AT37 3,6 4,6 S. griseus 3,1 4,7 S. albus 4,8 5,8 S. thermocarboxydus NH50 3,8 4, Etude de la résistance au chrome Comme nous l avons décrit dans la partie bibliographique, la résistance au chrome chez les bactéries peut être le résultat de la mutation du système de transport du sulfate ou la conséquence de l expression d une protéine ChrA qui transporte, vers le milieu extra-cellulaire, les chromates qui ont pénétré dans la bactérie. Dans ce dernier cas, le gène chra est porté par un plasmide de grande taille chez Ralstonia et Pseudomonas, deux bactéries à Gram négatif (Cervantes et al., 1990 ; Nies et al., 1990). Nous rappelons ici que la réduction du Cr(VI) en Cr(III) ne sera pas traitée comme un mécanisme de résistance au chrome car ces deux phénomènes (résistance et réduction) ne sont pas nécessairement liés. En effet, les extraits cellulaires d une souche de Pseudomonas fluorescens, ayant perdu le plasmide lui conférant le phénotype Chr R, sont capables de réduire le chrome (VI) de manière aussi efficace que ceux de la souche résistante au chrome (Bopp et Ehrlich, 1988). Chez P. fluorescens LB300, la réduction du chrome (VI) n est pas un mécanisme de résistance. Etant donné que nous ne disposons pas de clones Chr S dérivant de la souche NH50, nous ne pouvons pas déterminer, pour cette souche, si la résistance au chrome (VI) est liée à la réduction des ions chromates Transport du sulfate La mutation du système de transport du sulfate donne aux bactéries un phénotype Chr R. Ces bactéries, dans lesquelles ni les ions CrO 2-4 ni les ions SO 2-4 ne peuvent pénétrer, doivent assimiler le soufre par une autre voie. Il faut donc, dans le cas de la mutation du système de transport du sulfate, donner aux bactéries une autre source de soufre. Le milieu peut contenir de la cystéine ou de la méthionine, deux acides aminés contenant un atome de soufre dans leur chaîne latérale. Leur catabolisme donnera à la bactérie le soufre nécessaire pour la synthèse d autres molécules. Les bactéries ayant une mutation du système de transport du sulfate sont donc incapables de croître sur un milieu contenant 106

118 RÉSULTATS CARACTÉRISATION DE LA SOUCHE S. THERMOCARBOXYDUS NH50 ET DE SA RÉSISTANCE AU CHROME uniquement du soufre sous forme de sulfate (hétérotrophie). La souche NH50, résistante au chrome, a pu être cultivée sur un milieu ne contenant que du sulfate comme source de soufre (M63G). Il n est donc pas nécessaire d apporter le soufre sous une autre forme. Il semble donc que le système de transport du sulfate de NH50 ne soit pas modifié et que la résistance au chrome obéisse à un autre mécanisme Recherche du support génétique responsable de la résistance au chrome a Curage du plasmide Comme nous l avons vu précédemment, nous avons mis en évidence dans NH50 la présence d un plasmide, appelé pln01, dont la taille est d environ 40 kb. Compte tenu du niveau de résistance au chrome (VI) plus élevé chez la souche NH50 par rapport à d autres souches du même genre dépourvues de plasmide (S. lividans TK24, S. thermocarboxydus AT37, S. albus), on peut envisager que le gène responsable de la résistance soit porté par l ADN extra-chromosomique. Pour tester cette hypothèse, nous avons tenté d obtenir des clones de la souche NH50 Chr S (sensibles au chrome (VI)) pour les analyser ensuite par PFGE afin de déterminer si la sensibilité acquise est liée à la perte du plasmide pln01 (curage du plasmide). Cette méthode consiste à essayer de provoquer la perte du plasmide en perturbant la cellule bactérienne. Les protoplastes sont des cellules vivantes obtenues après action du lysozyme, enzyme qui dégrade les polysaccharides de la paroi cellulaire. Les protoplastes qui ne possèdent que la membrane plasmique sont donc beaucoup plus fragiles. Il faut les manipuler avec précaution (éviter les chocs osmotiques, thermiques et mécaniques) pour ne pas lyser les cellules. Les cellules débarrassées de leurs polysaccharides vont nécessairement orienter leur métabolisme vers la synthèse de ceux-ci lorsqu elles seront incubées sans lysozyme. Les plasmides, quant à eux, se répliquent grâce à des enzymes synthétisées par la cellule. Si l on perturbe le métabolisme d une cellule en l orientant vers la synthèse de polysaccharides au détriment des autres voies cataboliques et anaboliques, on peut perturber la réplication des plasmides et ainsi générer des clones qui auront perdu le plasmide initialement présent dans la souche NH50. La régénération des protoplastes peut avoir lieu à 30 ou à 40 C. L élévation de 10 de la température d incubation peut aussi changer le métabolisme de la cellule et conduire à la perte du plasmide. Pour cette expérience, deux souches de NH50 ont été utilisées : la souche «sauvage» NH50 et la souche transformée par incorporation du plasmide psit151 (voir Chapitre I 2.3), qui porte les gènes de résistance à la gentamycine et à la kanamycine. La souche transformée contient toujours le plasmide pln01 (vérifié par PFGE). La souche NH50 psit151 permet de nous assurer que nous travaillons bien avec cette souche tout au long de l expérience puisque nous pouvons tester la résistance aux deux 107

119 RÉSULTATS CARACTÉRISATION DE LA SOUCHE S. THERMOCARBOXYDUS NH50 ET DE SA RÉSISTANCE AU CHROME antibiotiques. Des protoplastes sont étalés après dilution sur des boîtes contenant du milieu R5 avec un antifongique afin d éviter la contamination de celle-ci par des champignons. En effet à la différence des spores que l on étale sur le même type de boîtes pour obtenir des sporées et qui ne nécessite que deux étapes (prélèvement et étalement), la préparation et la régénération de protoplastes requièrent l utilisation de plusieurs solutions de traitement, ainsi qu une étape d étalement dit «doux» qui nécessite le séchage de la boîte de Petri sous hotte, autant de manipulation susceptibles de contaminer les préparations. Après 5 à 8 jours, les clones isolés sont repiqués sur boîte R5. Le «patch» ainsi obtenu (ensemble des clones à tester «rangés» sur milieu R5) est ensuite répliqué sur velours sur lequel on applique des boîtes contenant le milieu LB 10 mm de Cr(VI) (choisi pour tester la résistance au chrome, voir 3.1.2) et R5 Gm Kan (gentamycine et kanamycine aux concentrations respectives de 1 et 5 µg.ml -1 ) pour tester la résistance aux deux antibiotiques. Parmi les clones repiqués, certains peuvent avoir perdu la résistance au chrome. Il convient de déterminer si la perte de résistance au chrome est liée à la perte du plasmide en faisant une électrophorèse en champ pulsé pour le rechercher dans les clones sensibles. Parmi 250 clones testés, issus de protoplastes régénérés de souche NH50, aucun n a présenté de phénotype Chr S (sensibilité au Cr(VI)). Nous avons aussi travaillé avec des dérivés de la souche NH50 portant les gènes de résistance à des antibiotiques (plasmide psit151). L avantage de travailler avec des souches portant de tels marqueurs est la possibilité de vérification rapide des phénotypes pour s assurer que l on obtient des clones dérivant bien de la souche parentale. Les souches NH50 psit151 et ses dérivés obtenus, appelés TI (pour transposon induit) après induction de la transposase, ont été utilisés. La construction de ces souches sera détaillée dans le paragraphe c page 114. La régénération de protoplastes de ces souches n a pas permis non plus d obtenir des clones Chr S (80 clones dérivés de NH50 psit151, 1493 protoplastes régénérés à 30 C et 650 régénérés à 40 C dérivés des TI). Nous n avons donc pas pu obtenir de dérivés de la souche NH50 qui soient sensibles au chrome. Deux interprétations sont possibles : - le plasmide a effectivement pu être perdu dans certains clones mais le phénotype Chr R n est pas associé. Dans ce cas, le gène conférant la résistance au chrome n est pas sur le plasmide. - aucun protoplaste régénéré n a perdu le plasmide compte tenu d une très grande stabilité de celui-ci dans la cellule ou l intégration de celui-ci dans le chromosome. Dans ce dernier cas, le gène conférant la résistance au chrome (VI) est sur le plasmide pln01 qu il n a pas été possible de curer. 108

120 RÉSULTATS CARACTÉRISATION DE LA SOUCHE S. THERMOCARBOXYDUS NH50 ET DE SA RÉSISTANCE AU CHROME En admettant qu environ 1 % des protoplastes régénérés perdent le plasmide (P. Mazodier, communication personnelle), l étude de plus de 2000 clones auraient dû nous permettre d obtenir une dizaine de clones Chr S si le gène responsable du phénotype Chr R était sur le plasmide pln01. Mais il est difficile de dire si la technique de curage du plasmide utilisée est efficace. Dans le cas où le gène codant la résistance au chrome serait sur le chromosome, le seul moyen de vérifier qu environ 1 % des clones, issus de la régénération de protoplastes, a perdu le plasmide pln01 (sur lequel nous n aurions aucun marqueur de sélection) serait de faire une électrophorèse en champ pulsé avec 300 à 400 clones pour espérer en observer 3 ou 4 sans le plasmide (l étude d autant de clones n est pas envisageable). L absence du phénotype Chr S chez les clones ayant été obtenus par cette méthode ne permet pas de conclure quant à l implication ou non du plasmide pln01 dans le phénotype de résistance au chrome (VI) pour la souche de Streptomyces thermocarboxydus NH50. b Conjugaison Certaines bactéries sont capables de transférer leur plasmide à travers un pont cytoplasmique vers d autres bactéries en général du même genre. On appelle ce processus «conjugaison». La conjugaison nécessite un contact des bactéries suffisamment long pour permettre le passage de l ADN extrachromosomique (plasmide) de la souche dite donneuse vers la souche dite receveuse. Nous disposons au laboratoire de la souche NH50 résistante au chrome qui possède un plasmide susceptible de porter le gène de résistance au chrome. Nous disposons aussi de souches beaucoup plus sensibles au chrome : Streptomyces lividans TK24 qui est résistante au chloramphénicol et Streptomyces albus hsp18::tsr (le gène hsp18 est interrompu par le gène de résistance au thiostrepton). Ce seront les souches receveuses. Pour ce type d expériences, il faut un moyen de sélectionner les clones qui auraient acquis le plasmide portant éventuellement la résistance au chrome. Dans notre cas, après conjugaison, la souche donneuse NH50 ne sera pas sélectionnée car elle est sensible aux 2 antibiotiques qui permettent la discrimination et les souches receveuses sont avant la manipulation sensibles au chrome. Si l on utilise un milieu contenant du chrome et un des deux antibiotiques on ne sélectionnera que les souches receveuses ayant acquis la résistance au chrome (Figure 11). Il convient de déterminer si les clones portent ou non le plasmide de la souche NH50 en utilisant le PFGE. Le Tableau XXI montre que seule la souche NH50 est capable de croître sur un milieu gélosé LB contenant des concentrations supérieures à 5 mm de Cr(VI) sans provoquer de létalité. Pour les deux souches receveuses, à partir de 5 mm aucun clone ne pousse. La souche TK24 a été étalée à partir d une 109

121 RÉSULTATS CARACTÉRISATION DE LA SOUCHE S. THERMOCARBOXYDUS NH50 ET DE SA RÉSISTANCE AU CHROME sporée dense sur des boîtes LB 10 mm de chrome + Cm. Sur les boîtes témoins (sans chrome), un tapis cellulaire s est développé. En revanche, sur les boîtes 10 mm Cr(VI) + Cm (chloramphénicol), des clones très petits sont apparus. Ces clones, repiqués sur des boîtes contenant 10 mm de chrome, ne se sont pas développés. En parallèle, la souche NH50 a été étalée dans les mêmes conditions (10 mm Cr(VI) + Cm, tapis cellulaire) et aucun clone n a pu se développer. Compte tenu de ces résultats, l expérience de conjugaison entre TK24 et NH50 a tout de même été tentée puisque sur les boîtes 10 mm de Cr(VI) + Cm ne pourront croître que les TK24 conjuguants et les clones qui seront très petits pourront être éliminés car ne ils ne poussent plus lorsqu ils sont repiqués. En parallèle, la résistance aux antibiotiques a été testée pour les 3 souches en étalant des sporées denses de chacune des souches. Nous avons vérifié que la souche NH50 était sensible au thiostrepton (10 µg.ml -1 ) et au chloramphénicol (50 µg.ml -1 ) et que les souches TK24 et S. albus hsp18::tsr étaient résistantes au chloramphénicol et au thiostrepton respectivement. 110

122 RÉSULTATS CARACTÉRISATION DE LA SOUCHE S. THERMOCARBOXYDUS NH50 ET DE SA RÉSISTANCE AU CHROME SOUCHE DONNEUSE Plasmide pln01 chr R SOUCHE RECEVEUSE, ex : TK24 cm Chromosome linéaire S. thermocarboxydus NH50 Chromosome TK24 LB 10 mm Cr LB Cm LB 10 mm Cr LB Cm Colonies Absence de colonies Absence de colonies Colonies Témoins LB 10 mm Cr + Cm Témoins Le chloramphénicol (Cm) empêche la croissance de la souche donneuse Chromosome linéaire cm Plasmide pln01 Le chrome empêche la croissance de la souche receveuse CONJUGANT : S. lividans TK24 résistant au chrome Figure 11 : Principe de la conjugaison entre bactéries. Hypothèse : NH50 posséderait le gène de la résistance au chrome sur le plasmide pln01. Tableau XXI : Détermination de la valeur de la concentration en chrome (VI) pour la sélection des conjugants. Nombre de colonies en fonction de la concentration en chrome (VI) dans le milieu LB souches Concentration en Cr(VI) (mm) S. thermocarboxydus NH S. lividans TK S. albus hsp18::tsr Pour les expériences de conjugaison, deux protocoles ont été testés, le premier consistant à mettre en 111

123 RÉSULTATS CARACTÉRISATION DE LA SOUCHE S. THERMOCARBOXYDUS NH50 ET DE SA RÉSISTANCE AU CHROME contact des spores prégermées (A) et le deuxième des spores non prégermées (B). Protocole A : des spores prégermées des deux souches (donneuse et receveuse) ont été mise en contact pendant 5 heures. Pour cette expérience, seuls les croisements entre la souche NH50 utilisée pure et mise en contact avec une suspension, pure ou diluée par un facteur 10 2 et 10 4, de spores prégermées de S. albus hsp18::tsr ont donné une vingtaine de clones à la fois résistant au thiostrepton et au chrome. Les clones ont été repiqués sur le milieu R5 pour permettre la sporulation et répliqués ensuite sur les milieux sélectifs LB 5 mm de Cr(VI) et R5 Tsr. Aucun des clones qui avait poussé dans la première partie de l expérience n a maintenu sa résistance au chrome. Protocole B : la deuxième méthode consiste à mettre en contact les spores non prégermées des deux souches. Le croisement s effectue sur la boîte de Petri, et les spores qui résultent de ce croisement sont sélectionnées sur LB 10 mm de chrome + antibiotique. Les croisements ont été réalisés avec les deux types de souches receveuses : Streptomyces albus hsp18::tsr et Streptomyces lividans TK24. Du premier croisement 69 clones ont poussé mais après repiquage, aucun n a conservé le phénotype Chr R. Les croisements avec la souche TK24 ont donné deux types de clones : de minuscules clones semblables à ceux que nous avions déjà observé en effectuant les témoins (TK24 sur LB 10 mm de Cr(VI) + Cm) et une centaine de clones (99) deux à trois fois plus gros. Les petits clones ont aussi été analysés mais aucun d entre eux n a gardé la résistance au chrome. Les 99 autres clones ont été repiqués. Ces clones possèdent bien le phénotype de la souche receveuse car ils présentent une pigmentation rose et la résistance au chloramphénicol. 58 des 99 clones ont maintenu la résistance au chrome après repiquage et réplique. Dix d entre eux ont été analysés en PFGE mais aucun ne possèdent le plasmide de 40 kb (Figure 12). Ce résultat a été confirmé par l analyse d inserts de C8 et C10 contenant davantage d ADN. En effet, l absence de bande sur un gel de PFGE correspondant au plasmide pln01 peut être due à l absence du plasmide recherché mais aussi au fait que les inserts ne contiennent pas beaucoup d ADN. Pour vérifier l absence de plasmide, la préparation des cellules qui seront incluses dans l agarose est faite à partir de deux cultures distinctes et les puits sont chargés avec des quantités d inserts variables. La mise en cause de la mutation du système de transport du sulfate qui confère bien le phénotype Chr R peut être exclue car les clones (C1 à C8) ont été répliqués par la méthode de l empreinte sur velours sur un milieu ne contenant du soufre que sous forme de sulfate et tous les clones analysés en PFGE (C1 à C10) ont pu croître sans aucune difficulté. Si ces clones sont des mutants, la mutation qui confère la résistance au chrome n implique donc pas le système de transport du sulfate. C est un autre mécanisme, inconnu, qui est mis en jeu. On peut penser que le plasmide pln01 serait stable dans la souche donneuse NH50 (et donc visible en PFGE) mais que lorsqu il passe dans la souche receveuse TK24, il s intègre au chromosome. 112

124 RÉSULTATS CARACTÉRISATION DE LA SOUCHE S. THERMOCARBOXYDUS NH50 ET DE SA RÉSISTANCE AU CHROME Pour vérifier cette dernière hypothèse, il conviendrait de fabriquer une sonde du plasmide pln01 et de l hybrider avec l ADN chromosomique des clones de TK24 résistants au chrome. Cependant, nos tentatives pour récupérer le plasmide pln01, afin de le marquer et de l hybrider, n ont pas abouti. Les extractions n ont pas donné suffisamment de matériel pour effectuer les expériences. Il est en effet assez difficile de récupérer un fragment d ADN de grande taille. Par ailleurs, on peut envisager que le plasmide pln01 soit effectivement passé dans la souche receveuse TK24, qu il ne soit pas intégré dans le chromosome de la souche hôte mais qu il soit devenu invisible à l analyse par PFGE. Il arrive en effet que dans certaines souches bactériennes, chez Erwinia par exemple, des plasmides soient présents dans la cellule mais que l extraction d ADN plasmidique ne révèle aucune molécule d ADN extra-chromosomique. L existence du plasmide dans la bactérie est vérifiée par l analyse du phénotype et par la conjugaison. Il est possible de transférer un plasmide portant un gène de résistance à une molécule X depuis Escherichia coli vers Erwinia. L analyse des clones d Erwinia portant la résistance à la molécule X ne montre aucun plasmide, mais, la conjugaison des clones d Erwinia avec une souche d E. coli sensible à X, permet d obtenir des clones d E. coli résistants à X et l analyse des clones par extraction d ADN plasmidique montre alors la présence du plasmide initial (G. Condemine, communication personnelle). Il est possible qu un mécanisme analogue ait lieu dans notre cas pour le transfert de pln01 depuis NH50 vers TK24 même si ce phénomène n a pas été décrit pour le genre Streptomyces. On peut bien sûr s interroger sur l existence de ce mécanisme chez deux souches du même genre bactérien d autant plus que des expériences de conjugaison entre une autre souche (CHR28) portant un plasmide (prj28) conférant la résistance au mercure et la souche TK24 ont été réalisées et l analyse de l ADN des ex-conjugants possédant le phénotype résistant au chloramphénicol et au mercure a révélé la présence du plasmide (Ravel et al., 1998). Néanmoins pour tester notre hypothèse, il faudrait réaliser une conjugaison avec les clones C1 à C10 comme souches donneuses avec des spores d une souche de NH50 qui serait sensible au chrome (mais que nous n avons pas réussi à obtenir) ou encore avec les spores d un nouveau stock de S. lividans TK24 qui porterait un autre marqueur de sélection que le chloramphénicol et qui après conjugaison avec la souche CHR28 permettrait l observation du plasmide. 113

125 RÉSULTATS CARACTÉRISATION DE LA SOUCHE S. THERMOCARBOXYDUS NH50 ET DE SA RÉSISTANCE AU CHROME C10 C8 TK24 NH50 pln01 migration Figure 12 : PFGE de Streptomyces thermocarboxydus NH50, de Streptomyces lividans TK24 et des clones 8 et 10 obtenus après conjugaison entre NH50 et TK24. c Mutagenèse Les expériences de mutagenèse au hasard consistent à introduire un plasmide dans une cellule bactérienne afin qu il aille s intégrer de manière aléatoire dans le chromosome ou dans l ADN extrachromosomique de celle ci. On cherche à interrompre le gène d intérêt (ici le gène responsable de la résistance au chrome) par insertion du plasmide intégratif. Dans notre étude, c est le plasmide circulaire psit151 qui a été introduit dans la souche NH50 par transformation. Ce plasmide, donné par P.J. Dyson 1, possède une origine de réplication d E. coli et une de Streptomyces. Ceci signifie que chez E. coli, les enzymes de la réplication de l ADN vont reconnaître l origine de réplication spécifique d E. coli et vont pouvoir copier le plasmide pour en faire plusieurs copies. On dit que chez E. coli, il est multicopie et peut être ainsi obtenu en grande quantité. Chez Streptomyces, le plasmide peut être maintenu dans la bactérie à condition de ne pas incuber les clones à plus de 40 C. A partir de cette température, la réplication est perturbée et le plasmide libre sera perdu. Les séquences portées par ce plasmide ne peuvent être conservées par la bactérie Streptomyces qu à condition que le plasmide qui les porte s intègre dans le chromosome. L intégration d un ADN étranger dans le génome d une bactérie requiert des séquences particulières portées par le plasmide que l on regroupe sous le terme de transposon. L insertion est réalisée par une enzyme (la transposase) dont le gène est contenu dans le transposon du plasmide psit151. L intégration du transposon entraîne l intégration des gènes se trouvant à proximité (dans notre cas les gènes conférant les résistances à la kanamycine (aphii), à la gentamycine (aaci) et au thiostrepton (tsr)). Ainsi la souche transformée, NH50 psit151 possède les résistances aux trois antibiotiques (Figure 13). 1 University of Wales, Swansea, United Kingdom 114

126 RÉSULTATS CARACTÉRISATION DE LA SOUCHE S. THERMOCARBOXYDUS NH50 ET DE SA RÉSISTANCE AU CHROME β-la XhoI AVANT INTÉGRATION Ori(E) EcoRI IR-R psit151 (11,4 kb) aphii ADN cible aac IR-L PstI EcoRI transposon tsr Ori(S) APRÈS INTÉGRATION EcoRI XhoI EcoRI PstI aaci β-la aphii tsr aaci IR-L IR-R transposon IR-L IR-R 1,6 kb 11,4 kb 13 kb Figure 13 : Plasmide circulaire psit151 et séquences intégrées dans l ADN cible après induction de la transposase avec aaci : gène de résistance à la gentamycine ; aphii : gène de résistance à la kanamycine ; tsr : gène de résistance au thiostrepton ; EcoRI, XhoI et PstI sont des sites de restriction.. Après transformation et récupération des spores de la souche NH50 psit151, un tapis de spores est étalé sur des boîtes R5 Tsr 0,5 µg.ml -1 qui permet d induire la synthèse de la transposase et provoque l insertion du transposon. Les boîtes sont incubées pendant 6 heures à 30 C pour permettre aux spores de commencer leur germination puis transférées à 40 C pendant 5 à 7 jours. L élévation de température permet d éliminer les clones de la souche NH50 psit151 qui possèdent le plasmide sous forme non intégrée. Les seuls clones obtenus sont a priori ceux dont le psit151 s est intégré dans le génome (Figure 14). Les clones sont d abord «patchés» sur milieu R5 puis répliqués sur les milieux contenant les antibiotiques pour vérifier les phénotypes. Ils sont appelés TI pour Transposon Induit. 115

127 RÉSULTATS CARACTÉRISATION DE LA SOUCHE S. THERMOCARBOXYDUS NH50 ET DE SA RÉSISTANCE AU CHROME 1107 clones TI ont été analysés par réplique sur velours sur milieu LB à 10 mm de Cr(VI) et R5 Gm 1 µg.ml -1 Kan 5 µg.ml -1. Moins de 1 % des clones sont devenus sensibles au chrome alors qu environ 6,7 % des clones testés ont présenté des phénotypes de sensibilité à la gentamycine et à la kanamycine. La stabilité des phénotypes résistants aux antibiotiques, conférés par le plasmide psit151 intégré est assez mauvaise. Il n y a priori aucune raison de perdre ces résistances sauf si le plasmide qui s est intégré s excise. L excision peut être suivie d une intégration du plasmide ailleurs dans le génome. Bien sûr, si la réintégration de ce plasmide ne se fait pas après l excision, il est perdu, ce qui pourrait expliquer la perte de résistance aux antibiotiques. Si cette hypothèse est vraie, la stabilité du psit151 intégré dans notre souche NH50 peut-être mise en doute et les clones devenus sensibles au chrome pourraient très bien redevenir résistants au chrome par la suite. Néanmoins, l ADN des 11 clones TI Chr S dérivant de la NH50 après induction de la transposition du psit151 a été analysé par PFGE. Si notre hypothèse est vraie, c est-à-dire si la résistance est portée par un gène localisé sur le plasmide pln01, le psit151 devrait s être intégré dans le plasmide linéaire pln01 dans les clones TI sensibles au chrome. L analyse par PFGE devrait alors révéler la présence dans ces clones d un plasmide linéaire plus grand de 13 kb supplémentaires par rapport à celui de la souche NH50. En revanche, si le gène est porté par le chromosome, il faudrait alors entreprendre de travailler sur l ADN chromosomique, en réalisant une hybridation d une sonde du plasmide psit151 avec l ADN digéré de la souche NH50 sensible au chrome (VI) pour localiser le(s) gène(s) responsable(s) du phénotype Chr R. 116

128 RÉSULTATS CARACTÉRISATION DE LA SOUCHE S. THERMOCARBOXYDUS NH50 ET DE SA RÉSISTANCE AU CHROME NH50 tsr aaci aphii Plasmide circulaire psit151 transposase Plasmide linéaire pln01 tsr aaci aphii Chromosome linéaire TRANSFORMATION transposase NH50 psit151 On a introduit, dans la souche NH50, le plasmide psit151 qui porte les gènes de résistance à la gentamycine (aaci), à la kanamycine (aphii) et au thiostrepton (tsr). On obtient après transformation de la souche NH50, une souche NH50 qui contient toujours le plasmide linéaire pln01 et désormais le plasmide circulaire psit151. Ces clones NH50 psit151 ont été sélectionnés sur un milieu contenant de la gentamycine et de la kanamycine. LB tsr 0,5 µg.ml -1 à 40 C Chromosome linéaire cas possibles Plasmide pln01avec le plasmide psit151 intégré pln01 Chromosome linéaire avec le psit151 intégré Streptomyces thermocarboxydus NH50 avec transposon induit Figure 14 : Principe de la mutagenèse au hasard avec le plasmide psit151 dans la souche NH

129 RÉSULTATS CARACTÉRISATION DE LA SOUCHE S. THERMOCARBOXYDUS NH50 ET DE SA RÉSISTANCE AU CHROME Puits de dépôts NH50 TI1 TI2 TI3 TI4 TK24 TI5 TI6 Front de résolution migration pln01 Figure 15 : Gel de PFGE agarose 0,9 %, programme s pendant 20 h de l ADN + de Streptomyces thermocarboxydus NH50, des dérivés TI Chr S et de la souche Streptomyces lividans TK24 La Figure 15 montre les résultats obtenus avec 6 des mutants Chr S. Les 5 autres clones ont donné le même type de profil («en échelle»). L expérience a été réalisée avec des inserts d agarose très chargés en ADN ce qui explique la densité importante de la bande correspondant au front de migration. On peut noter que la densité de la bande correspondant au front de migration de l ADN de NH50 est comparable à celle de l ADN des transposons induits TI. On peut remarquer que tous les TI ont un profil inattendu. En effet, nous nous attendions à deux types de résultats. Le premier : le plasmide psit151 se serait intégré au plasmide pln01, auquel cas la bande correspondant au pln01 aurait disparue et la nouvelle bande attendue serait d environ 55 kb. La deuxième possibilité était que le plasmide psit151 se soit intégré dans le chromosome et dans ce cas, la bande de 40 kb serait présente et donc au même niveau que la bande témoin correspondant au pln01. Or nous observons ici un phénomène assez étrange. Les 11 clones présentent au moins 2 bandes correspondant à 2 molécules d ADN extra-chromosomique (Figure 15). La bande qui a le plus migré correspond au pln01 puis les autres semblent correspondre à 2 copies bout à bout de ce plasmide, la troisième bande à 3 copies etc

130 RÉSULTATS CARACTÉRISATION DE LA SOUCHE S. THERMOCARBOXYDUS NH50 ET DE SA RÉSISTANCE AU CHROME migration lambda TI1 Figure 16 : gel de PFGE avec l ADN non digéré du phage lambda et de TI1. Nous avons déposé dans un gel de PFGE l ADN du clone TI1 et l ADN du phage lambda dont la molécule d ADN forme des concatémères. Comme le montre la Figure 16, le profil de migration de concatémères est similaire au profil obtenu avec nos clones TI. Si l on relève les distances de migration et que l on applique la relation : Log (taille du fragment) = f(distance de migration) on obtient pour le phage lambda une droite d équation y = -0,13 x + 5,85 avec un coefficient de corrélation linéaire d environ 0,97 (ce qui n est pas si mauvais si l on considère le fait que les fragments sont très grands (multiples de 47,8 kb pour lambda) et les distances de migration faibles). Lorsque l on estime, grâce à l équation de droite obtenue précédemment la taille du pln01, on trouve une taille d environ 41,7 kb ce qui est en accord avec l estimation déjà faite au préalable par le Pr. Leblond à Nancy. Si l on relève la distance de migration des fragments plus grands et qu on leur attribue une taille multiple de 41,7 kb, nous obtenons une équation reliant les log de la taille des fragments à la distance de migration qui est assez proche de celle obtenue avec le phage lambda : -0,16 x + 6,14 avec un coefficient de corrélation de 0,97. Nous pouvons donc dire que les fragments du profil du clone TI1 ont un comportement électrophorétique semblable à celui de concatémères. Il a été vérifié par hybridation avec une sonde du plasmide psit151 marquée qu aucune copie de celui-ci ne s était intégré au plasmide pln01. Il s avère donc que les «transposons induits» devenus Chr S possèdent des concatémères du plasmide pln01. L intensité de bande correspondant au plasmide pln01 est beaucoup moins importante que celle des bandes de même taille observées pour les TI. Ceci peut être dû au fait que les inserts d agarose de la souche NH50 avaient été conservés une année à 4 C et le délai écoulé entre la préparation des inserts et leur utilisation peut diminuer la qualité de l ADN et donc celle de la révélation par le bromure d éthidium. Les premières expériences réalisées dans le but de récupérer de grandes quantités du plasmide pln01 pour en faire une sonde avait nécessité la préparation et l utilisation d inserts d agarose contenant de très grande quantité d ADN. Dans ces conditions (inserts préparés juste avant utilisation et fortement chargés en ADN), la souche NH50 n avait pas présenté de profil en «échelle». 119

131 RÉSULTATS CARACTÉRISATION DE LA SOUCHE S. THERMOCARBOXYDUS NH50 ET DE SA RÉSISTANCE AU CHROME Le profil des clones TI est assez difficile à expliquer. L existence de concatémères chez certains virus s explique par le mode de réplication en cercle roulant (rolling circle replication). C est le cas pour le phage lambda. Pendant son cycle lytique, il y a une synthèse importante de molécules d ADN qui sont des copies de l ADN du phage qui seront ensuite encapsidées pour produire de nouveaux virus. La réplication de l ADN viral selon le modèle du cercle roulant conduit à la formation de concatémères qui sont en fait plusieurs copies du génome viral les unes derrière les autres. Pour l encapsidation de l ADN viral dans la tête du phage, les sites cos (cohesive end site) des concatémères se fixent sur les protéines qui forment l entrée de la tête du phage et l ADN compris entre ces sites cos entre à l intérieur du phage. La linéarité des molécules d ADN dans le monde bactérien semble être une conséquence de l évolution. Il semblerait qu elle résulte de l insertion de plasmides linéaires dans le chromosome. Et ces plasmides linéaires eux mêmes dériveraient de bactériophages. Les plasmides et les virus possèdent une caractéristique commune : ce sont de petites molécules d ADN, comparées à un chromosome, dont la réplication est autonome. Pour que le plasmide soit transmis à la descendance d une bactérie, il doit posséder sa propre origine de réplication. Une autre ressemblance est son mode de réplication. Lorsque les molécules d ADN sont linéaires, elles possèdent des extrémités particulières. Chez Borrelia, les extrémités des plasmides et du chromosome sont en «épingle à cheveux», structure télomérique que l on retrouve chez des virus d animaux comme le poxvirus. La présence de protéines attachées de manière covalente aux extrémités 5 est rencontrée chez Streptomyces mais aussi chez le bactériophage Φ29 de Bacillus subtilis. Les virus, pour se répliquer, peuvent se circulariser. Il semble que le même phénomène se produise chez les bactéries possédant des molécules linéaires (Volff et Altenbuchner, 2000). Si l on considère les ressemblances entre les virus et les plasmides linéaires bactériens, on peut imaginer que la réplication de certains plasmides comprend une phase où l ADN est sous forme de concatémères. Cette hypothèse, pour les Streptomyces, pourrait se justifier par la particularité de leur mode de développement. En effet, les Streptomyces forment des mycéliums dont les hyphes sont polyploïdes avant la septation pour la formation de spores haploïdes. Il est possible que durant la formation du mycélium aérien, les copies du plasmide soient sous forme de multimères qui seront monomérisés lors de la formation de spores individualisées. La multimérisation permettrait de protéger, contre l action des endonucléases par exemple, un grand nombre d extrémités de plasmides puisque ne seraient susceptibles d être modifiées que celles se trouvant aux extrémités du concatémère. La concatémérisation permettrait de palier à une déplétion en protéines terminales liée au 5 de la molécule d ADN. Il est possible qu en introduisant dans la souche NH50 le transposon du plasmide psit151, celuici soit allé s intégrer dans un gène impliqué dans la monomérisation des concatémères qui est donc perturbée chez les clones TI. Ceci ne serait vrai que dans le cas où effectivement le plasmide pln01 se 120

132 RÉSULTATS CARACTÉRISATION DE LA SOUCHE S. THERMOCARBOXYDUS NH50 ET DE SA RÉSISTANCE AU CHROME répliquerait selon un mode «cercle roulant» conduisant à la formation de multimères. Il demeure troublant que la présence des concatémères soit associée au phénotype Chr S. On peut toutefois imaginer que le gène conférant la résistance au chrome se trouve sur le plasmide pln01 à l une de ces extrémités. La présence de gènes de résistance est en effet souvent localisée aux extrémités des molécules d ADN. Cette organisation peut s expliquer par la nécessité qu ont les bactéries à transférer de l information génétique vers d autres bactéries en fonction des variations des conditions du biotope. La concatémérisation «obligée» du plasmide chez les clones TI empêcherait alors le gène de résistance d être transcrit normalement. Il est en effet possible qu au niveau de deux plasmides associés, l ADN prenne une conformation tridimensionnelle limitant ou empêchant l accessibilité aux gènes adjacents à cette région des enzymes nécessaires à la transcription. Bien sûr, dans le profil des clones TI, le plasmide pln01 monomérique existe. Mais sa présence seule ne suffirait peut-être pas à produire en quantité suffisante la ou les protéines impliquées dans le mécanisme de résistance au chrome Conclusion La résistance au Cr(VI) de la souche Streptomyces thermocarboxydus NH50 isolée du sol pollué a été testée et comparée à celle présentée par d autres souches de Streptomyces. Cette étude a révélé que la souche NH50 peut pousser sur des milieux gélosés contenant des concentrations en Cr(VI) jusqu à dix fois plus élevées que pour d autres souches du même genre bactérien. En revanche, le niveau de résistance à d autres métaux (Cu 2+, Cd 2+ ) de la souche NH50 est du même ordre de grandeur que celui des autres Streptomyces testés. Les mécanismes de résistance au chrome, étudiés dans la partie bibliographique, peuvent être liés soit à la mutation du système de transport du sulfate, soit à la présence de la protéine ChrA dont le gène chra est porté par un plasmide (chez Alcaligenes et Pseudomonas). Chez la souche NH50, le système de transport du sulfate ne semble pas impliqué. Concernant la deuxième hypothèse possible, plusieurs approches ont été utilisées. La régéneration de protoplastes (qui peut conduire à la perte de plasmide chez les Streptomyces) n a pas permis d obtenir de clones sensibles au chrome. Les expériences de conjugaison avec Streptomyces lividans TK24 Chr S ont permis d obtenir des conjugants Chr R mais l analyse de leur ADN n a pas révélé de molécule extra-chromosomique. Enfin, les expériences de mutagenèse au hasard (par insertion d un tranposon) ont permis d obtenir des clones Chr S mais l analyse de leur ADN n a pas montré d insertion du tranposon dans le plasmide pln01 mais a montré la concatémérisation de celui-ci. Même si nos résultats ne le prouvent pas, il est possible que le phénotype de résistance au chrome soit lié à la présence du plasmide pln01. Les résultats obtenus ne permettent pas d exclure la possibilité que le plasmide porte le (ou les) gène(s) responsable de la résistance aux ions chromate. 121

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134 RÉSULTATS RÉDUCTION DU CHROME (VI) EN SOLUTION PAR NH50 EN CULTURES PURES II. RÉDUCTION DU CHROME (VI) EN SOLUTION PAR NH50 EN CULTURES PURES 1.Introduction Il existe, dans les sols, un phénomène d atténuation naturelle de la pollution qui dépend du polluant et des propriétés physiques, chimiques et microbiologiques du sol. Pour les pollutions au chrome (VI), la teneur en matières organiques du sol (acides humiques et acides fulviques) et la teneur en fer ferreux peuvent influencer la réduction du Cr(VI) en Cr(III). Les sols pollués aux métaux lourds contiennent souvent une grande variété de micro-organismes capables de diminuer l impact de la pollution sur l environnement par transformation des composés polluants en composés moins mobiles et/ou moins toxiques. En parallèle des phénomènes chimiques de réduction du Cr(VI), des processus de réduction biologique, peuvent se dérouler, liés à la présence de microorganismes vivants qui peuvent métaboliser différentes molécules. C est dans cette démarche que s inscrit la présente étude conduite à partir d un sol prélevé en Région Rhône-Alpes. Des études préliminaires menées au laboratoire LAEPSI ont montré que l activité biologique contenue dans ce sol pouvait être mise à profit pour réduire la toxicité et la mobilité du chrome (VI) (XI ème contrat de Plan Etat-Région, 2000). En incubant ce sol pollué au chrome (VI) en milieu minéral VB pendant 10 jours à 30 C avec apport de glucose, Stevko Radovic (1996) a observé 100 % de réduction. Cette culture a été stockée pendant 6 mois à 4 C. Elle a ensuite été utilisée par Nathalie Huck pendant son DEA (1997) pour isoler le micro-organisme responsable de la réduction du chrome (VI). À partir d une suspension de sol en milieu minéral VB enrichie en glucose (10g.L -1 ) inoculée par la suspension de 1996, N. Huck a observé une disparition quasi complète (> 99 %) du chrome (VI) dans les essais (concentrations initiales en Cr(VI) 0,5 et 1 mm) en 3 jours à 30 C. En parallèle, un témoin abiotique (sol autoclavé, sans inoculum) a confirmé que la réduction observée dans les autres essais non stériles était due à la présence dans le sol de micro-organismes vivants. Les essais où la réduction avait été la plus efficace ont servi à isoler le micro-organisme responsable de la réduction (N. Huck, 1997, XI ème contrat de Plan Etat-Région, 2000). Nous avons essayé, au début de cette thèse, de reproduire ces résultats à partir de suspension de sol (conservé à 4 C). Le problème rencontré a été qu avec le même milieu VB, le pourcentage de réduction obtenu alors s est avéré beaucoup plus faible (+ de 15 jours pour obtenir 50 % de réduction contre 3 jours dans les premières expérimentations). Ce ralentissement du phénomène de réduction peut s expliquer par le fait que le stockage à 4 C du sol pendant 2 ans a entraîné un appauvrissement de la flore microbienne. De plus, comme nous l avons mentionné dans le chapitre I des Résultats, en culture pure, la souche de Streptomyces thermocarboxydus NH50 a de grandes difficultés à croître dans ce milieu. Pour nos 123

135 RÉSULTATS RÉDUCTION DU CHROME (VI) EN SOLUTION PAR NH50 EN CULTURES PURES expériences, nous avons donc testé un autre milieu minéral, le milieu M63. Nous avons, grâce à celui-ci, pu observer des phénomènes de réduction plus rapides qu en milieu VB mais cependant moins «spectaculaires» que ceux obtenus par S. Radovic et N. Huck. Nous avons choisi de travailler en cultures pures à une concentration de 1 mm car au-delà de cette concentration, les mycéliums de Streptomyces thermocarboxydus NH50 ont de grandes difficultés à se développer. A. Lauriat (1998) a montré, par analyse XANES et EXAFS, que la disparition du chrome (VI) dans les échantillons de N. Huck avec l isolat pur était une réduction du chrome (VI) en Cr(III) et non pas le résultat d une adsorption du chrome (VI) sur les membranes de la biomasse qui se développe (XI ème contrat de Plan Etat-Région, 2000). Par conséquent, la disparition du chrome (VI) dans les échantillons sera généralement appelée réduction dans ce qui suit même si en pratique, on mesure la disparition du chrome hexavalent et non l apparition de la forme trivalente. 2.Effet de différents paramètres 2.1. Effet de la taille de l inoculum Afin d étudier le phénomène de réduction du chrome par la souche de Streptomyces thermocarboxydus NH50, il était intéressant de connaître la taille optimale de l inoculum pour voir apparaître le phénomène assez rapidement. Les Streptomyces sont conservés sous forme de spores qu il est facile de dénombrer. Il suffit de faire des dilutions successives du stock initial et d étaler une fraction de ces dilutions sur boîte pour connaître le nombre de spores capables de former une colonie sur milieu solide. Il est beaucoup plus aisé de déterminer la concentration en spores du stock initial que de dénombrer les cellules en croissance dans un milieu liquide. En effet ces bactéries forment des mycéliums et dans ces conditions, un prélèvement homogène est impossible à réaliser ce qui empêche une analyse quantitative en cours de croissance. Pour tester l effet de la taille de l inoculum, nous avons ensemencé 100 ml de milieu M63 enrichi avec une source de carbone (glucose ou glycérol) en triplicat pour chacune des dilutions. Les spores sont ajoutées à raison de 400 µl de suspensions mères de concentration , , , spores.ml -1 pour obtenir respectivement les concentrations initiales de , , , spores.ml -1. Il n a pas été possible d obtenir de stock de spores de concentration de l ordre de spores.ml -1. En effet, lorsque l on récupère les spores en grattant une culture ayant poussé sur le milieu approprié (voir Matériel et Méthodes), on peut récupérer une sporée de concentration de l ordre de spores.ml -1 maximum. Pour obtenir le stock initial à , il a fallu utiliser 10 sporées à , les centrifuger et les reprendre toutes dans un volume final de 1 ml. Pour le stock à , il faudrait une centaine de sporées ce qui demande un travail considérable difficile à reproduire en routine. 124

136 RÉSULTATS RÉDUCTION DU CHROME (VI) EN SOLUTION PAR NH50 EN CULTURES PURES La Figure 17 montre les résultats obtenus en présence de sources de carbone différentes. On peut remarquer que les cinétiques de réduction sont plus rapides en présence de glycérol qu en présence de glucose. En ce qui concerne l effet de la taille de l inoculum, on observe logiquement que plus il est important, plus la réduction est rapide. Pourtant si on travaille avec 10 fois plus de cellules, le phénomène ne se produit pas 10 fois plus vite. Pour la suite des expériences, nous avons choisi d ensemencer les cultures avec un minimum de spores.ml -1 ce qui nous permet d utiliser les sporées directement sans avoir à les concentrer tout en obtenant une vitesse initiale de réduction assez élevée. % de Cr(VI) restant 4 jours E4 4.E5 4.E6 4.E7 4.E4 4.E5 4.E6 6 jours 4.E glycérol 3 g/l glucose 10 g/l Figure 17 : Effet de la taille de l inoculum (concentrations initiales en spores.ml -1 dans le milieu) sur la réduction du chrome (VI) par la souche Streptomyces thermocarboxydus NH50 en présence de glycérol 3 g.l -1 ou de glucose à 10 g.l -1. Après 4 et 6 jours d incubation à 30 C sous agitation 120 rpm en milieu minéral M63 avec 1 mm de chrome (VI) de concentration initiale Effet de la source de carbone Les premières études en culture pure ont montré que la souche NH50 réduisait plus vite le chrome (VI) en présence de glycérol (3 g.l -1 ) qu en présence de glucose (10 g.l -1 ) (Figure 17). Avec du glycérol, on observe une réduction totale en moins de 10 jours (concentration initiale de 1 mm de Cr(VI) en milieu minéral M63) contre plus de 18 jours avec du glucose (Figure 18) alors que les concentrations initiales en spores sont identiques et la quantité de cellules dans les Erlenmeyers après 10 jours de culture est comparable. Ce résultat peut s expliquer par l effet de la nature de la source de carbone sur l expression de certains gènes de la bactérie. Il existe de nombreux exemples de répression catabolique par le glucose dans le monde bactérien. Il est possible que l activité réductrice de la souche NH50 soit soumise à l effet du glucose. 125

137 RÉSULTATS RÉDUCTION DU CHROME (VI) EN SOLUTION PAR NH50 EN CULTURES PURES Des expériences antérieures avec du sol pollué au chrome (Figure 28) avaient cependant montré que la réduction ne pouvait avoir lieu que si le milieu était complémenté en glucose. La réduction du chrome en présence de glycérol n était alors pas significative ce qui indique qu en présence de sol, le glucose est une meilleure source de carbone pour permettre aux bactéries de réduire le chrome contrairement à ce qu on observe en cultures pures. Lorsque l on travaille avec du sol et une flore endogène mixte, il existe de nombreux paramètres difficilement appréciables. Il est possible que le glycérol, en présence de sol, ne soit pas disponible pour la souche qui réduit le chrome. Le glycérol a pu être métabolisé par les autres micro-organismes présents au détriment de la souche qui réduit le chrome. Lorsque la réduction du chrome sera étudiée avec des suspensions de sol, la source de carbone sera le glucose. En revanche, compte tenu des meilleurs résultats obtenus en présence de glycérol en culture pure, la suite des manipulations avec S. thermocarboxydus NH50 sera réalisée avec du milieu minéral M63 glycérol appelé M63Y. Nous avons tenté d augmenter la vitesse de réduction du chrome en augmentant les quantités de glycérol. Si l on travaille à 4,5 g.l -1 soit une fois et demi plus de glycérol, il n est toutefois pas possible d obtenir une réduction plus rapide. mg/l de Cr(VI) en solution ,2 1 0,8 0,6 0,4 0, jours mm de Cr(VI) en solution Glucose (10 g/l) Glycérol (3 g/l) Figure 18 : Cinétique de bio-réduction du chrome (VI) en culture pure de Streptomyces thermocarboxydus NH50 inoculé sous la forme de spores à spores.l -1 (milieu nutritif M63, [glc] i = 10 g.l -1 ou [Y] i = 3 g.l -1, 30 C, obscurité, [Cr(VI)] i = 50 mg.l -1, 18 jours d incubation). 126

138 RÉSULTATS RÉDUCTION DU CHROME (VI) EN SOLUTION PAR NH50 EN CULTURES PURES 2.3. Effet d autres métaux La souche de S. thermocarboxydus avec laquelle nous travaillons a été isolée à partir d un sol pollué par d autres métaux que le chrome. Il faut donc envisager que la présence de ces métaux puisse jouer un rôle sur l efficacité de la réduction. Il est possible que les métaux présents empêchent la réduction par un phénomène de toxicité ou l accélèrent si la molécule qui réalise la transformation du Cr(VI) en Cr(III) nécessite un atome métallique comme dans le cas des métallo-enzymes. Nous avons testé le nickel, le cadmium et le cuivre sous forme divalente. Ces métaux ont été ajoutés sous forme de chlorure aux concentrations de 0,1 et 0,5 mm à des cultures de NH50 de 4 jours en M63Y contenant initialement 1 mm de Cr(VI). Le chrome (VI) contenu dans les cultures a été dosé 24 heures après l ajout des ions métalliques. Des témoins contenant du milieu M63Y sans bactérie ont été traités de la même manière. Aucun d entre eux n a permis la disparition du chrome (VI) dans les échantillons. Dans les essais avec les cultures de NH50, le cadmium et le nickel n ont eu aucun effet comparé au témoin sans métal même après 3 jours (Erreur! Source du renvoi introuvable.). Par contre, le cuivre Cu 2+ a permis d avoir 100 % de réduction en 24 heures. Nous avons répété l expérience avec du cuivre sous forme de sulfate (CuSO 4 ) et l effet a été le même qu avec le CuCl 2. L action du cuivre peut être double : soit il augmente la synthèse de la ou des molécules responsables de la réduction du chrome (en induisant par exemple l expression d un ou plusieurs gènes), soit il participe directement à la réaction de réduction (par exemple comme cofacteur enzymatique). Dans une nouvelle série d expériences, le cuivre a été ajouté à 0,1 mm dès le début de la culture. Dans ces conditions, il n y a eu aucun développement bactérien. Le Cu 2+, à la concentration de 0,1 mm est toxique et ne permet pas d obtenir de culture bactérienne et donc d observer le phénomène de réduction du chrome (VI). Si le cuivre est ajouté en même temps que les spores de S. thermocarboxydus NH50, le pourcentage de réduction du chrome ne dépasse pas 5 % (pourcentage comparable à celui du témoin abiotique) (voir Erreur! Source du renvoi introuvable.). Il semble donc, compte tenu de son caractère très toxique vis-à-vis de la souche NH50, que le cuivre agisse plutôt directement sur la réaction de réduction du chrome que sur l expression de l activité réductrice elle-même. 127

139 RÉSULTATS RÉDUCTION DU CHROME (VI) EN SOLUTION PAR NH50 EN CULTURES PURES Tableau XXII : Pourcentage de réduction du Cr(VI), en présence de Ni 2+, Cd 2+ ou de Cu 2+ de cultures de S. thermocarboxydus NH50 après 3 jours d incubation à 30 C en milieu M63Y. Les cations métalliques sont ajoutés sous forme de NiCl 2 6H 2 O, CdCl 2 H 2 O et CuCl 2 2H 2 O à la concentration de 0,1 mm. Le chrome est ajouté sous forme de K 2 CrO 4 à la concentration de 1 mm. Ajout dès le début de la culture Ajout après 4 jours de culture Contrôles abiotiques Cu 2+ Ni 2+ Cd 2+ Cu 2+ aucun Ni 2+ / Cd 2+ /Cu 2+ ou sans métal <5 % <5 % Note : 100 % de réduction avec le cuivre Cu 2+ ont été observés dans les premières 24 heures Nous avons voulu savoir si la spéciation sous laquelle se trouvait le cuivre était importante. Nous avons donc pour cela utilisé des cultures de 3 jours en milieu M63Y de différentes souches de Streptomyces ( spores.l -1 initiale). Nous avons ensuite ajouté dans le milieu du Cr(VI) (à la concentration de 1 mm) et du cuivre sous forme Cu + ou Cu 2+ à la concentration de 0,1 mm à partir de solutions 100 fois concentrées. Le Cu + est ajouté à partir d une solution de CuCl dans de l acide chlorhydrique car il est très peu soluble dans l eau (0,0047 g pour 100 g d eau (Handbook, 82nd Edition)). Pour pouvoir interpréter les résultats, nous avons réalisé un témoin qui nous permet de juger de l effet du changement de ph. En effet, en ajoutant du CuCl, le ph du milieu qui est de 6,8 chute à 2 à cause de l acide. Si nous observons un effet, il faut pouvoir déterminer qui du Cu + ou du changement de ph est responsable de l effet. Les résultats sont présentés dans le Tableau XXIII. Tableau XXIII : Effet du Cu 2+ et du Cu + à la concentration de 0,1 mm ajoutés dans des cultures de 3 jours de Streptomyces thermocarboxydus NH50, S. lividans TK24 et S. cœlicolor (milieu M63Y, 30 C). Le Cr(VI) est ajouté en même temps que le cuivre à la concentration de 1 mm. Pourcentage de réduction du chrome après 3 jours Pas d ajout Cu 2+ Cu + (ph 2) HCl (ph 2) S. thermocarboxydus NH /- 2 99,7 +/ / /- 5 S. lividans TK / / /- 3 S. coelicolor 31 +/ / /-5 abiotique 1 +/-1 4 +/-2 3 +/-3 Les témoins abiotiques ne permettent pas de réduire le Cr(VI) présent en solution. En revanche, toutes les cultures des différentes souches de Streptomyces permettent la réduction du chrome (VI). Cette expérience montre que plusieurs souches de Streptomyces sont capables de réduire le chrome. Cependant S. thermocarboxydus NH50 s avère la plus efficace. Nous observons toujours l effet positif du cuivre Cu 2+ sur la réduction du chrome (bien que de manière limitée pour S. lividans et S. cœlicolor) ce qui laisse supposer que le mécanisme de réduction est 128

140 RÉSULTATS RÉDUCTION DU CHROME (VI) EN SOLUTION PAR NH50 EN CULTURES PURES semblable chez les trois souches testées. L ajout de Cu + a un effet faible chez NH50 et n a pas d effet chez les autres souches pour lesquelles les pourcentages de réduction sont comparables à ceux observés sans cuivre. Le témoin NH50 + HCl montre que l acidification du milieu n empêche pas la réduction du chrome d avoir lieu. 3.Etude de la localisation de l activité réductrice 3.1. Localisation de l activité réductrice Selon les espèces bactériennes, l activité chromate réductase peut être attribuée à une enzyme membranaire ou cytoplasmique. Das et Chandra (1990) ont montré qu une souche de Streptomyces réduisait enzymatiquement le chrome. Chez cette souche, c est la fraction membranaire qui est responsable de l activité réductrice. Nous avons utilisé pour cette étude des cultures de deux semaines à 30 C de la souche S. thermocarboxydus NH50 en milieu M63 glycérol (M63Y) avec une concentration initiale en Cr(VI) de 1 mm. Les cellules ont été récupérées par centrifugation douce (2000 g) et les surnageants ont été filtrés à 0,22 µm afin d éliminer toutes les bactéries. La concentration en Cr(VI) est alors ajustée à 1 mm dans les surnageants. Nous avons vérifié que dans les conditions testées, le milieu minéral contenant du glycérol ne permet pas de réduire le chrome (VI) en une semaine même en présence de cuivre. La Figure 19 montre qu environ 40 % du chrome est réduit en 24 heures dans les échantillons sans que la présence des cellules ne soit requise. La ou les molécules responsable(s) de la réduction du chrome ne sont donc pas présentes uniquement dans les cellules. Il s agit de molécules libérées dans le surnageant de culture. Les culots cellulaires ont été resuspendus dans du milieu M63 glycérol contenant 1 mm de Cr(VI) et il a fallu attendre une semaine pour observer de nouveau un phénomène de réduction du chrome d environ 50 % Effet des ions Cu 2+ sur la réduction du Cr(VI) par des surnageants de culture Nous avons testé l effet du cuivre Cu 2+ à 20 µm sur les surnageants (Figure 19). Dans les surnageants dopés en Cu 2+, la réduction est totale en 24 heures. Le cuivre n augmente donc pas l efficacité de la réduction du chrome en induisant l expression de molécules réductrices dans la cellule bactérienne. Puisqu il a un effet sur les surnageants filtrés, c est qu il agit sur la réaction de réduction du Cr(VI) elle-même. Nous avons aussi testé l effet de l ajout d un chélatant de cations divalents, l EDTA. En présence de cet agent, le pourcentage de réduction est comparable à celui observé dans l essai ne contenant pas de cuivre. Le cuivre Cu 2+, complexé avec l EDTA, n est plus disponible pour interagir avec les molécules réductrices. 129

141 RÉSULTATS RÉDUCTION DU CHROME (VI) EN SOLUTION PAR NH50 EN CULTURES PURES 100 % de r éduction du Cr (V SCr SCr + Cu 2+ culot cellulaire M63Y + Cu 2+ Figure 19 : Pourcentage de réduction du Cr(VI) par des surnageants de culture de S. thermocarboxydus NH50 avec ou sans cuivre. SCr : pourcentage de réduction par le surnageant de culture de NH50 après 24 heures, SCr + Cu 2+ : surnageant de culture de NH µm de Cu 2+ après 24 h, culot cellulaire : culot cellulaire de NH50 après 7 jours et M63Y + 20 µm de Cu 2+ après 7 jours (témoin abiotique). Concentration initiale en chrome : 1mM. Compte tenu de l effet du cuivre observé sur les surnageants de culture, nous avons testé différentes concentrations de cuivre sous forme de CuSO 4. Nous avons utilisé de nouvelles cultures de S. thermocarboxydus NH50 et récupéré les surnageants en procédant de la même manière que précédemment. Le surnageant SCr utilisé ici provient d une culture de 10 jours en présence de 1 mm de Cr(VI). Ce surnageant a été récupéré puis du chrome (VI) a été ajouté pour ajuster la concentration initiale à 1,3 mm avant d aliquoter en différentes fractions complémentées ou non avec du Cu 2+. On incube ensuite à 4 et à 30 C et on suit la concentration en Cr(VI) en fonction du temps. Les résultats sont présentés dans la Figure

142 RÉSULTATS RÉDUCTION DU CHROME (VI) EN SOLUTION PAR NH50 EN CULTURES PURES Cr(VI), mm 1,5 1,25 1 0,75 0,5 0, jours 6 sans cuivre, 4 C sans cuivre, 30 C 5 µm Cu2+, 30 C 10 µm Cu2+, 30 C 20 µm Cu2+, 30 C Figure 20 : Réduction du Cr(VI) en fonction de la concentration en Cu 2+ par un surnageant SCr provenant d une culture de 10 jours de S. thermocarboxydus NH50 en milieu M63Y à 1 mm de Cr(VI). La cinétique de réduction du chrome est beaucoup plus lente à 4 C qu à 30 C. L augmentation de la vitesse de réaction en fonction de la température est un phénomène généralement observé dans les réactions chimiques ou biologiques. Les cinétiques de réduction du chrome sont d autant plus rapides que la concentration en Cu 2+ est importante. L ajout de 5 µm de Cu 2+ permet d obtenir 100 % de réduction en 6 jours d incubation à 30 C alors qu en absence de cuivre à la même température d incubation, la réduction du Cr(VI) n est que d environ 50 %. On remarque aussi que le pourcentage de réduction du chrome après 24 heures par le surnageant SCr avec 20 µm de Cu 2+ atteint environ 87 % contre 100 % dans l expérience précédente (Figure 19). Cette différence peut provenir du fait que les surnageants proviennent de deux cultures distinctes, ensemencées à partir de deux sporées différentes et récupérées à des temps légèrement différents (entre 10 et 15 jours). Il apparaît donc que l âge de la culture joue un rôle et influe sur la quantité de molécules disponibles pour la réduction mais l effet du Cu 2+ est comparable. 131

143 RÉSULTATS RÉDUCTION DU CHROME (VI) EN SOLUTION PAR NH50 EN CULTURES PURES Le cuivre, sous sa forme divalente, augmente de manière significative la vitesse de réduction du chrome. Cet effet n est visible que si les cellules ont poussé au préalable sans cuivre car à la concentration de 0,1 mm, celui-ci empêche le développement bactérien. Le cuivre n agit donc pas en stimulant les cellules mais interagit avec les molécules, produites et excrétées dans le surnageant, responsables de la réduction du Cr(VI). Nous avons donc testé différentes concentrations en cuivre Cu 2+ directement sur les surnageants de culture afin d observer son effet sur la vitesse de réaction. Nous avons pour cela utilisé le type de surnageant présentant la plus grande efficacité c est-à-dire le surnageant SCr. Le surnageant SCr d une culture de Streptomyces thermocarboxydus NH50 de 10 jours a été récupéré et fractionné en 4. Dans chaque aliquote, la concentration en Cr(VI) a été ajustée à 1, 2, 3 ou 4 mm respectivement. Puis chacune des différentes fractions contenant des concentrations variables en Cr(VI) ont été aliquotées par 4. Le Cu 2+, sous la forme de CuSO 4, a été ajouté à trois d entre elles aux concentrations de 20, 100 ou 500 µm. Nous avons mesuré la vitesse moyenne de réduction (en µm.h -1 ) pendant les 36 premières heures. Nous n avons pas mesuré les vitesses initiales car elles sont difficilement appréciables. En effet, pour les concentrations en Cr(VI) supérieures à 1 mm, il est nécessaire de procéder à une dilution supplémentaire pour doser le Cr(VI) avec le DPCZ. Cette dilution augmente les incertitudes sur la mesure d absorbance à 540 nm. Si nous avions utilisé les valeurs de vitesses obtenues pendant les deux premières heures par exemple, la variation de la concentration en Cr(VI) dans les échantillons fortement concentrés en chrome est assez faible et les incertitudes de la méthode assez importantes. C est pour cette raison que nous avons choisi de mesurer les vitesses moyennes après 36 heures pour les 16 conditions testées. Les résultats sont présentés dans le Tableau XXIV. Quelle que soit la concentration initiale en chrome (VI), plus la concentration en cuivre Cu 2+ est élevée, plus la vitesse moyenne est grande. Pour une concentration initiale en Cr(VI) de 1 mm, l ajout de 20 µm de Cu 2+ permet d augmenter la vitesse d un facteur 7 environ. Les vitesses, pour un ajout de 100 et 500 µm, n ont pas pu être calculées puisqu en 36 h la réduction était totale et aucun prélèvement n avait été effectué à des temps inférieurs. En revanche, nous avons pu les calculer pour des concentrations initiales en Cr(VI) de 2, 3 et 4 mm. L apport de 100 et 500 µm de CuSO 4 permet d augmenter encore davantage la vitesse de réduction du Cr(VI) mais la différence entre les vitesses mesurées à 100 et 500 µm de Cu 2+ est beaucoup plus faible que la différence observée entre les vitesses mesurées à 20 et 100 µm. Pour une concentration initiale en chrome de 2 mm, 500 µm de Cu 2+ permettent d avoir un effet maximum. Si dans ces conditions la réduction avait été totale au bout de 36 h, la vitesse calculée aurait été de 55,6 µm.h -1 (2000 µm/36 h). En revanche pour des concentrations initiales de 3 et 4 mm de Cr(VI) l effet maximal n est pas atteint en 36 h avec 500 µm de cuivre. Les vitesses obtenues sont respectivement de 59,4 et 69,7 µm.h -1 pour 3 et 4 mm de concentrations initiales en Cr(VI) en présence de 500 µm de Cu 2+ contre 83,3 et 111,1 µm.h -1 (3000 µm/36 h et 4000 µm/36 h) si la réduction avait été totale en 36 h. 132

144 RÉSULTATS RÉDUCTION DU CHROME (VI) EN SOLUTION PAR NH50 EN CULTURES PURES Tableau XXIV : Vitesses de réduction du Cr(VI) observées pendant les 36 premières heures dans le surnageant SCr avec différentes concentration en Cu 2+ Vitesse de réduction du Cr(VI) (µm.h -1 ) [Cr(VI)] ini (mm) Sans cuivre 20 µm 100 µm 500 µm 1 3,33 24,44 > 27,8 > 27,8 2 5,66 35,83 51,66 53,33 3 7,5 33,88 57,22 59,44 4 9,72 43,05 65,83 69, Effet de la présence de Cr(VI) au préalable dans les cultures Deux cultures de S. thermocarboxydus NH50 ensemencées à partir de la même sporée ont été incubées pendant 10 jours en milieu M63Y respectivement sans Cr(VI) et en présence de Cr(VI) à 1 mm. Le seul paramètre qui diffère est donc la présence au préalable de Cr(VI) dans la culture. Les surnageants respectivement notés S et SCr ont été récupérés par centrifugation et filtration à 0,22 µm puis la concentration en Cr(VI) a été ajustée à 1,3 mm et du cuivre Cu 2+ ajouté à 20 µm. Les résultats sont présentés dans le Tableau XXV ci dessous. Tableau XXV : Influence de la présence au préalable de Cr(VI) dans la culture. Pourcentage de réduction du Cr(VI) par les surnageants S et SCr en présence de 20 µm de Cu 2+ à 30 C. % de réduction du Cr(VI) 24 heures 48 heures S + 20 µm Cu 2+ 46,3 59,5 SCr + 20 µm Cu 2+ 86,9 98,5 Nous remarquons que la présence au préalable de chrome dans la culture permet d obtenir une meilleure efficacité de réduction du chrome. Tandis que le surnageant SCr + Cu 2+ permet d obtenir 98,5 % de réduction en 48 heures à 30 C, le surnageant S + Cu 2+ ne permet de réduire dans le même temps qu un peu plus de la moitié du chrome présent initialement. La présence de chrome (VI) semble activer la production dans le surnageant de la ou des molécules responsables de l activité chromate réductase. Cet effet est aussi observé lorsque les surnageants S et SCr ne sont pas complémentés par du cuivre. 133

145 RÉSULTATS RÉDUCTION DU CHROME (VI) EN SOLUTION PAR NH50 EN CULTURES PURES 3.4. Effet de la concentration initiale en Cr(VI) sur la réduction par des surnageants de cultures Les expériences présentées page 133 permettent d observer l effet de la concentration en Cr(VI) sur la vitesse de réduction du Cr(VI). Les résultats sont présentés dans le Tableau XXIV. Plus il y a de Cr(VI) dans le surnageant, plus la vitesse est importante (quelle que soit la concentration en Cu 2+ ). La concentration en substrat est donc limitante et la réaction est proche de l ordre 1. On peut supposer que la vitesse est reliée à la concentration en Cr(VI) par la relation suivante (Michaelis Menten) : v = Vm.[ Cr( VI)] Ks + [ Cr( VI)] équation 13 où Vm est la vitesse maximale et Ks est la concentration en Cr(VI) donnant ½ de Vm. Si la concentration en chrome (VI) est beaucoup plus faible que Ks, alors l équation devient une expression d ordre 1 : Vm.[ Cr( VI)] v = Ks équation 14 Nous avons donc tracé le graphique 1/v = f(1/[cr(vi)] (voir Figure 21) avec les valeurs de vitesses obtenues pour différentes concentrations initiales en Cr(VI) et sans cuivre. Dans ce cas, et dans celui ci uniquement, nous pouvons considérer que la concentration en Cr(VI) varie suffisamment peu en 36 heures pour faire l hypothèse que les vitesses moyennes mesurées sont proches des vitesses initiales de réduction du Cr(VI). Grâce à cette représentation, (dite de Lineweaver-Burk en enzymologie), nous pouvons déterminer deux paramètres : la vitesse maximale (Vm) et la constante d affinité (Ks). Les valeurs de la Vm et du Ks déterminées ainsi sont de 22,8 µm.h -1 et de 5,8 mm respectivement. Le coefficient de régression linéaire (R 2 ) de la droite d équation y = 0,258x + 0,0439 est supérieur à 0,99 ce qui signifie que les valeurs expérimentales sont proches de cette droite. Ayant obtenu des valeurs de Vm et de Ks, nous avons appliqué l équation 13 et superposé le modèle aux valeurs expérimentales. Les résultats sont présentés dans la Figure

146 RÉSULTATS RÉDUCTION DU CHROME (VI) EN SOLUTION PAR NH50 EN CULTURES PURES Les valeurs expérimentales sont très proches du modèle. Pour une concentration initiale de 4 mm en Cr(VI), l écart entre la valeur expérimentale et la valeur du modèle est plus important que pour des concentrations inférieures. La principale cause de cette différence est l incertitude sur les valeurs de concentrations mesurées dans ces essais. En effet, une concentration initiale de 1 mm en chrome nécessite pour un dosage une dilution 1/200 pour que la lecture soit dans la gamme où la loi de Beer-Lambert est vérifiée. Pour doser le Cr(VI) dans un échantillon où la concentration est beaucoup plus importante, le facteur de dilution est lui aussi augmenté. Une dilution 1/200 peut être effectuée en une étape (5 µl dans 1000 µl final), en revanche une dilution 1/1000 nécessite deux dilutions «en cascade» ce qui augmente l incertitude sur le résultat. Compte tenu de ces incertitudes, l équation qui relie la vitesse de réduction du Cr(VI) à la concentration en chrome (VI) est un bon modèle. Cette équation est l équation de Monod utilisée par Shen et Wang (1997) pour modéliser la réduction du chrome par les enzymes solubles. Nous n avons pas besoin de tenir compte de l effet toxique du chrome comme ont du le faire Shen et Wang puisque la réduction du chrome a lieu dans le surnageant exempt de toutes cellules vivantes. 1/v (h.µm -1 ) 0,4 0,3 y = 0,258x + 0,0439 R 2 = 0,9989 0,2 0,1 1/Vm 0-0,50-0,25 0,00 0,25 0,50 0,75 1,00-1/Ks 1/[Cr(VI)] (mm -1 ) Figure 21 : Représentation de Lineweaver-Burk : 1/v = f(1/[cr(vi)], avec v vitesse de réduction du chrome (36 premières heures) à différentes concentrations initiales en Cr(VI) (1, 2, 3 et 4 mm) 135

147 RÉSULTATS RÉDUCTION DU CHROME (VI) EN SOLUTION PAR NH50 EN CULTURES PURES vitesse de réduction du Cr(VI)(µM.h -1 ) valeurs expérimentales valeurs obtenues d'après le modèle [Cr(VI)] mm Figure 22 : Comparaison des valeurs expérimentales de vitesses de réduction du chrome en fonction de la concentration initiale en Cr(VI). Nous avons observé que le cuivre pouvait augmenter la vitesse de réduction du chrome. Cependant les vitesses que nous avons calculées pour différentes concentrations initiales en Cr(VI) et en Cu 2+ (Tableau XXIV) sont des vitesses moyennes très différentes des vitesses initiales (la concentration en Cr(VI) a fortement diminué en 36 h dans les essais avec du cuivre, par exemple pour une concentration initiale en Cr(VI) de 1 mm, après 36 h elle atteint une valeur de 0,12 mm en présence de 20 µm de Cu 2+ ). Nous ne pouvons donc pas traiter ces données de la même manière que précédemment (où les variations de concentrations en Cr(VI) pendant les 36 premières heures étaient suffisamment faibles pour faire l hypothèse que les vitesses mesurées étaient proches des vitesses initiales) Effet de la température d incubation Le surnageant SCr d une culture de 7 jours de la souche S. thermocarboxydus NH50 en milieu M63Y contenant 1 mm de Cr(VI) a été récupéré, filtré sur filtre Millipore 0,22 µm et la concentration en Cr(VI) ajustée à 1 mm. Huit conditions ont été testées : les différentes températures d incubation sont 4, 30, 37 et 42 C et pour chacune des températures, nous avons testé l effet de la présence de cuivre Cu 2+, sous forme de CuCl 2 à la concentration de 0,1 mm. Les pourcentages de réduction du chrome après 24 heures sont présentés dans le Tableau XXVI. Nous remarquons qu en absence de cuivre, 24 heures ne suffisent pas pour observer la réduction du chrome présent dans les essais. La quantité de molécules réductrices dans le surnageant n est donc pas suffisante pour voir le phénomène apparaître rapidement. En revanche, la présence de Cu 2+ permet d obtenir entre 9 et 52,2 % de réduction selon la température d incubation. 136

148 RÉSULTATS RÉDUCTION DU CHROME (VI) EN SOLUTION PAR NH50 EN CULTURES PURES Nous avions observé précédemment que l incubation en absence de cuivre à 4 et 30 C présentait des cinétiques différentes (voir II 3.2 et Figure 20). De la même manière, en présence de cuivre Cu 2+, l élévation de la température permet d augmenter le pourcentage de réduction du chrome (VI). Tableau XXVI : Pourcentage de réduction par le surnageant SCr après 24 heures à différentes températures températures 4 C 30 C 37 C 42 C 50 C 75 C 100 C Cu 2+ (0,1 mm) % de réduction du Cr(VI) < 5 % 9 % < 5 % 26,8 % < 5 % 38,8 % < 5 % 52,8 % 100 % 100 % 100 % Nous avons cherché la température à partir de laquelle la réduction du chrome était ralentie. En effet, plus on augmente la température, plus la vitesse de réaction augmente jusqu à une température optimale à partir de laquelle la réaction ralentit si celle-ci est enzymatique car l augmentation de la température conduit à la dénaturation des protéines. De manière générale, la température optimale d une enzyme coïncide, à plus ou moins quelques degrés, à la température optimale de croissance du micro-organisme qui la synthétise. Nous avons réalisé les incubations à 50, à 75 et à 100 C et la réduction en présence de 0,1 mm de Cu 2+ était totale en 24 heures dans les 3 conditions testées (nous n avons pas testé l effet de l élévation de la température au-delà de 42 C sans cuivre). En revanche, le traitement à 120 C pendant 20 minutes (autoclavage) du surnageant SCr avant ajout du chrome (1 mm) et du cuivre (0,1 mm) ne permet pas d observer la réduction du chrome en 24 heures. Ces résultats suggèrent que la réduction du chrome ne soit pas de nature protéique. Il nous apparaît peu probable que la protéine qui réduit le Cr(VI) en Cr(III), s il s agissait vraiment d une protéine, puisse rester active à 75 et 100 C. Pour confirmer cette hypothèse, des expériences en présence d agent dénaturant comme le sodium dodécyl sulfate ou en présence de protéases ont été réalisées. 4.Etude de la nature de la (des) molécule(s) responsable(s) de la réduction du Cr(VI) 4.1. Recherche de molécules protéiques Action de protéases Ces expériences ont été réalisées avec le surnageant SCr d une culture de S. thermocarboxydus NH50 de 10 jours afin de déterminer si les molécules responsables de la réduction du chrome sont de nature protéique ou non. Les protéases sont des enzymes qui dégradent les protéines. Si l activité chromate réductase est due à une protéine, alors, en présence de protéase, la réduction du chrome sera beaucoup plus faible voire nulle. 137

149 RÉSULTATS RÉDUCTION DU CHROME (VI) EN SOLUTION PAR NH50 EN CULTURES PURES La première protéase testée est la protéinase K (Sigma) à la concentration de 0,1 mg.ml -1. Le pourcentage de réduction a été mesuré après 90 minutes et après 20 h d incubation à 30 C. La Figure 23 présente le pourcentage de chrome (VI) restant dans les essais à différentes concentrations en Cu 2+ comprises entre 20 et 500 µm.. En absence de protéinase K, l augmentation de la concentration en cuivre permet de diminuer la concentration des ions chromate dès les premières 90 minutes. Dans l essai sans cuivre, la réduction est négligeable alors qu à la concentration de 100 µm, elle de l ordre de 15 %. L ajout de protéinase K ne permet pas d abolir le phénomène de réduction du chrome. Ce résultat suggère que si l activité chromate réductase est de nature protéique, la protéine ou les protéines ne sont pas dégradées par la protéinase K. La disparition du chrome a été mesurée après 20 heures d incubation à 30 C. La Figure 24 montre la concentration en chrome restant sous forme (VI). Sans cuivre, 20 % du chrome (VI) a été réduit avec ou sans protéinase K. En présence de 20 µm de cuivre, on observe que la présence de protéinase K entraîne une baisse de la réduction du chrome. Néanmoins, en 20 heures, il y a eu plus de 75 % de chrome (VI) réduit. Pour des concentrations en cuivre de 100 et 500 µm, nous n avons pas fait figurer les résultats car pour les deux conditions (avec ou sans protéinase K) la réduction a été complète. L ajout de protéinase K n a donc pas d effet significatif sur la réduction du chrome. La protéinase K est pourtant une protéase qui peut dégrader une grande variété de protéines. De plus cette enzyme est très résistante à la température, à la présence de détergent, elle est active dans une large gamme de ph. L activité de la protéinase K peut difficilement être mise en cause. Dans les conditions de ph (6,8) et de température dans lesquelles les essais ont été effectués, l activité chromate réductase, si elle était de nature enzymatique, aurait été fortement réduite voire abolie. Ce résultat suggère que la réduction du chrome ne nécessite pas la présence d une enzyme. Pour confirmer ce résultat, nous avons réalisé les mêmes expériences mais en présence d une autre protéase : la pronase. L ajout de cette enzyme, à la concentration de 0,1 et 0,2 mg.ml -1 n a pas permis de réduire significativement l activité chromate réductase. En 24 heures, en présence de 0,1 mm de cuivre, la réduction est totale même en présence de pronase. 138

150 RÉSULTATS RÉDUCTION DU CHROME (VI) EN SOLUTION PAR NH50 EN CULTURES PURES % de Cr(VI) restant sans prot K avec prot K µm Cu 2+ Figure 23 : Effet de la protéinase K sur le pourcentage de Cr(VI) restant dans le surnageant SCr incubé pendant 90 minutes avec ou sans Cu 2+. [Cr(VI)] ini = 0,8 mm % de Cr(VI) restant sans prot K avec prot K 0 20 µm Cu 2+ Figure 24 : Effet de la protéinase K sur le pourcentage de Cr(VI) restant dans le surnageant SCr incubé pendant 20 heures avec ou sans Cu 2+. [Cr(VI)] ini = 0,8 mm (la réduction est complète à 100 et 500 µm de Cu 2+ avec ou sans protéinase K) 139

151 RÉSULTATS RÉDUCTION DU CHROME (VI) EN SOLUTION PAR NH50 EN CULTURES PURES Effet du SDS Une autre méthode pour déterminer la nature de l activité chromate réductase est d ajouter du Sodium Dodécyl Sulfate (SDS) dans les essais. Cette molécule est un détergent qui dénature les protéines. La dénaturation des protéines conduit à la perte de la structure tridimentionnelle et donc à la perte de l activité. Si l on ajoute 0,1 % de SDS aux essais contenant 0,1 mm de cuivre Cu 2+, on observe que la réduction du chrome est complète en 24 heures, tout comme dans les essais ne contenant pas de SDS. Les résultats obtenus dans les expériences réalisées en incubant le surnageant SCr avec du Cu 2+ en présence de protéases (protéinase K et pronase) ou de détergent (SDS) indiquent donc que l activité chromate réductase n est très probablement pas de nature protéique. La bio-réduction de chrome (VI) observée dans des cultures de Streptomyces thermocarboxydus NH50 n est donc pas une réduction enzymatique Précipitation du surnageant à l éthanol Le dosage des protéines par la méthode Bradford a révélé des teneurs inférieures au seuil de détection (de l ordre du mg.l -1 ). Nous avons cependant cherché à quantifier le contenu protéique, et avons pour cela procédé à une précipitation à l éthanol qui permet de concentrer les protéines (Figure 25). La première étape à consister à vérifier que la précipitation à l éthanol n affectait pas l activité chromate réductase. Nous avons utilisé pour cela des surnageants S de cultures de 11 jours de S. lividans TK24 et de S. thermocarboxydus NH50 en M63Y. 140

152 RÉSULTATS RÉDUCTION DU CHROME (VI) EN SOLUTION PAR NH50 EN CULTURES PURES 11 jours de culture sans chrome Mycéliums de Streptomyces Récupération du surnageant par centrifugation et filtration sur 0,2 µm Aliquotes de 1 ml 1 ml d éthanol 100 % Test de l activité chromate réductase des surnageants non précipités Réduction totale du chrome (VI) après 4 jours 30 C Cr(VI) (1 mm) + Cu 2+ 0,1 mm 30 C Cr(VI) (1 mm), +/- Cu 2+ (0,1 mm) + NADH (0,2 mm) Sp Reprise du culot dans 1 ml d eau Récupération du culot, séchage au speedvac Incubation 20 min sur la glace, centrifugation g Dosage du Cr(VI) après 4 jours Test de l activité chromate réductase des surnageants précipités Figure 25 : Précipitation du surnageant S à l éthanol Nous avons précipité 1 volume de surnageant S par ajout d un volume d éthanol. Après incubation sur la glace pendant 20 minutes et centrifugation, nous avons repris le culot par 1 volume d H 2 O : le surnageant que l on appelle S p n a donc pas été concentré. La concentration en Cr(VI) est ensuite ajustée à 1 mm puis les échantillons sont incubés à 30 C pendant 4 jours. La réduction du chrome par les surnageants non précipités est réalisée sans l ajout de donneurs d électrons exogènes. Comme nous ignorons si les donneurs d électrons endogènes seraient toujours présents dans les échantillons, nous avons décidé d ajouter du NADH à 0,2 mm dans les échantillons S p. Les résultats sont présentés dans le Tableau XXVII. 141

153 RÉSULTATS RÉDUCTION DU CHROME (VI) EN SOLUTION PAR NH50 EN CULTURES PURES Tableau XXVII : Pourcentage de réduction du chrome (VI) en 4 jours à 30 C par les surnageants S et S p de S. lividans TK24 et S. thermocarboxydus NH50 en fonction de la présence de 0,1 mm de cuivre Cu 2+ sous forme de CuCl 2 avec concentration initiale en Cr(VI) de 1 mm. Les surnageants S p sont complémentés par 0,2 mm de NADH en tant que donneur d électrons S p TK24 + NADH 0,2 mm S p NH50 + NADH 0,2 mm Eau + NADH 0,2 mm S TK24 S NH50 Sans Cu 2+ 0,1 mm Cu 2+ Sans Cu 2+ 0,1 mm Cu 2+ Sans Cu 2+ 0,1 mm Cu 2+ 0,1 mm Cu 2+ 0,1 mm Cu 2+ % de réduction du Cr(VI) en 4 jours 28 % +/ % +/ % +/ % +/-1 < 5 % < 5 % 100 % 100 % Les résultats obtenus en présence de 0,1 mm de Cu 2+ avec les surnageants non précipités et précipités montrent que la réduction du Cr(VI) est beaucoup moins importante avec les surnageants ayant été précipités à l éthanol. La précipitation permet donc de conserver une partie de l activité réductrice. Avec le surnageant S p de la souche TK24, on observe en absence de Cu 2+ environ 30 % de réduction du chrome et 50 % avec le surnageant S p de la souche NH50. La souche TK24 excrète dans son surnageant des molécules capables de réduire le chrome (VI). Ce résultat est en accord avec celui obtenu précédemment et présenté dans le Tableau XXIII page 128. Les cultures de la souche de S. lividans TK24 permettent dans une moindre mesure de réduire le chrome (VI) et le mécanisme impliqué semble être identique à celui présenté par la souche S. thermocarboxydus NH50 : c est-à-dire production de molécules dans le surnageant de culture capables de réduire le chrome et dont le pouvoir réducteur est augmenté en présence de cuivre sous la forme Cu 2+ (puisque l ajout de cuivre permet d obtenir 50 % de réduction chez TK24 et 82 % chez NH50). Le surnageant Sp de NH50 permet dans les deux conditions testées (avec ou sans cuivre) de réduire plus de chrome (VI). Ce résultat concorde avec celui présenté dans le Tableau XXIII où l on obtient un meilleur pourcentage de réduction du chrome avec la culture de la souche NH50. Le NADH est une molécule qui peut réduire le chrome (VI) de manière purement chimique sans la présence d enzyme. Nous avons donc cherché à évaluer si dans les conditions testées, la réduction par le NADH était importante ou non. Les témoins réalisés avec de l eau (Tableau XXVII) montrent que la réduction du chrome par le NADH à 0,2 mm avec ou sans cuivre est négligeable (< 5 %). 142

154 RÉSULTATS RÉDUCTION DU CHROME (VI) EN SOLUTION PAR NH50 EN CULTURES PURES Nous avons réalisé les même essais en multipliant par 10 la concentration de NADH (soit 2 mm) dans de l eau ou du M63 stérile avec et sans glycérol. La forte concentration en NADH permet d observer une réduction importante du chrome notamment dans le milieu M63. Les résultats sont présentés dans le Tableau XXVIII. Tableau XXVIII : Pourcentage de réduction abiotique du Cr(VI) à la concentration initiale de 1 mm dans l eau et dans les milieux M63 et M63Y avec ajout éventuel de 2 mm de NADH et/ou 0,1 mm de Cu 2+ % de réduction du chrome (VI) en 24 heures à 30 C Sans ajout Cu 2+ 0,1 mm NADH 2 mm Cu 2+ (0,1 mm) et NADH (2 mm) H 2 O < 5 % < 5 % 11 24,5 M63 < 5 % < 5 % 40 60,4 M63Y < 5 % < 5 % 41 60,0 Cette expérience montre que la présence de cuivre Cu 2+ seul sans la présence de substrat réducteur ne permet de réduire de manière significative le chrome (VI) contenu dans les essais. Que l on ajoute ou non 0,1 mm de cuivre, la réduction est inférieure à 5 % quel que soit le milieu testé. En l absence de cuivre ajouté, le NADH à la concentration de 2 mm permet de réduire de manière abiotique 11 % du chrome dans de l eau mais peut réduire environ 40 % dans le milieu M63 avec ou sans glycérol. La présence de sels minéraux dans le milieu M63 favorise la réduction abiotique du chrome par le NADH. Le glycérol, quant à lui, ne joue pas de rôle puisqu en présence ou non de 3 g.l -1 de glycérol, on observe environ 40 % de réduction par le NADH. Si l on ajoute du cuivre (0,1 mm) et du NADH (2 mm), le pourcentage de réduction abiotique du chrome augmente encore pour atteindre environ 60 % dans le milieu M63 avec ou sans glycérol. Ce résultat indique que le cuivre augmente de manière significative la réduction du chrome par le NADH. Ce phénomène ressemble beaucoup à celui présenté par les surnageants de culture de la souche S. thermocarboxydus NH50 mais aussi par d autres souches de Streptomyces, où des molécules, qui vraisemblablement ne sont pas de nature protéique, réduisent le chrome (VI), et de manière beaucoup plus rapide si on ajoute du cuivre. Nous pouvons alors penser que les molécules présentes dans les surnageants sont des molécules de NADH. Cependant, le NADH est à l intérieur des cellules, il n y a, a priori, aucune raison pour que ce type de molécules se retrouve dans les surnageants de culture de Streptomyces. Nous verrons plus tard, grâce à une étude RMN, que les surnageants de culture ne contiennent pas de NADH. Nous avons voulu déterminer quels minéraux, contenus dans le milieu M63, favorisait la réduction abiotique du chrome par le NADH. Nous avons donc préparé individuellement chacune des solutions salines stériles aux concentrations présentes dans le milieu M63, et avons testé la réduction du Cr(VI) dans ces milieux avec ou sans l ajout de NADH et/ou de cuivre. Les résultats sont présentés dans le Tableau XXIX. 143

155 RÉSULTATS RÉDUCTION DU CHROME (VI) EN SOLUTION PAR NH50 EN CULTURES PURES Tableau XXIX : Pourcentage de réduction abiotique du Cr(VI) en 24 heures à 30 C en présence des différents minéraux présents dans le milieu M63 en présence de 2 mm de NADH et/ou de 0,1 mm de CuCl 2, concentration initiale en Cr(VI) = 1 mm Minéraux Sans ajout Cu 2+ 0,1 mm NADH 2 mm Cu 2+ (0,1 mm) et NADH (2 mm) MgSO 4 1,6 mm 8 9,1 4,5 45,5 FeSO 4 3,2 µm 10,2 14,4 28,8 38,5 (NH 4 ) 2 SO 4 15 mm 5,1 9,3 57,2 73,6 KH 2 PO 4 0,1 M 5,2 < 5 57,7 72,2 Les résultats obtenus montrent que chacun des minéraux présents dans le milieu M63 favorise la réduction abiotique du chrome par le NADH en présence de 0,1 mm de Cu 2+. En effet, si dans de l eau pure, nous n observons en 24 heures qu environ 25 % de réduction du chrome (VI) en présence de NADH et de Cu 2+ (Tableau XXVIII), le pourcentage de réduction est de 45,5 % dans une solution de MgSO 4 1,6 mm, et supérieur à 70 % dans les solutions de (NH 4 ) 2 SO 4 15 mm ou KH 2 PO 4 0,1 M. Ces expériences avaient été réalisées pour trouver le ou les minéraux principalement responsables de cette réduction abiotique afin d envisager de diminuer leur concentration dans le milieu M63 et ainsi obtenir des surnageants où la réduction abiotique serait mineure. Si un seul des minéraux avait été responsable de la réduction abiotique du chrome (VI), nous aurions essayé de cultiver les différentes souches de Streptomyces dans le milieu M63 dépourvu de ce minéral. Nous avons réalisé des cultures où les concentrations en KH 2 PO 4 et en (NH 4 ) 2 SO 4 étaient deux fois moins importantes. Dans ces conditions, la croissance bactérienne était fortement ralentie. Nous n avons donc pas modifié le milieu M63 pour obtenir des cultures bactériennes mais dans les essais de réduction du chrome (VI) dans les surnageants de ces cultures en présence de NADH et de cuivre, il conviendra de vérifier la part de la réduction abiotique dans les conditions testées Lyophilisation La technique de précipitation à l éthanol nécessite d aliquoter le surnageant puis d ajouter l éthanol dans un volume d environ 20 ml compte tenu du matériel à disposition (volume maximal recommandé dans les tubes compatibles avec la centrifugeuse SORVAL utilisée). Pour précipiter 100 ml de surnageant, il faut donc fractionner au moins en 5 aliquotes, ajouter l éthanol, précipiter sur la glace, centrifuger, éliminer l alcool et sécher le culot, puis le reprendre dans de l eau et enfin rassembler les 5 fractions en une pour disposer d'un stock à une certaine concentration identique pour les expériences suivantes. L étape de séchage pour évaporer l éthanol était longue car les tubes utilisés pour la centrifugation ne pouvaient être placés dans le speed-vac (appareil permettant de sécher rapidement les culots). Par conséquent, l étape de séchage s effectuait à température ambiante sous atmosphère normale pendant plusieurs heures. Pour limiter les opérations et le temps de séchage à température ambiante qui peuvent diminuer le contenu et la 144

156 RÉSULTATS RÉDUCTION DU CHROME (VI) EN SOLUTION PAR NH50 EN CULTURES PURES qualité des surnageants, nous avons lyophilisé les surnageants à 55 C (appareil MODULYO modèle EDWARDS sous mbars). La poudre obtenue, de couleur blanche, a ensuite été reprise dans un volume d eau 10 fois inférieure au volume initial. Les échantillons obtenus sont donc concentrés 10 fois. Nous avons testé l activité chromate réductase d un surnageant avant et après lyophilisation. Les surnageants concentrés 10 fois après lyophilisation ont été dilués 10 fois pour cette expérience de façon à avoir une concentration comparable dans les essais avant et après lyophilisation. Les résultats sont présentés dans le Tableau XXX. Tableau XXX : Pourcentage de réduction du chrome (VI) (à la concentration initiale de 1 mm) par un surnageant de culture avant lyophilisation et après lyophilisation à 55 C avec ou sans cuivre Cu 2+ à la concentration de 0,1 mm après 1, 3 et 9 jours d incubation à 37 C. Avant lyophilisation Après lyophilisation à -55 C Cu 2+ Sans Cu 2+ Cu 2+ Sans Cu 2+ ND : non donné % de réduction du Cr(VI) Après 1 jour Après 3 jours Après 9 jours 36,7 10,7 41,1 23,4 72,3 25,7 ND ND ND ND 92,8 38,0 Le surnageant utilisé pour cette expérience provient d une culture de la souche NH50 de 10 jours en milieu M63Y avec 1 mm de chrome (VI). Ce surnageant SCr a été filtré à 0,2 µm puis stocké à 4 C pendant 2 mois et demi avant de le lyophiliser et de tester l activité chromate réductase. Du fait de cette longue période de stockage, nous avons d abord vérifié que l activité était toujours présente dans le surnageant non lyophilisé. Nous observons en 3 jours environ 25 % de réduction en absence de cuivre et plus de 70 % de réduction en présence de 0,1 mm de CuCl 2 (Tableau XXX). Ceci nous indique qu il existe une activité chromate réductase non négligeable après un stockage de plusieurs mois à 4 C. Les résultats présentés dans le Tableau XXXI montrent que le surnageant concentré dix fois peut réduire 100 % du chrome (VI) contenu dans les essais avec et sans cuivre en 9 jours. La concentration initiale en chrome (10 mm) était 10 fois supérieure à celle utilisée habituellement. En parallèle, le même surnageant lyophilisé mais resuspendu dans un volume final identique à l initial (qui n est donc pas concentré) ne peut pas réduire la même quantité de chrome. Le pourcentage de réduction est d environ 15 % avec cuivre et de 9 sans cuivre. Dans les deux cas (surnageant concentré et non concentré), l effet du cuivre est beaucoup moins net qu avec les surnageants non lyophilisés. Dans les essais où la concentration en chrome est de 1 mm, la 145

157 RÉSULTATS RÉDUCTION DU CHROME (VI) EN SOLUTION PAR NH50 EN CULTURES PURES concentration en cuivre est de 0,1 mm soit dix fois moindre (soit un rapport Cu/Cr(VI) de 1/10). Dans cette expérience, la concentration initiale en chrome est de 10 mm mais la concentration en cuivre est toujours de 0,1 mm (soit un rapport Cu/Cr(VI) de 1/100). C est certainement en raison d un rapport Cu/Cr(VI) beaucoup plus faible que l effet du cuivre est beaucoup moins important. Pour observer une différence significative entre les conditions avec et sans cuivre, la concentration en cuivre devait être de l ordre du millimolaire et non pas du dixième de millimolaire. Tableau XXXI : Pourcentage de réduction du Cr(VI) par les surnageants concentrés 10 fois et non concentrés après lyophilisation avec ou sans Cu 2+ à la concentration initiale de 0,1 mm. Concentration initiale en Cr(VI) = 10 mm Surnageant conc. 10 fois 10 mm de Cr(VI) Surnageant non conc. % de réduction Après 1 jour du Cr(VI) Après 9 jours Cu 2+ Cu 2+ 44,3 +/- 5 40,0 +/- 5 < 5% < 5 % / / Fractionnement des surnageants de culture lyophilisés D après les résultats obtenus en présence de protéases, il semble que cette activité réductase ne soit pas portée par une protéine enzymatique. Le dosage des protéines par la méthode de Bradford n a pas permis jusqu alors de les quantifier et tous les gels de polyacrylamide réalisés avec des surnageants non concentrés n avaient pas permis, après coloration au bleu de Comassie, la visualisation de bandes. Disposant à présent de surnageants lyophilisés, concentrés dix fois et possédant une activité chromate réductase, nous avons réalisé de nouveaux gels de polyacrylamide avec des échantillons de S et SCr lyophilisés, concentrés 10 fois puis précipités à l acide tri-chloro-acétique et resuspendus dans un dixième du volume initial. Cette concentration par 100 par rapport à un surnageant récupéré après culture permet la visualisation de nombreuses bandes qui correspondent aux protéines présentes (photographie du gel de polyacrylamide non présentée). Les surnageants contiennent donc des protéines mais en très faibles quantité. Il faut en effet concentrer l échantillon 100 fois et colorer les gels de polyacrylamide à l argent (Silver Stain Plus de Biorad), méthode de coloration très sensible (30 à 50 fois plus sensible que la coloration au bleu de Comassie). Les surnageants contiennent donc de nombreuses protéines. Afin de déterminer si elles sont impliquées dans l activité chromate réductase, nous avons fractionné en fonction de leur poids moléculaire les différents constituants présents dans les surnageants lyophilisés et concentrés dix fois. 146

158 RÉSULTATS RÉDUCTION DU CHROME (VI) EN SOLUTION PAR NH50 EN CULTURES PURES Pour cela, nous avons filtré les surnageants et récupéré, après centrifugation à 5000 g pendant 6 h dans des «concentrateurs» MACROSEP TM, les fractions supérieures et inférieures à 3000 Daltons ainsi que les fractions supérieures et inférieures à 1000 Daltons. Les molécules dont le poids moléculaire est supérieur à 3000 Da sont contenues dans la fraction que nous avons appelée R 3000 et les molécules dont le poids moléculaire est inférieur à 3000 Da sont contenues dans la fraction que nous avons appelée F Nous avons utilisé la même nomenclature pour les fractions supérieures et inférieures à 1000 Da. L activité chromate réductase de chacune des fractions provenant de surnageants S et SCr lyophilisés et concentrés dix fois a été testée en incubant des échantillons contenant 1 mm de Cr(VI) avec ou sans la présence de CuCl 2 pendant 1 nuit à température ambiante. Les résultats sont présentés dans le Tableau XXXII. Tableau XXXII : Pourcentage de réduction du Cr(VI) par les fractions R 3000, F 3000, R 1000, F 1000 des surnageants S et SCr lyophilisés et concentrés dix fois en 10 à température ambiante. Surnageant S lyophilisé et concentré 10 fois Surnageant SCr lyophilisé et concentré 10 fois % de réduction du Cr(VI) R 3000 F 3000 R 1000 F 1000 R 3000 F 3000 R 1000 F 1000 Cu 2+ - Cu 2+ - Cu 2+ - Cu 2+ - Cu 2+ - Cu 2+ - Cu 2+ - Cu , , ,2 9, ,2 28,9 20, M63Y lyophilisé et concentré 10 fois % de réduction du Cr(VI) R 3000 F 3000 R 1000 F 1000 Cu 2+ - Cu 2+ - Cu 2+ - Cu [Cr(VI)] initiale = 1 mm et [CuCl 2 ] = 0,1 mm Les fractions qui présentent l activité chromate réductase la plus importante sont les fractions F 1000 et F En absence de Cu 2+ ajouté, le pourcentage de réduction du Cr(VI) dans la fraction F 3000 est supérieur à 75 % dans le cas des fractions issues du surnageant S et supérieur à 94 % dans le cas des fractions issues du surnageant SCr. En présence de Cu 2+, la réduction du Cr(VI) est totale avec la fraction F 1000 des deux surnageants. On remarque que le surnageant SCr lyophilisé provenant d une culture de la souche NH50 en présence de Cr(VI) présente une activité chromate réductase supérieure à celle présentée par le surnageant S lyophilisé (issu d une culture sans Cr(VI)). Nous avions déjà observé cette différence lors des expériences avec les surnageants non lyophilisés. 147

159 RÉSULTATS RÉDUCTION DU CHROME (VI) EN SOLUTION PAR NH50 EN CULTURES PURES Les fractions R 3000 qui contiennent des molécules dont le poids moléculaire est supérieur à 3000 Da, présentent une activité bien moindre, comparable à celle mesurée dans des essais abiotiques contenant du milieu M63Y traité dans les mêmes conditions que les surnageants (lyophilisation et concentration). Ces résultats indiquent que les molécules de taille supérieure à 3000 Da, ce qui pour des protéines correspond à plus de 30 acides aminés (1 aa correspond à environ 100 Daltons) ne sont pas impliquées dans l activité chromate réductase des surnageants de cultures de Streptomyces thermocarboxydus NH50. Les fractions R 1000 des surnageants S et SCr présentent une activité réductrice assez faible également puisque la réduction est comprise entre 17 et 29 % du chrome (VI) présent en solution contre 60 à 100 % dans les fractions F Ce sont donc essentiellement des molécules de faible poids moléculaire (inférieur à 1000 Da) qui sont responsables de l activité chromate réductase mesurée dans les surnageants. La faible réduction observée dans les fractions R 1000 peut s expliquer par le fait que la «coupure» à 1000 Da n est jamais parfaite : il reste toujours quelques molécules dont le poids moléculaire est inférieur à 1000 dans les fractions R On peut aussi penser que d autres molécules dont le poids est compris entre 1000 et 3000 Daltons peuvent réduire le chrome (VI) mais de manière beaucoup moins significative que les petites molécules (la différence est d un facteur 4 environ). Compte tenu du fait que l ajout de protéases ou de SDS ne permet pas d empêcher la réduction du chrome, et que la majorité des molécules impliquées dans cette réduction a donc une masse moléculaire inférieure à 1000 Daltons, l activité chromate réductase n est très probablement pas une activité enzymatique. Beaucoup de molécules de faible poids moléculaire sont capables de réduire le Cr(VI) en Cr(III). Kaiwar et Rao (1995) ont étudié le pouvoir réducteur de certaines molécules biologiques vis-à-vis du chrome (VI). Les molécules contenant un groupement thiol tiennent une place importante dans les phénomènes de réduction du chrome dans les cellules. Le dérivé éthylester de la L-cystéine, le gluthation et la L-cystéine sont de puissants réducteurs du Cr(VI). L estérification du groupement carboxylique de la L-cystéine permet confère un pouvoir réducteur plus important. L estérification des groupements carboxyliques du glutathion conduit aussi à une augmentation du pouvoir réducteur. Les auteurs (Kaiwar et Rao, 1995) ont aussi testé la capacité des saccharides et de leurs dérivés à réduire le chrome (VI). Dans les conditions normales de ph rencontrées dans les sols, la réduction est très lente. En revanche, la réduction du Cr(VI) à ph 0,35 par ce type de molécule est possible mais elle est beaucoup moins efficace que celle réalisée par les molécules à groupements thiols. La comparaison de plusieurs oses a montré que la présence de deux fonctions alcools consécutives surtout en orientation cis et que la présence de groupements carboxyliques favorisent la réduction du Cr(VI). 148

160 RÉSULTATS RÉDUCTION DU CHROME (VI) EN SOLUTION PAR NH50 EN CULTURES PURES L étude de la capacité des nucléotides et leurs dérivés à réduire le chrome (VI) à ph 0,35 (Kaiwar et Rao, 1995) a aussi montré que la guanine et la cytosine sont les nucléotides ayant le plus fort pouvoir réducteur. Le nombre de phosphates liés aux nucléosides (nucléotide + pentose) augmente le pouvoir réducteur, ainsi l ATP est un meilleur réducteur que l ADP, qui lui-même réduit plus efficacement le Cr(VI) que l AMP. Il apparaît aussi que les ribonucléotides sont plus efficaces que les désoxyribonucléotides. En effet, tout comme pour les saccharides seuls, la présence de deux fonctions OH consécutives est primordiale pour une meilleure activité chromate réductase. Compte tenu du fait que la fraction ayant une activité chromate réductase est composée de molécules de faible poids moléculaire, nous avons essayé de déterminer si la ou les molécules présentes dans la fraction F 1000 des surnageants de culture de S. thermocarboxydus NH50 présentait des caractéristiques communes aux molécules décrites ci-dessus. Pour cela, nous avons analysé, par résonance magnétique nucléaire (RMN) du 13 C, les fractions F 1000 des surnageants de la souche NH Etude par Résonance Magnétique Nucléaire du 13 C La résonance magnétique nucléaire (RMN) est une méthode d analyse qualitative et quantitative dont le principe est le suivant : Lorsque le nombre de protons et de neutrons qui composent un noyau atomique n est pas identique, le spin total du noyau génère un dipôle magnétique le long de l axe du spin et l amplitude de ce dipôle est une caractéristique propre du noyau considéré appelée moment magnétique nucléaire. En pratique, on excite les atomes des molécules étudiées par un champ magnétique. Chaque atome résonne à une fréquence qui lui est propre et qui dépend de son environnement chimique. L'atome ré-émet un signal à cette fréquence. La superposition des signaux provenant de tous les atomes est enregistrée puis analysée. L isotope 12 C du carbone est le plus abondant sur Terre. Cependant, cet atome possède un noyau composé d un nombre égal de protons et de neutrons. Par conséquent, cet atome ne possède pas de spin. C est l isotope 13C qui possède un spin. Ce sera donc la résonance du 13 C, qui représente environ 1 % du carbone contenu dans les molécules, qui sera mesurée dans la RMN du Carbone. En fonction de l environnement chimique, c est-àdire en fonction de la nature des atomes engagés dans une liaison avec le 13 C considéré, la fréquence à laquelle l atome de carbone va résonner sera différente. Par exemple, un atome de 13 C engagé dans une liaison avec un atome d azote résonnera à environ 50 ppm alors qu un 13 C impliqué dans un cycle aromatique résonnera entre 110 et 160 ppm environ. 149

161 RÉSULTATS RÉDUCTION DU CHROME (VI) EN SOLUTION PAR NH50 EN CULTURES PURES Nous avons réalisé un spectre RMN 13 C des fractions F 1000 (qui contiennent l essentiel de l activité chromate réductase) des surnageants S et SCr et d un blanc abiotique composé uniquement du milieu de culture traité dans les mêmes conditions que S et SCr (lyophilisation et concentration). Nous n avons pas fait de spectres sur les surnageants S et SCr non fractionnés car ils contiennent trop de molécules et le nombre de pics observés serait beaucoup trop important pour pouvoir les analyser. Nous avons donc réalisé ces spectres sur les molécules dont le poids moléculaire est inférieur à 1000 Daltons provenant d échantillons concentrés de façon à observer des pics d une hauteur suffisante pour pouvoir être détectables. Les spectres du 13 C des fractions F 1000 des surnageants S (en rouge) et SCr (en vert) sont comparés à celui du milieu M63Y (en bleu) dans la Figure 26 A, B et C respectivement. Une référence externe contenant de l éthanol dans de l acide méthylène diphosphonique (MDP) dans un capillaire en verre, a été placée dans deux des échantillons. L éthanol est une molécule possédant 2 atomes de carbone. Un des atomes de carbone appartient à un groupement méthyl et résonne à 18,06 ppm en présence de MDP. L autre carbone est engagé dans une liaison avec l oxygène du groupement alcool et résonne à 58,24 ppm. Cette référence permet de comparer les spectres deux à deux. La référence a été la même d un échantillon à l autre, la hauteur des pics correspondant à l éthanol permet d estimer la hauteur relative des autres pics des deux spectres comparés. Dans le spectre du milieu M63Y (Figure 26 B), on observe les deux pics correspondant à l éthanol puis deux autres pics à 63,2 et 72,9 qui correspondent aux deux types de carbone présents dans la molécule de glycérol. En effet cette dernière est une molécule symétrique. Les carbones C1 et C3 sont liés chacun avec un autre carbone, deux atomes d hydrogène et avec l oxygène du groupement alcool. Le carbone C2, qui est au milieu de la molécule, est lié avec les carbones C1 et C3, un atome d hydrogène et avec l atome d oxygène. Deux résonances sont donc associées à la molécule de glycérol, celle à 72,9 ppm qui correspond au carbone C2 et celle à 63,2 ppm qui correspond aux carbones C1 et C3 (c est pour cette raison que la hauteur du pic à 63,2 ppm est beaucoup plus grande). On retrouve les pics à 63,2 et 79,9 ppm dans les surnageants S et SCr. Mais la hauteur de ces pics est beaucoup plus petite que celle observée dans le milieu M63Y. En effet, dans le milieu M63Y, les pics à 63,2 et 72,9 ppm sont beaucoup plus grands que ceux de l éthanol à 58,24 et 18,07 ppm (Figure 26 B). Par contre, dans la fraction F 1000 du surnageant SCr, la hauteur des pics à 63,2 (glycérol) et à 58,24 (éthanol) sont quasiment identiques (Figure 26 C). Dans le milieu M63Y, il y a donc beaucoup de plus de glycérol que dans la fraction F 1000 de SCr où il a été consommé par la souche NH50 pendant la culture. En fonction des atomes liés au carbone, celui-ci ne résonnera pas à la même fréquence. On peut ainsi définir différentes zones dans un spectre. Les atomes de carbone résonnent entre 0 et 220 ppm. Entre 0 et 30 ppm, on retrouve les carbones engagés dans une liaison de type alcane. Aux environs de 50 et 60 ppm, on trouve les liaisons C-N et C-O respectivement. Entre 110 et 160 ppm, on trouve les carbones engagés dans une double liaison (alcène et C aromatique). Entre 160 et 180 ppm, ce sont les carbones formant un groupement ester, amide ou acide qui résonnent et au-delà de 190, ce sont les carbones formant les cétones et les aldéhydes. 150

162 RÉSULTATS RÉDUCTION DU CHROME (VI) EN SOLUTION PAR NH50 EN CULTURES PURES Les spectres du carbone de S et de SCr se ressemblent beaucoup (Figure 26). Les pics supplémentaires par rapport au témoin M63Y (indiqués par une flèche) résonnent à la même fréquence dans S et SCr. On observe cependant deux pics de faible amplitude dans SCr autour de 180 ppm qui ne sont pas détectés dans S. Il est possible que les atomes de carbone correspondant à ces deux pics existent dans S mais qu on ne les observe pas car ils sont confondus avec le bruit de fond du signal. Nous avons étudié plus précisément les fréquences de résonance des atomes de carbone de SCr en agrandissant le spectre de celui-ci. Le détail du spectre est présenté dans la Figure

163 RÉSULTATS A : F 1000 surnageant S RÉDUCTION DU CHROME (VI) EN SOLUTION PAR NH50 EN CULTURES PURES spike spike Glycérol C2 (72,9) Glycérol C1 et C3 (63,2) ppm B : milieu M63 Y spike * spike * Glycérol C2 (72,9) Glycérol C1 et C3 (63,2) ppm C : F 1000 du surnageant SCr spike Glycérol C2 (72,9) Glycérol C1 et C3 (63,2) * spike * ppm Cétone, aldéhydes Ester, amide, acide C=C et C aromatique C O C N C C (alcane) Figure 26 : Spectres RMN du 13 C : A : de la fraction F 1000 du surnageant S ; B : du milieu M63Y avec une référence éthanol ; C : de la fraction F 1000 du surnageant SCr avec une référence éthanol. Les deux pics correspondants aux atomes de carbone de la référence éthanol sont indiqués par un astérisque (C1 et C2 à 18,07 et 58,24 ppm respectivement). Les deux «spikes» observés dans chacun des spectres sont des artefacts que l on retrouve toujours aux mêmes résonances. 152

164 RÉSULTATS RÉDUCTION DU CHROME (VI) EN SOLUTION PAR NH50 EN CULTURES PURES A : de 16,8 à 22,8 ppm Région du spectre où l on retrouve les atomes de carbone engagés dans une liaison alcane ex : chaîne latérale des acides aminés Référence éthanol C1 Atomes de carbone engagés dans les liaisons C N et C O (ex : acides aminés et sucres) Glycérol C2 Glycérol C1 et C3 Référence éthanol C2 Atomes de carbone engagés C O (sucres) (ppm) B : de 57,5 à 73,5 ppm (ppm) C : de 93,8 à 96,8 ppm (ppm) D : de 172 à 189 ppm Atomes de carbone engagés dans une fonction carboxylique COOH (acides aminés) (ppm) Figure 27 : Agrandissements du spectre RMN du 13 C du carbone de la fraction F 1000 du surnageant SCr 153

165 RÉSULTATS RÉDUCTION DU CHROME (VI) EN SOLUTION PAR NH50 EN CULTURES PURES Dans la Figure 27 A, on retrouve vers 18 ppm le pic correspondant au carbone 1 de l éthanol de la référence. On observe en outre 3 pics (à 17,6 ; 20,9 et 21,5 respectivement) qui peuvent correspondre à des atomes de carbone engagés dans des liaisons de type alcane. De nombreux carbones d acides aminés résonnent dans cette zone. Puis entre 58 et 73 ppm (Figure 27 B), on observe, en plus de la référence de l éthanol à 58,24 ppm, 6 pics à 61,2 ; 63,3 ; 69,2 ; 70,8 ; 72,9 et 73,0 respectivement. Les pics à 63,3 et 72,9 correspondent aux atomes de carbone du glycérol. Entre 58 et 60 ppm, on retrouve généralement d autres carbones d acides aminés et aux environs de 70 ppm, ce sont les atomes de carbone de nombreux sucres qui résonnent. On trouve deux autres pics à 93,8 et 96,7 (Figure 27 C) qui se trouvent dans une région où résonnent des carbones de molécules appartenant à la famille des sucres et enfin les deux derniers pics visibles sont à 179,8 et 183,3 ppm (Figure 27 D) où résonnent, entre autre, les atomes de carbone des groupements carboxyliques des acides aminés par exemple. Aucun pic n a pu être observé dans la zone où résonnent les atomes de carbone engagés dans un cycle aromatique ( ppm). Donc le surnageant SCr ne contient pas de molécule contenant un ou plusieurs cycles aromatiques. Un récapitulatif des pics observés dans la fraction F 1000 du surnageant SCr est présenté dans le Tableau XXXIII (la fraction F 1000 du surnageant S présentent les mêmes pics sauf ceux vers 180 ppm). Les surfaces de pics sont déterminées par l appareil de mesure : on fixe arbitrairement à 1 l intensité d un pic (ici celui à 183,26 ppm) et l intensité des autres pics est calculée par rapport à celle du pic choisi. L intensité des pics est proportionnelle au nombre d atomes de carbone engagés dans la liaison correspondant à la fréquence mesurée. On observe que les pics correspondant au glycérol (63,3 et 72,9 ppm) présentent les intensités les plus importantes ce qui signifie que le glycérol est la molécule que l on retrouve majoritairement dans la fraction analysée. La ou les autres molécules présentes le sont à des concentrations beaucoup plus faibles. Si l on se réfère aux données présentées en annexe, on peut remarquer que les résonances observées dans la fraction F 1000 ne correspondent à aucune molécule listée. Certains pics se retrouvent dans certaines des molécules listées mais aucune de ces molécules ne présente l ensemble des pics présentés dans le Tableau XXXIII. Il ne nous est donc pas possible de déterminer avec certitude la ou les molécules présentes. Néanmoins, nous pouvons dire que les résonances observées pourraient être celles de molécules semblables à des acides aminés puisque nous détectons des pics dans la zone 0-30 ppm qui peuvent correspondre à des atomes de carbone engagés dans des liaisons alcanes de chaîne latérale, puis un pic vers 40 ppm qui correspond aux liaisons de type C-N rencontrées dans tous des acides aminés, et enfin des pics dans la région ppm où résonnent les groupements carboxyliques des acides aminés. L aspartate qui contient deux groupements COOH présente deux résonances à 175 et 178,3 ppm. Nous avons donc dans la fraction F 1000 du surnageant SCr soit une molécule avec 2 groupements COOH, soit 154

166 RÉSULTATS RÉDUCTION DU CHROME (VI) EN SOLUTION PAR NH50 EN CULTURES PURES 2 molécules avec 1 groupement COOH chacune compte tenu du fait que l intensité de chacun des pics est comparable. Les résonances observées entre 60 et 90 ppm suggèrent fortement la présence d un sucre. Les carbones du glucose et du ribose résonnent dans cette zone. Nous avions observé dans les expériences présentées page 143, que le NADH peut réduire le Cr(VI) et que la vitesse de réaction est augmentée en présence d ions Cu 2+. Ce phénomène est le même que celui observé avec les surnageants de culture. On pouvait donc penser que les surnageants contenaient des molécules de NADH. La molécule de NADH est composée d un noyau adénosine et d un noyau nicotinamide. Dans les résonances présentées par la fraction F 1000, nous n observons pas de pics dans la zone 120 à 150 ppm où 5 atomes de carbone de l adénosine résonnent. Ceci indique que dans les molécules présentes dans F 1000, on ne trouve pas le noyau adénosine. Ces molécules ne sont donc pas du NADH. Tableau XXXIII : Intensités et fréquences auxquelles résonnent les carbones des molécules présentes dans la fraction F 1000 du surnageant SCr. ppm intensité Type de liaison ppm intensité Type de liaison 17,1498 0,52 72, ,18 17,6469 1,08 alcane 73,0644 ND 20,8997 1,53 73,2659 1,02 40,8182 1,23 93,8466 1,11 61,2266 1,02 96,7349 ND 63, ,21 C N 161,6232 0,75 et 69,2075 1,70 C OH 179,7842 0,90 70,4139 0,99 183, ,8236 1,29 1 résonance des atomes de carbone du glycérol C1 et C3 à 72,8818 et C2 à 63,3033 ppm. ND : non déterminée. C OH COOH 155

167 RÉSULTATS RÉDUCTION DU CHROME (VI) EN SOLUTION PAR NH50 EN CULTURES PURES 5.Conclusion Les résultats obtenus en présence de protéases ou de détergent indiquent que la bioréduction de chrome (VI) observée dans des cultures de Streptomyces thermocarboxydus NH50 n est pas une réduction enzymatique. Les spectres RMN du carbone du surnageant SCr ont révélé la présence de petites molécules contenant plusieurs atomes de carbone présentant de fortes homologies avec les acides aminés et les sucres. Si nous ne pouvons pas déterminer avec exactitude le nombre de molécules différentes présentes dans la fraction F 1000 du surnageant SCr ni leur formule chimique, nous pouvons dire qu il ne s agit pas de NADH. 156

168 RÉSULTATS ETUDE DE LA RÉDUCTION DU CR(VI) EN PRÉSENCE DE SOL POLLUÉ III. ETUDE DE LA RÉDUCTION DU CR(VI) EN PRÉSENCE DE SOL POLLUÉ 1.Caractéristiques du sol Le sol que nous avons utilisé pour ces expérimentations est issu d un site pollué de la région Rhône- Alpes présentant des concentrations en métaux lourds importantes (voir Matériels et Méthodes) Le site, anciennement protégé de la pluie par un auvent, est aujourd hui à l exposition de toutes intempéries suite à la chute de cet auvent. Ceci explique les différences de teneurs en chrome (VI) obtenues lors d un deuxième prélèvement : en 1999, les concentrations en chrome (VI) dans le sol étaient comprises entre 30 et 80 mg.kg -1. Nous avons donc dû re-polluer le sol en ajoutant du dichromate de potassium. Trois niveaux de pollutions en Cr(VI) ont été obtenus : 300 mg.kg -1 (extraction alcaline), 1108 et 1216 mg.kg -1 (extraction à l eau et alcaline respectivement) et enfin 2000 et 2300 mg.kg -1 (extraction à l eau et alcaline respectivement). Nous avons aussi mesuré le carbone organique total (COT) qui est de mg.kg -1. Des essais de lixiviation de ce sol ont été réalisés en mettant en contact 100 g de sol avec 1 litre d eau déminéralisé avec un renouvellement à deux reprises de l éluat après 16 h de contact. Ces essais, réalisés par POLDEN, ont montré que 1842 mg.kg -1 de Cr(VI) est lixiviable soit 80 % du Cr(VI) total présent dans le sol. Tout le Cr(VI) lixiviable est sous forme (VI). Concernant la COT, on retrouve 858 mg de carbone organique en solution pour 1 kg de sol. Pour réduire et donc immobiliser le chrome dans un sol, on peut stimuler et/ou augmenter la microflore endogène ou encore apporter une souche exogène réductrice dans le sol. Différents paramètres peuvent influencer l efficacité de la réduction du Cr(VI), en particulier, la présence ou non d oxygène et l apport de minéraux et de carbone. 157

169 RÉSULTATS ETUDE DE LA RÉDUCTION DU CR(VI) EN PRÉSENCE DE SOL POLLUÉ 2.Réduction du chrome (VI) dans un sol pollué : étude en milieu dispersé (batch) Dans un premier lieu, deux conditions d incubation ont été testées : l aérobiose et l anaérobiose. Comme nous l avons vu dans la bibliographie, la bio-réduction du Cr(VI) est en effet possible en aérobiose ou en anaérobiose. Les premières expériences avaient été réalisées par Nathalie Huck (1997) en aérobiose et avaient montré une activité chromate reductase. Lucile Barthet pendant son DEA (2000) a testé les conditions anaérobies afin de déterminer si l absence d oxygène était plus favorable à la bioréduction du Cr(VI) Conditions aérobies Dans un premier temps, nous avons testé différents milieux liquides (eau et M63) dans lesquels le sol est mis en suspension (sans enrichissement de la flore microbienne) et différentes sources de carbone (glucose (glc) 10 g.l -1 (soit 333 mm de carbone) et glycérol (Y) 3 g.l -1 (soit 83 mm de carbone)) afin de déterminer les conditions les plus favorables pour stimuler l activité réductrice contenue dans le sol. Chaque condition a été réalisée en triplicat. La Figure 28 montre qu une disparition significative du chrome (VI) n a pu être observée que dans une seule condition : en apportant des minéraux et du glucose. Si l on n apporte que de l eau, ou si l on remplace le glucose par du glycérol, nous n observons pas de réduction du chrome. Pourtant dans tous les essais, une microflore abondante, visible à l œil nu, s est développée même sans apport de source de carbone et/ou de minéraux. Le sol contient des molécules organiques (COT = mg.kg -1 ) et minérales en quantité suffisante qui permettent le développement de la microflore. Celle-ci n a pas été quantifiée compte tenu de la difficulté à effectuer cette mesure. En effet, dans les différents Erlenmeyers, le milieu est devenu trouble mais on observe la présence d amas de cellules ressemblant à des champignons formant des agglomérats. Il est assez difficile d estimer rapidement le nombre de microorganismes par simple dilution d un échantillon et lecture de la densité optique à 600 nm. La présence d agglomérats de taille variable ne permet pas de prélèvement homogène. Un témoin abiotique M63 + glucose avec un agent biocide (azoture de sodium 0,2 %) a révélé l absence de réduction du chrome dans ces conditions. Cet essai témoin confirme bien que la disparition du chrome (VI) est reliée à l activité de micro-organismes vivants. 158

170 RÉSULTATS ETUDE DE LA RÉDUCTION DU CR(VI) EN PRÉSENCE DE SOL POLLUÉ mm de Cr(VI) en solution 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 H2O H2O + Glc H2O + Y M63 M63 + Glc M63 + Y mg/l de Cr(VI) en solution temps en jours Figure 28 : Réduction du Cr(VI) dans des suspensions de sols pollués dans différentes conditions (eau ou M63 avec ou sans glucose 10 g.l -1 (glc) ou glycérol 3 g.l -1 (Y)), 2,5 g de sol dans 100 ml de milieu, incubation à 30 C, agitation orbitale 120 rpm. Sachant que la souche responsable de la réduction du chrome était un Streptomyces, (voir 1.1 du chapitre I des Résultats) nous avons essayé de retrouver ce genre bactérien après étalement de différentes dilutions sur des boîtes de Petri PEG 1 mm de Cr(VI). Nous avons utilisé les essais où la réduction avait été la plus efficace c est-à-dire M63 + glucose. Après incubation à 30 C sur des boîtes contenant du chrome, nous avons observé l aspect des colonies isolées. La première remarque a été le développement très important et rapide de champignons filamenteux sur beaucoup de boîtes. Pour ne sélectionner que les bactéries, un agent anti-fongique a été ajouté. Nous avons cherché sur ces boîtes des bactéries possédant les caractéristiques des Streptomyces, c est-à-dire des bactéries s accrochant à l agar. Aucune bactérie de ce type n a été retrouvée. Il est possible que l étape d enrichissement soit nécessaire pour avoir quelques colonies sur boîte. Le Streptomyces effectuant la réduction du chrome, isolé par N. Huck (1997), ne constituait pas la population dominante des microorganismes résistants au chrome, même après l étape d enrichissement. Il est possible que nous n en ayons pas observé ici à cause de la nécessité d enrichir la population réductrice. 159

171 RÉSULTATS ETUDE DE LA RÉDUCTION DU CR(VI) EN PRÉSENCE DE SOL POLLUÉ Un autre paramètre à considérer est le stockage du sol à 4 C pendant une longue période (depuis 1995). Il est tout à fait possible que la population bactérienne globale soit modifiée compte tenu des niveaux de survie différents à cette température. Disposant de la souche isolée par Nathalie Huck, nous n avons pas continué dans cette voie. Elle avait été entreprise car les conditions de conservation de la souche pure n avaient pas été optimales. Nous aurions souhaité disposer d une souche endogène n ayant pas subi de dommages consécutifs à une déshydratation importante (paragraphe 1.2 du chapitre I des Résultats). Toutes les études sur la souche pure ont donc été réalisées à partir de la souche NH50 isolée par Nathalie Huck et qui avait été stockée pendant 1 an sur milieu gélosé Conditions anaérobies En condition anaérobie, la réduction des sulfates en sulfures par les bactéries sulfato-réductrices (BSR) présentes naturellement dans certains sols peut permettre soit la précipitation des métaux sous la forme de sulfures soit la réduction des métaux par le sulfure d hydrogène synthétisé par les BSR (bio-réduction indirecte). Nous avons donc incubé le sol pollué au Cr(VI) en anaérobiose à 30 C avec un milieu contenant des sulfates (1,6 mm de MgSO 4 dans le milieu M63). Les deux sources de carbone testées sont le glucose et l éthanol. Il n y a pas d enrichissement avec une souche bactérienne exogène. La différence principale (outre l aération) par rapport à l expérience en aérobiose, décrite au paragraphe précédent, est le ratio L/S. Dans le premier cas, nous avons incubé 2,5 g de sol avec 100 ml (= 100 g) de milieu liquide soit un ratio de 40. Pour l expérience en anaérobiose, nous avons choisi un ratio de 10 (10 g de sol pour 100 ml de milieu liquide, ce qui explique les concentrations initiales en Cr(VI) plus importantes dans le deuxième cas. Afin de pouvoir comparer plus facilement les résultats, nous avons reproduit les expériences en aérobiose avec un ratio de 10. Les résultats des cinétiques obtenues (moyenne de trois essais) en aérobiose et en anaérobiose sont présentés dans les figures suivantes. Dans les deux conditions testées, la concentration maximale de chrome (VI) en solution est atteinte seulement après 2 jours d agitation (à t=2 jours, C = 190 mg.l -1 de chrome (VI) en solution). On observe que la réduction du chrome (VI) par la microflore endogène du sol étudié est plus faible en condition anaérobie qu en condition aérobie pour la durée d incubation testée (3 semaines à 30 C). Dans le meilleur des cas, c est-à-dire avec le glucose comme source de carbone, la bio-réduction du chrome (VI) n atteint que 25% en condition anaérobie contre plus de 50% avec la même source de carbone en condition aérobie. Les essais en présence de biocide, ou sans source de carbone ou avec l éthanol donnent des résultats similaires (environ 15% de bio-réduction) indiquant d une part que l éthanol ne permet pas d augmenter la bio-réduction et d autre part que l essentiel de la réduction observée est alors de nature chimique. 160

172 RÉSULTATS ETUDE DE LA RÉDUCTION DU CR(VI) EN PRÉSENCE DE SOL POLLUÉ mg/l de Cr(VI) mg/l de Cr(VI) 200 biocide biocide sans carbone organique glucose sans carbone organique glucose éthanol jours jours Figure 29 : Bio-réduction du chrome (VI) en chrome (III) par la flore endogène en condition aérobie en milieu M63. Influence de la source de carbone organique. (30 C, 10 g de sol dans 100 ml de milieu) Figure 30 : Bio-réduction du chrome (VI) en chrome (III) par la flore endogène en condition anaérobie en milieu M63. Influence de la source de carbone organique. (30 C, 10 g de sol dans 100 ml de milieu)

173 RÉSULTATS ETUDE DE LA RÉDUCTION DU CR(VI) EN PRÉSENCE DE SOL POLLUÉ En conclusion, les essais de bio-réduction du chrome (VI) indiquent que la bio-réduction du chrome (VI) par la microflore endogène du sol est plus faible en condition anaérobie qu en condition aérobie dans les conditions de culture testées. Dans cette première partie de l étude, nous avons vérifié que les conditions testées par Nathalie Huck pendant son DEA (1997) étaient les plus propices à l observation de la disparition du chrome (VI). En effet, l incubation en anaérobiose d une suspension de sol avec du glucose ou de l éthanol (conditions testées par Lucile Barthet (2000)) ne permet pas d obtenir de réduction significative du Cr(VI) en solution par rapport aux témoins abiotiques. Le fait qu en milieu M63 la réduction soit plus importante en aérobiose qu en anaérobiose est en accord avec le type de souche isolée ayant une activité chromate réductase. En effet, il s agit d un Streptomyces thermocarboxydus qui est une bactérie décrite comme étant strictement aérobie. L étude de la réduction du chrome (VI) avec des suspensions de sol («milieu dispersé») a été réalisée dans l objectif d évaluer la faisabilité du traitement du sol pollué au chrome. Les expériences décrites dans les paragraphes suivants ont donc été réalisées en aérobiose Réduction du chrome (VI) par la flore endogène aérobie Comme nous venons de le voir, le sol pollué étudié contient une flore microbienne aérobie capable de réduire le chrome (VI) en condition aérobie. Nous avons testé différentes conditions de culture afin de connaître celles qui sont optimales pour une réduction rapide Effet de la source de carbone Afin de réduire microbiologiquement le Cr(VI) dans un sol pollué, il est nécessaire d apporter une source de carbone mais à des doses trop élevées pour ne pas obtenir des concentrations résiduelles de COT trop grandes. Le glycérol (noté Y) qui permet d obtenir des résultats bien meilleurs avec la souche pure (voir II 2.2) présente l avantage d apporter peu de carbone organique comparé au glucose. En effet 3 g.l -1 de glycérol correspond à 83 mm d atome de carbone contre 333 mm lorsque que l on apporte 10 g.l -1 de glucose. Nous avions déjà testé cette source de carbone dans les premières expériences avec du sol (voir Figure 28 page 159). Seul le glucose permettait d obtenir la réduction du chrome (VI) dans les essais. Dans le cas où l on travaille avec des suspensions de sol, le glucose est donc une bien meilleure source de carbone. 162

174 RÉSULTATS ETUDE DE LA RÉDUCTION DU CR(VI) EN PRÉSENCE DE SOL POLLUÉ Le fait que les résultats divergent de ceux obtenus en cultures pures peut s expliquer par le fait que le glycérol est peut-être métabolisé plus vite par toute la flore présente dans le sol ce qui réduit sa disponibilité pour la souche réductrice. On peut aussi imaginer que dans un milieu aussi complexe que le sol, le glycérol se combine avec d autres molécules présentes dans la suspension, le rendant ainsi indisponible pour le métabolisme de Streptomyces thermocarboxydus NH50. Nous avons aussi testé d autres concentrations en glucose moins importantes pour limiter l apport de carbone organique, mais 10 g.l -1 est la concentration optimale (voir chapitre II de la partie Résultats 2.2). Dans le souci de n apporter que ce qui est nécessaire à un échantillon de sol pour permettre la réduction du chrome (VI), nous avons testé l absence de nutriments minéraux apportés. Il apparaît que, même si l on apporte la source de carbone la plus favorable pour la réduction du chrome, à savoir le glucose, il n est pas possible d obtenir une réduction efficace (voir Figure 28). Compte tenu de ces résultats, nous choisirons d apporter du glucose plutôt que du glycérol lorsque nous travaillerons avec des suspensions de sol Effet d une augmentation de la flore endogène Dans cette étude, 2,5 g de sol pollué (à environ 1000 mg de Cr(VI) par kg de sol) ont, dans un premier temps, été incubés pendant 18 jours à 30 C en suspension dans 100 ml de milieu nutritif minéral M63 complémenté en glucose (10 g.l -1 ). Puis le mélange a été décanté pour récupérer le surnageant. 5 ml de ce surnageant, contenant la flore endogène enrichie, a servi à inoculer un nouvel essai contenant 2,5 g de sol et 95 ml de milieu M63 glucose (10 g.l -1 ). Le mélange obtenu est incubé dans les mêmes conditions expérimentales que précédemment et on suit la concentration en Cr(VI) en solution en fonction du temps. Sur la Figure 31, on observe nettement l effet positif de l inoculum qui enrichit la suspension de sol en micro-organismes réducteurs de chrome (VI). Cette étape d enrichissement permet de ne pas attendre que la flore endogène se développe en présence de chrome et d autres métaux toxiques présents dans le sol pollué étudié. 163

175 RÉSULTATS ETUDE DE LA RÉDUCTION DU CR(VI) EN PRÉSENCE DE SOL POLLUÉ mg,l -1 de Cr(VI) sol sol enrichi jours Figure 31 : Effet de l enrichissement en flore endogène sur l évolution de la concentration en chrome dans les essais contenant 2,5 g de sol (pollution initiale environ 1000 mg.kg -1 ) pour 100 ml de milieu minéral liquide M63 glucose (10 g.l -1 ) Effet de la concentration initiale en glucose Dans cette expérience, nous avons incubé pendant 21 jours à 30 C 10 g de sol dans 100 ml de milieu minéral M63 avec des concentrations variables en glucose (essais en triplicats). Les résultats sont présentés dans la Figure 32. On remarque que plus la concentration en glucose est importante, plus la réduction du chrome est rapide et ceci pour deux raisons essentielles : la matière organique est plus importante et peut réduire le chrome de façon abiotique, et le glucose présent permet une croissance optimale de la microflore qui peut réduire le chrome. Les essais similaires ont été réalisés dans les mêmes conditions mais avec un apport de la souche NH50 (sous forme de spores). Les résultats (Figure 33) sont identiques à ceux obtenus avec la flore endogène seule (Figure 32). Nous avions remarqué, dans les expériences précédentes que l apport d un inoculum (flore endogène enrichie) permettait de réduire plus rapidement le Cr(VI) contenu dans le sol (Figure 31). On constate ici que l apport de la souche pure sous forme de spores ne permet pas d accélérer les cinétiques de réduction du Cr(VI). Il est possible que la quantité de spores ne soit pas suffisante pour accélérer la réduction ou que la forme sous laquelle est apportée la souche NH50 ne soit pas adéquate. Les spores sont des cellules dont le métabolisme est ralenti. Apporter Streptomyces thermocarboxydus NH50 sous forme de mycéliums pourrait peut-être permettre de réduire plus rapidement le chrome présent. Cette hypothèse sera testée plus loin ( III 2.4.2). 164

176 RÉSULTATS ETUDE DE LA RÉDUCTION DU CR(VI) EN PRÉSENCE DE SOL POLLUÉ Abs 540nm normalis ée (10g sol /100 ml milieu liqui g/l 1 g/l 10 g/l 100 g/l temps (jours) Abs 540nm normalis ée (10g sol/100 ml milieu liquide ) g/l 1 g/l 10 g/l 100 g/l temps (jours) Figure 32 : Effet de la concentration en glucose en milieu M63 sur la réduction du Cr(VI) en suspension de sol sans enrichissement (L/S = 10, température d incubation : 30 C) Figure 33 : Effet de la concentration en glucose en milieu M63 sur la réduction du Cr(VI) en suspension de sol avec enrichissement (NH50 sous forme de spores) (L/S = 10, température d incubation : 30 C)

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178 RÉSULTATS ETUDE DE LA RÉDUCTION DU CR(VI) EN PRÉSENCE DE SOL POLLUÉ Effet de la concentration initiale en chrome (VI) Le chrome (VI), ainsi que les autres métaux contenus dans le sol pollué étudié, peut présenter une certaine toxicité pour la flore microbienne endogène et exogène. En faisant varier la quantité de sol par unité de volume de milieu liquide, on peut modifier la concentration initiale en chrome dans les essais. Comme nous avons dû re-contaminer le sol, nous disposons cependant d échantillons avec des degrés de pollution variable permettant de travailler à des concentrations variables en Cr(VI) tout en maintenant le même ratio L/S dans les essais. a Essai avec la flore endogène sans enrichissement Pour cette expérience, nous avons choisi de garder le même ratio L/S dans les essais : seule la concentration en chrome présente dans le sol varie d un essai à l autre. Ainsi le ratio L/S n influencera pas les résultats, et l on pourra observer l effet de la concentration initiale en Cr(VI). Le Tableau XXXV donne les résultats obtenus pour trois concentrations initiales différentes. Pour ces expériences, nous avons complémenté le milieu M63 par du glucose à 10 g.l -1 et tous les essais ont été réalisés en triplicats. Tableau XXXV : Effet de la concentration initiale en Cr(VI) sur la bio-réduction du Cr(VI) par la flore endogène en condition aérobie après 21 jours d incubation à 30 C en suspension de sol (milieu M63, glucose à 10 g.l-1, ratio L/S = 100 ml pour 10 g de sol). Concentration initiale en Cr(VI) moyenne * % de réduction du chrome (VI) masse de Cr(VI) réduit 200 mg.l -1 (4 mm) 50 % +/- 3 9,4-10,6 mg 100 mg.l -1 (2 mm) 83 % +/- 4 7,9-8,7 mg 50 mg.l -1 (1 mm) 99 % +/- 1 4,9-5 mg * : en considérant que la totalité du chrome (VI) apporté par le sol passe en solution 167

179 RÉSULTATS ETUDE DE LA RÉDUCTION DU CR(VI) EN PRÉSENCE DE SOL POLLUÉ Si l on s intéresse au pourcentage de réduction du chrome, on peut remarquer que l efficacité de réduction augmente lorsque la concentration en Cr(VI) diminue. Cependant puisque les concentrations initiales en Cr(VI) sont différentes, il convient d analyser les résultats en quantité de chrome réduit. On remarque, dans ce cas, que la masse de chrome réduit augmente fortement lorsque la concentration en Cr(VI) passe de 50 à 100 mg.l -1, pour augmenter plus faiblement quand on passe à une concentration initiale en Cr(VI) de 200 mg.l -1. On peut penser à un effet inhibiteur du Cr(VI) à des concentrations dépassant 100 mg.l -1. Pour réduire en totalité le Cr(VI) à partir d une concentration initiale de 200 mg.l -1, une durée d incubation supérieure à 42 jours serait nécessaire d après les données du Tableau XXXV. Travailler sur une durée si longue demande de vérifier régulièrement l évaporation. De plus, la source de carbone peut devenir limitante. Pour maintenir la croissance microbienne et ainsi permettre la réduction complète du Cr(VI) à partir d une concentration initiale élevée, il est possible que du glucose doive être rajouté dans l Erlenmeyer. b Essai avec la flore endogène enrichie Ces essais ont été réalisés en mettant le sol en suspension dans le milieu liquide M63 avec 10 g.l -1 de glucose surnageant inoculé avec le surnageant d une suspension de sol d un essai précédent. Cette procédure permet d enrichir la suspension de sol avec la flore endogène. Nous avons travaillé avec le sol pollué à environ 1000 mg de Cr(VI).kg -1. La concentration initiale en Cr(VI) a ici été contrôlée en utilisant des masses différentes de sol dans les différents essais pour un même volume de milieu liquide. On peut cependant considérer que la variation du ratio L/S n a probablement pas, dans les limites utilisées ici (de 10 à 40) d effet significatif sur l activité microbienne. Les résultats ont été reportés dans le Tableau XXXVI. Tableau XXXVI : Effet de la concentration initiale en Cr(VI) sur la bio-réduction du Cr(VI) par la flore endogène enrichie en condition aérobie après 3 jours d incubation à 30 C (100 ml de milieu M63, glucose 10 g.l -1 ). g de sol Concentration initiale en Cr(VI) moyenne * % de réduction du chrome (VI) mg de Cr(VI) réduit 2,5 (L/S = 40) 25 mg.l -1 (0,5 mm) 98 +/- 2 2,4-2,5 mg 5 (L/S = 20) 50 mg.l -1 (1 mm) 99 +/- 1 4,9-5 mg 10 (L/S = 10) 100 mg.l -1 (2 mm) 21,5 +/- 4 1,75-2,55 mg * : en considérant que la totalité du chrome (VI) apporté par le sol passe en solution On remarque que la réduction est beaucoup plus rapide lorsque la suspension est enrichie par la flore endogène (Tableau XXXVI) que dans l essai précédent (Tableau XXXV). On note qu à 100 mg.l -1 la réduction ne concerne que 21,5 % du chrome présent soit entre 1,7 et 2,5 mg. Lorsque la concentration en chrome est deux fois plus faible, la réduction est deux fois plus rapide (5 mg de Cr(VI) en 3 jours pour une concentration initiale de 50 mg.l -1 contre environ 2 mg pour une concentration initiale de 100 mg.l -1 ). Pour les 168

180 RÉSULTATS ETUDE DE LA RÉDUCTION DU CR(VI) EN PRÉSENCE DE SOL POLLUÉ concentrations initiales en Cr(VI) de 25 et 50 mg.l -1, 3 jours d incubation à 30 C suffisent ici à réduire la quasitotalité de Cr(VI) (Tableau XXXVI), alors que sans enrichissement préalable, un temps d incubation plus long est nécessaire (Tableau XXXV). Cependant, lorsque que la concentration initiale en Cr(VI) est de 100 mg.l -1, on observe que la réduction du Cr(VI) est moins rapide puisqu en 3 jours d incubation, seuls 2 mg de Cr(VI) sont réduits en moyenne, contre environ 5 mg pour une concentration initiale en Cr(VI) de 50 mg.l -1 (Tableau XXXVI). L effet inhibiteur apparaît donc dès 100 mg.l -1 soit 2 mm. Lors de l étude de la réduction du Cr(VI) par des cultures pures de la souche NH50, nous avons toujours utilisé une concentration initiale de 1 mm de Cr(VI) car à partir de 2 mm, les mycéliums de Streptomyces thermocarboxydus NH50 avaient beaucoup de difficulté à se développer. Nous avions aussi testé l ajout de 2 mm de chrome (VI) dans des cultures de 3 jours où les mycéliums s étaient développés sans la présence de chrome et nous avions constaté que la vitesse de réduction était beaucoup plus longue qu avec une concentration en Cr(VI) deux fois moindre. Dans les expériences réalisées en milieu dispersé avec la flore endogène enrichie, nous observons 21,5 % de réduction en 3 jours avec une concentration initiale en Cr(VI) de 2 mm (Tableau XXXVI), pourcentage de réduction jamais atteint aussi rapidement avec une telle concentration initiale en Cr(VI) en culture pure. Il semble donc qu en culture pure, la réduction du chrome (VI) soit inhibée par de plus faibles concentrations initiales en Cr(VI). Travailler en milieu dispersé permet de réduire le Cr(VI) plus rapidement et à des concentrations en Cr(VI) plus importantes qu en cultures pures Réduction du chrome (VI) par des flores exogènes aérobies Comme nous avons pu l observer dans les paragraphes précédents, la réduction du chrome (VI) contenu dans le sol pollué est plus rapide lorsque la suspension de sol est inoculée par une culture mixte de la flore endogène. Ces essais avaient pour objectif de déterminer si l enrichissement de la flore endogène du sol (technique dite de bio-augmentation) permettrait d améliorer le rendement de bio-immobilisation du chrome (VI) présent à concentration relativement élevée. Nous avons aussi envisagé d enrichir le sol avec une souche pure plutôt qu avec une culture mixte afin d enrichir la suspension de sol par la bactérie endogène responsable de la réduction (Streptomyces thermocarboxydus NH50) ou par une souche exogène. Nous avons donc utilisé une souche de Pseudomonas fluorescens LB300, provenant de la collection ATCC (American Type Culture Collection) référence et décrite dans la littérature comme réduisant le Cr(VI) en Cr(III) enzymatiquement, et la souche que nous avons isolée du sol pollué lui-même, Streptomyces thermocarboxydus NH50. Ces deux souches bactériennes ont été ajoutées à des suspensions de sol et la réduction du chrome (VI) a été suivie afin de déterminer les conditions les plus favorables au phénomène de réduction du chrome. 169

181 RÉSULTATS ETUDE DE LA RÉDUCTION DU CR(VI) EN PRÉSENCE DE SOL POLLUÉ Pseudomonas fluorescens LB300 La première série d expériences a consisté à vérifier qu une culture pure de la souche de Pseudomonas fluorescens LB300 dont nous disposions réduisait effectivement le chrome (VI). Ces essais préliminaires ont été réalisés sans sol afin de ne pas avoir de problème de toxicité liée à la présence d autres métaux contenus dans le sol. Les résultats sont présentés dans la Figure 34. mg.l -1 de Cr(VI) en solution glucose 10 g/l glycérol 3 g/l jours Figure 34 :Bio-réduction du chrome (VI) par Pseudomonas fluorescens LB 300 en culture pure en milieu M63 à 30 C. Influence de la source de carbone (glucose.10 g.l -1 ou glycérol à 3 g.l -1 soit respectivement 333 et 83 mm de carbone) On remarque que la souche de Pseudomonas fluorescens LB300 est capable de réduire le chrome (VI) mais de manière efficace seulement en présence de glucose. Il faut néanmoins une vingtaine de jours pour voir disparaître tout le chrome (VI). Nous obtenions des cinétiques identiques pour le glucose avec Streptomyces thermocarboxydus NH50 (voir Figure 18 page 126). Le glycérol qui permet d obtenir des cinétiques plus rapides avec la souche NH50, permet un bon développement bactérien de P. fluorescens LB300 mais ne permet de réduire le chrome (VI) que de 20 %. Après avoir vérifié que la souche P. fluorescens réduisait le chrome (VI) en milieu liquide, nous avons testé son efficacité sur des suspensions de sol. Les essais ont été réalisés en mettant en suspension 10 g de sol dans 100 ml de milieu M63 avec ou sans glucose, inoculé par P. fluorescens LB300 (voir Matériels et Méthodes). Les résultats sont donnés dans le Tableau XXXVII. 170

182 RÉSULTATS ETUDE DE LA RÉDUCTION DU CR(VI) EN PRÉSENCE DE SOL POLLUÉ Tableau XXXVII : Réduction du chrome (VI) en suspension de sol par Pseudomonas fluorescens LB300 en 21 jours d incubation à 30 C. g.l -1 de glucose Concentration initiale en Cr(VI) en solution après 2 jours % de réduction du chrome (VI) mg de Cr(VI) réduit P. fluorescens mg.l -1 6 % +/ ,4 mg P. fluorescens mg.l -1 22% +/ ,8 mg Flore endogène non enrichie mg.l % +/-3 9,4-10,6 mg Les résultats obtenus révèlent que l apport exogène de Pseudomonas fluorescens LB300 ne permet pas d augmenter la bio-réduction du chrome (VI) contenu dans le sol. Cette bio-réduction est même moins importante qu avec la flore endogène non enrichie. La faible réduction du chrome (VI) par P. fluorescens LB300 dans ces essais en suspension de sol pourrait s expliquer par la concentration en chrome quatre fois plus élevée que dans les essais préliminaires (Figure 34) qui pourrait avoir un effet inhibiteur sur la souche. Les résultats obtenus avec cette souche exogène n étant pas meilleurs, ni même équivalents à ceux obtenus avec la flore endogène non enrichie, nous avons choisi de ne pas continuer davantage avec Pseudomonas fluorescens LB Streptomyces thermocarboxydus NH50 a Enrichissement sous forme de spores Nous avons essayé d enrichir la suspension de sol par cette souche afin d améliorer l efficacité de la réduction. La disparition du chrome (VI) a été suivie dans des essais contenant 10 g de sol (Cr(VI) à environ 2000 mg.kg -1 ) et 100 ml de milieu minéral liquide M63 complémenté ou non en glucose. 400 µl d une suspension de spores ont été apportés dans chaque essai, soit une concentration dans le milieu liquide de 10 7 spores.ml -1, concentration relativement suffisante pour voir le phénomène de réduction apparaître assez rapidement (en culture pure : voir chapitre II des Résultats 2.1). Les résultats sont présentés dans la Figure

183 RÉSULTATS ETUDE DE LA RÉDUCTION DU CR(VI) EN PRÉSENCE DE SOL POLLUÉ mg.l -1 de Cr(VI) en solution sans glucose glucose à 10 g/l jours Figure 35 : Réduction du chrome (VI) en suspension de sol (L/S = 10) par ajout de la souche Streptomyces thermocarboxydus NH50 sous forme de spores (10 7 spores.ml -1, 30 C). Ces résultats montrent que l ajout de spores de NH50 à une suspension de sol permet une réduction de 40 % ± 5 du chrome présent initialement en 21 jours en présence de glucose 10 g.l -1. Si nous comparons ces résultats à ceux obtenus avec la flore endogène non enrichie dans les mêmes délais et avec la même concentration initiale en chrome dans le sol (Tableau XXXV page 167), nous remarquons que l enrichissement par S. thermocarboxydus NH50 sous forme de spores n améliore pas la réduction (50 % sans enrichissement et 40 % avec). De la même manière qu avec P. fluorescens LB300 ( III page 170), l introduction d une souche pure comme inoculum n améliore donc pas la réduction, voire la rend moins efficace. L ajout d une souche pure exogène ou endogène enrichie peut provoquer une compétition entre les micro-organismes qui peut conduire à la diminution d activité de la population réduisant le chrome. Un autre facteur peut entrer en jeu. Un certain temps s est écoulé entre la série d essais avec la flore endogène et ceux avec la flore exogène. Il est possible que la population endogène soit modifiée tant quantitativement que qualitativement. Si l on répète les manipulations avec un échantillon de sol qui a été conservé plusieurs mois à 4 C, il faut plus de temps pour avoir le même pourcentage de réduction. On peut aussi penser que le fait d ajouter la souche NH50 sous forme de spores n est pas la meilleure méthode comme nous l avions observé au III Figure 32 et Figure 33. En effet ces bactéries existent dans le sol sous forme de mycélium. La présence du chrome et d autres métaux dans le sol peut ralentir la germination des spores et le développement des mycéliums de Streptomyces. C est pour cette raison que nous avons comparer l efficacité de la bio-réduction en fonction de la forme sous laquelle était apportée la souche NH

184 RÉSULTATS ETUDE DE LA RÉDUCTION DU CR(VI) EN PRÉSENCE DE SOL POLLUÉ b Ensemencement de S. thermocarboxydus NH50 sous la forme mycélienne Pour produire un mycélium, les spores doivent germer. Pour cela, il est nécessaire que le milieu de culture soit riche. Nous avons donc incubé les spores 2 jours dans 50 ml de milieu LB à 30 C pour permettre aux spores de germer et de donner naissance à un mycélium important. Cette culture a ensuite été centrifugée et le culot lavé puis resuspendu dans 100 ml de milieu minéral M63 glucosé (10 g.l -1 ) afin de n apporter dans les essais que les mycéliums et non pas du milieu LB. Puis 10 g de sol pollué ont été mis en suspension dans ce milieu. Les résultats sont présentés dans le Tableau XXXVIII. Tableau XXXVIII : Réduction du chrome (VI) en suspension de sol (L/S = 10) par Streptomyces thermocarboxydus NH50 sous forme de spores ou de mycélium en 16 jours à 30 C. Concentration maximale en Cr(VI) en solution % de réduction du chrome (VI) NH50 spores 200 mg.l % +/- 5 NH50 mycélium 200 mg.l % +/- 4 Flore endogène 200 mg.l % +/-3 Le Tableau XXXVIII montre que l ensemencement de la suspension de sol par Streptomyces thermocarboxydus NH50 sous la forme mycélienne permet d augmenter le rendement de bio-réduction du chrome (VI). En effet, 60 % du chrome (VI) initialement présent dans le sol est réduit après 16 jours d incubation en condition aérobie. Sur des échantillons de sol fortement pollué, la croissance des micro-organismes est difficile et ralentie à cause de la toxicité des métaux présents. L ajout de spores de NH50 ne permet pas d améliorer l efficacité de la bio-réduction. Par contre, si cette même quantité de spores est au préalable germée en milieu riche, la réduction est un peu plus rapide. Utiliser la microflore endogène d un sol dans un procédé de dépollution est intéressant mais peut présenter des inconvénients. En effet, il faut être sûr qu entre les études de faisabilité en laboratoire et les applications industrielles éventuelles, la population globale du sol ne sera pas modifiée si l on veut obtenir des résultats comparables. Or le stockage du sol pendant plusieurs mois peut être à l origine d une baisse d activité des micro-organismes d intérêt. Elaborer un procédé utilisant une souche pure exogène ou endogène enrichie présente l avantage permet d espérer une meilleure reproductibilité. La survie et le bon développement dans le sol de la souche ainsi apportée seront a priori meilleurs dans le cas d une souche endogène. On peut envisager de travailler avec la flore endogène mixte enrichie mais il est assez difficile de contrôler sa qualité sur de longues périodes. Il faut en effet maîtriser les conditions de culture pour conserver préserver toutes les caractéristiques de la flore mixte. Or il est tout à fait possible que les cultures successives en présence de chrome provoquent des mutations telles que les propriétés initiales de l inoculum soient affectées. 173

185 RÉSULTATS ETUDE DE LA RÉDUCTION DU CR(VI) EN PRÉSENCE DE SOL POLLUÉ Dans la perspective de la mise au point d un procédé de traitement de sol pollué au chrome hexavalent avec apport de flore exogène ou endogène enrichie (afin d avoir des résultats plus reproductibles qu avec la flore endogène dont la qualité peut varier en fonction du temps de stockage mais aussi du sol considéré), nous avons continué à envisager l utilisation de la souche de S. thermocarboxydus NH50. Cette souche peut être apportée sous forme de mycéliums ou les surnageants de culture peuvent être utilisés puisque les travaux présentés au chapitre II ont montré qu ils referment l activité réductrice Conclusions Les résultats obtenus en suspension de sol nous ont permis de constater que les conditions d incubation aérobie donnent une meilleure réduction biologique du chrome (VI) en chrome (III) qu en condition d incubation anaérobie. La souche de Streptomyces thermocarboxydus NH50 isolée au LAEPSI et la souche Pseudomonas fluorescens LB 300 utilisées pour ensemencer le sol pollué n ont pas permis d augmenter très significativement le rendement de réduction du chrome (VI) à teneur relativement élevée dans le sol. Néanmoins, compte tenu des résultats sensiblement meilleurs avec S. thermocarboxydus NH50 sous forme de mycéliums, les essais en microcosmes et en lysimètres seront réalisés avec cette souche. En outre, il s avère indispensable d ajouter une source de carbone organique et de préférence sous la forme de glucose pour garantir le bon développement des micro-organismes endogènes et/ou exogènes responsables de l activité bio-réductrice. Enfin, la localisation extra-cellulaire de l activité réductrice de S. thermocarboxydus NH50 permet d envisager des expériences utilisant les propriétés réductrices des surnageants de culture pour réduire le chrome (VI) contenu dans le sol. L utilisation de ces surnageants pourra permettre de s affranchir du problème de toxicité de certaines substances contenues dans le sol vis-à-vis de la flore endogène ou exogène 174

186 RÉSULTATS ETUDE DE LA RÉDUCTION DU CR(VI) EN PRÉSENCE DE SOL POLLUÉ 3.Expériences en microcosmes Les études en microcosmes («image réduite du monde») consistent à incuber de petites quantités de sol avec un milieu liquide pour reproduire un scénario de traitement in-situ ou ex-situ selon les cas. Contrairement aux essais décrits précédemment, le sol n est pas mis en suspension par agitation dans une phase aqueuse. Dans les expériences en microcosmes, le ratio L/S est en effet diminué par rapport aux essais en milieu dispersé afin de réduire le volume réactionnel pour se retrouver dans des conditions visant à simuler l incubation du sol en biopile. Plus les volumes sont importants, plus la gestion du procédé sera difficile et coûteuse. C est pour ces raisons que nous avons étudié ici l immobilisation du chrome dans le sol en utilisant de faibles volumes de milieu liquide. Nous avons vu précédemment dans les expériences en milieu dispersé (voir III 2) que la source de carbone avec laquelle nous obtenions les meilleurs résultats était le glucose. La plupart des expériences seront donc conduites en présence de cette source de carbone mais nous avons cependant testé le glycérol pour vérification. Nous avions aussi montré que la souche de Pseudomonas fluorescens LB300 n était pas aussi efficace que la souche endogène NH50 pour la réduction du chrome contenu dans le sol ( II 2.4.1). L essentiel des essais a donc été conduit avec la souche S. thermocarboxydus NH50. Certains essais ont toutefois été réalisés avec la souche P. fluorescens LB300 pour comparaison Effet de l apport d un inoculum de NH50 (sous forme de spores) et de la source de carbone pour un rapport massique C/N/P/Cr(VI) de 100/8/0,5/1,25 Ces expériences ont été réalisées avec le sol pollué à 300 mg.kg -1 de Cr(VI). Nous avons incubé 10 g de sol (apportant 3 mg de Cr(VI)) avec 3 ml de milieu liquide. Dans les essais en culture pure avec la souche NH50 en milieu M63 glucose (10 g.l -1 ), la concentration en chrome (VI) était généralement de 1 mm soit 50 mg.l -1. Nous avons choisi de garder, pour ces premières expériences en microcosmes, un rapport carbone/cr(vi) identique à celui des expériences en culture pure (soit 80 mg de carbone/mg de Cr(VI) correspondant à un rapport massique C/C de 100/1,25). Si l on suppose que la totalité du Cr(VI) (sous forme de CrO 4 2-) oxyde le glucose selon la réaction suivante : C 6 H 12 O CrO H + 8 Cr HCO H 2 O 175

187 RÉSULTATS ETUDE DE LA RÉDUCTION DU CR(VI) EN PRÉSENCE DE SOL POLLUÉ 1 mole de glucose réagit avec 8 moles de Cr(VI). Dans nos essais, nous avons apporté 3 mg de Cr(VI) soit environ 57,7 µmoles qui peuvent donc oxyder 7,21 µmoles de glucose (soit environ 1,3 g de glucose) Dans ce cas le rapport C/Cr(VI) est de 100/600. En utilisant le rapport C/N de 100/1,25, nous sommes en très large excès de carbone par rapport au chrome (VI). L excès de glucose sert, pour une majeure partie, à la croissance des micro-organismes Cependant, cette quantité excessive de carbone peut augmenter significativement le phénomène de réduction abiotique. Nous avons donc apporté 0,6 g de glucose ou 1,2 g de glycérol sous forme de poudre dans chacun des essais. L azote et le phosphore sont ensuite ajoutés (sous forme de (NH 4 ) 2 SO 4 et de Na 2 HPO 4 en poudre) de façon à obtenir un rapport massique C/N/P de 100/8/0,5 proche du rapport admis comme idéal (100/4/1) pour le développement de la microflore. Le pourcentage de réduction du Cr(VI) est calculé en faisant le rapport de la quantité de Cr(VI) restant dans le sol après 3 semaines d incubation (déterminé par extraction à l eau sur la totalité de l échantillon) sur la quantité de Cr(VI) contenu dans 10 g de sol avant incubation. Les résultats obtenus, présentés dans le Tableau XL, sont la moyenne de 3 essais pour chacune des conditions testées. L incubation a eu lieu à 30 C à l obscurité dans des boîtes de Petri en verre de 9 cm de diamètre. Tableau XL :Pourcentage de réduction du chrome (VI) en 3 semaines d incubation à 30 C en microcosmes (10 g de sol apportant 3 mg de Cr(VI) et 3 ml de milieu liquide) avec un rapport massique C/N/P/ Cr(VI) de 100/8/0,5/1,25) Stérilisation préalable du sol (autoclavage) Inoculum exogène non non Source de carbone ratio C/N/P 100/8/0,5 oui non non non Glucose (0,2 g/mg de Cr(VI)) NH50 (10 9 spores) NH50 (10 9 spores) Glycérol (0,4 g/mg de Cr(VI)) % de réduction 45 % ± 3 80 % ± 4 80 % ±-4 25 % ± 2 Cr(VI) réduit 1,35 mg 2,4 mg 2,4 mg 0,75 mg En considérant que l autoclavage a été efficace, on observe que la réduction abiotique du Cr(VI) est très importante et atteint 45 % (Tableau XL). Le glucose, qui est à la concentration de 200 g.l -1 dans les 3 ml de milieu liquide, peut être un donneur d électrons qui permet de réduire le Cr(VI) en Cr(III). Avec du sol non stérile (donc avec la flore endogène), et avec 0,2 g de glucose/mg de Cr(VI), on atteint 80 % de réduction, pourcentage identique à celui obtenu avec l ajout de la souche NH50 au sol non stérile. L ajout de la souche NH50 sous forme de spores au sol non stérile ne permet pas d obtenir des résultats significativement supérieurs comparés à ceux avec la flore endogène ce qui confirme les résultats obtenus en milieu dispersé. Les résultats obtenus ne justifient pas que l on dope le sol avec une quantité importante de glucose car cette quantité de carbone organique supplémentaire augmente uniquement la réduction abiotique du chrome. 176

188 RÉSULTATS ETUDE DE LA RÉDUCTION DU CR(VI) EN PRÉSENCE DE SOL POLLUÉ Le Tableau XL montre, d autre part, que même avec des quantités importantes de glycérol (0,4 g/mg de Cr(VI)), la réduction du chrome est relativement faible. En effet, avec une flore endogène active et la souche NH50, la réduction du chrome n atteint que 25 % soit quasiment deux fois moins que sans aucune activité microbienne mais avec 0,2 g de glucose/mg de Cr(VI). Ce résultat confirme le résultat obtenu en milieu dispersé présenté dans la Figure 28 page 159 à savoir que le glycérol n est pas la source de carbone appropriée pour permettre la réduction du chrome (VI) en présence de sol Effet de l apport d un inoculum (NH50 ou LB300) pour un rapport massique C/N/P/Cr(VI) de 100/14/103/55,5 (milieu M63) Cette deuxième série d expériences a été réalisée avec du sol pollué à raison d environ 1000 mg de Cr(VI) par kg de sol. Le Tableau XLI présente les pourcentages de réduction du Cr(VI) obtenus en incubant 5 g de sol (apportant 5 mg de Cr(VI)) dans 3 ml de milieu M63 à 7,5 g.l -1 de glucose (rapport C/N/P de 100/14/103) à 30 C pendant 3 semaines et à l obscurité (chaque essai a été réalisé en triplicat). Le rapport C/Cr(VI) est ici de 100/55,5, ce qui correspond à un apport de carbone 45 fois plus faible (par mg de Cr(VI)) que dans l essai précédent mais le glucose est toujours en excès. Pour réduire 5 mg de Cr(VI), il faudrait, selon l équation précédente 2,16 mg de glucose. Dans ces essais, nous en apportons seulement 7 fois plus de glucose que nécessaire (contre environ 450 fois trop dans l expérience précédente). Cette expérience a permis d observer que la réduction du Cr(VI) dans le sol non stérile est négligeable (de l ordre de 3 %). Le faible rapport C/Cr(VI) utilisé ici par rapport aux essais précédents explique la quasiabsence de réduction abiotique d une part et de réduction par la flore endogène d autre part. L apport d un inoculum de la souche NH50 sous forme de mycélium au sol non stérile ne permet pas la réduction du chrome (VI). Par rapport aux essais où la suspension de sol était agitée, nous nous trouvons ici avec des volumes beaucoup plus petits ce qui signifie une concentration en chrome (VI) en solution très grande (si tout le chrome (VI) contenu dans le sol passe en solution, nous attendons des concentrations de l ordre de 1670 mg.l -1 ). Dans ce cas il est donc possible de penser à un effet toxique du chrome compte tenu des hautes concentrations en solution. Cette toxicité pourrait expliquer le faible taux de réduction observé même avec l apport de NH50. Cependant si l on apporte un inoculum de NH50 sous forme de mycélium, au sol stérile, on observe un pourcentage de réduction de 57 %. Il semble donc que dans le premier cas, le principal phénomène qui empêchait la réduction du chrome était la compétition de NH50 apportée avec les micro-organismes endogènes déjà présents. Le fait de stériliser le sol permet de s affranchir de cette compétition. Ainsi, les nutriments apportés sont disponibles exclusivement pour la souche NH50 ajoutée. 177

189 RÉSULTATS ETUDE DE LA RÉDUCTION DU CR(VI) EN PRÉSENCE DE SOL POLLUÉ Tableau XLI : Pourcentage de réduction du chrome (VI) en 3 semaines d incubation à 30 C en microcosmes (5 g de sol apportant 5 mg de Cr(VI) et 3 ml de milieu M63 à 7,5 g.l -1 de glucose avec S. thermocarboxydus NH50 et P. fluorescens LB300 avec un rapport massique C/N/P/Cr(VI) de 100/14/103/55,5 Stérilisation préalable du sol (autoclavage) Inoculum exogène non oui non oui non NH50 (mycélium) 1 NH50 (mycélium) 1 LB300 1 % de réduction 3 % +/-2 57 % +/-3 3 % +/-2 28 % +/-4 Cr(VI) réduit 0,15 mg 2,85 mg 0,15 mg 1,4 mg 1 : les inoculums proviennent d une culture de la souche correspondante de 6 jours en milieu minéral sans chrome à 30 C. Les essais avec la souche de Pseudomonas fluorescens LB300 confirment ceux obtenus en milieu dispersé. Cette souche réduit le chrome (VI) présent dans le sol mais en réduit moitié moins que la souche de Streptomyces dans les mêmes conditions. Ces deux premières séries d expérience en microcosmes n ont pas permis d obtenir une réduction totale du chrome (VI) dans le sol en trois semaines. L incubation du sol avec une si faible quantité de liquide entraîne des concentrations très fortes en ions chromate en solution et donc une toxicité possible pour la flore endogène ou exogène. Dans cette série d essais, l apport réduit de carbone peut également expliquer que la réduction du Cr(VI) ne soit pas totale. On observe également, comme dans les essais en milieu dispersé, que l apport exogène de P. fluorescens LB300 ou de spores de S. thermocarboxydus NH50 dans du sol non stérile ne permet pas d améliorer la réduction du Cr(VI). Nous avons enfin constaté à nouveau que la source de carbone la plus adaptée pour avoir une flore endogène ou exogène active en présence de sol est le glucose plutôt que le glycérol. Les études complémentaires en microcosmes que nous allons présenter dans les paragraphes suivants ont donc été conduites avec des volumes de liquide plus importants et sur une durée un peu plus longue pour tenter d obtenir des réductions totales. D autre part, ces travaux ont porté sur l utilisation des surnageants de culture pour tenter de s affranchir des problèmes de toxicité possibles avec les cellules vivantes. 178

190 RÉSULTATS ETUDE DE LA RÉDUCTION DU CR(VI) EN PRÉSENCE DE SOL POLLUÉ 3.3. Etude en microcosmes de la réduction par des surnageants de culture Lors de l étude de la réduction du chrome (VI) en culture pure de Streptomyces thermocarboxydus NH50 (voir chapitre II de la partie Résultats), nous avons observé que l activité réductrice était contenue dans le surnageant. La souche NH50 produit des molécules capables de réduire le chrome (VI) en chrome (III). Le principal avantage d utiliser des surnageants de culture est que l on n utilise pas d organismes vivants pour réduire le chrome, on apporte les molécules actives produites. Ainsi, nous n avons plus les problèmes liés à la toxicité du chrome et des autres métaux présents dans le sol pollué à traiter Effet de la dilution des surnageants Lorsque nous avons étudié la réduction du chrome par S. thermocarboxydus NH50 en culture pure, nous avions observé que : - la réduction est plus rapide si la source de carbone est du glycérol, - l activité réductrice est contenue dans le surnageant de culture de ces bactéries et est d autant plus efficace que les bactéries ont été en contact avec du chrome au préalable (le surnageant S, provenant d une culture de quelques jours de NH50 en milieu minéral glycérolé, est moins efficace que SCr, provenant d une culture de la même souche dans le même milieu mais contenant initialement une concentration en chrome de 1 mm). Nous avons donc, dans ces essais en microcosmes, utilisé le surnageant SCr le plus actif obtenu d une culture de la souche NH50 en milieu minéral M63 + glycérol + 1 mm de Cr(VI). Ce surnageant, après avoir été filtré sur filtre 0,2 µm pour éliminer toute cellule bactérienne, a été utilisé pur ou dilué au ½ ou au 1/10. Pour comparer les pourcentages de réduction, nous avons incubé 2,5 g de sol dans 25 ml de milieu M63Y, milieu qui sert à obtenir le surnageant SCr. Pour cette expérience, nous avons utilisé le sol à 1800 mg de Cr(VI) par kg. L incubation a lieu à 30 C à l obscurité pendant 4 semaines et chaque essai a été réalisé en triplicat. Le pourcentage de réduction du Cr(VI) est calculé comme précédemment en faisant le rapport de la quantité de Cr(VI) restant dans le sol après 4 semaines d incubation (déterminé par extraction à l eau sur la totalité de l échantillon) sur la quantité de Cr(VI) contenu dans le sol avant incubation. 179

191 RÉSULTATS ETUDE DE LA RÉDUCTION DU CR(VI) EN PRÉSENCE DE SOL POLLUÉ Cette troisième série d expériences a été réalisée en boîtes de Petri en verre avec des quantités de liquide 8 fois plus importantes que dans les deux premières séries (soit 25 ml de milieu liquide pour 4,5 mg de Cr(VI) contre 3 ml pour 5 mg de Cr(VI) précédemment). De cette façon, si l on suppose que tout le chrome (VI) passe en solution, la concentration initiale en chrome dans ces expériences serait de l ordre 180 mg.l -1 (3,5 mm de Cr(VI)) contre environ 1600 mg.l -1 dans les essais précédent. Les résultats obtenus sont présentés dans le Tableau XLII. Tableau XLII : Pourcentage de réduction du chrome (VI) en 4 semaines d incubation à 30 C en microcosmes (2,5 g de sol non stérile apportant 4,5 mg de Cr(VI) et 25 ml de surnageants de culture de S. thermocarboxydus NH50, de milieu M63 (rapport massique C/N/P/Cr(VI) de 100/14/103/15) ou d eau Milieu liquide M63 + glycérol (3 g.l -1 ) SCr pur SCr ½ SCr 1/10 eau Inoculum non NH50 (spores) non non non non % de réduction 28,9 % ± 4 55, 6 % ± 2 99,6 % ± 0,4 51,2 % ± 3 17,8 % ± 5 26,7 ± 5 Cr(VI) réduit 1,3 mg 2,5 mg 4,48 mg 2,3 mg 0,8 mg 1,2 mg On remarque que dans les essais contenant du sol non stérile (donc avec la flore endogène active) et du milieu minéral glycérolé, on obtient environ 29 % de réduction ce qui est comparable au pourcentage de réduction obtenu en incubant le sol avec de l eau. La flore endogène est donc peu active dans ces conditions car le glycérol n est pas une source de carbone favorable. Si l on ajoute la souche NH50 sous forme de spores, on atteint environ 55 % de réduction du chrome. Ces résultats montrent que le fait d avoir augmenté le ratio L/S permet d avoir une concentration en chromates en solution plus faible et donc moins toxique pour la souche NH50 ajoutée. Dans les essais précédents avec 3 ml de milieu minéral glucosé pour 5 g de sol non stérile contenant 5 mg de Cr(VI), nous obtenions à peine 3 % de réduction du chrome (voir Tableau XLI) alors que NH50 était apportée sous forme de mycélium dont on a montré qu elle était plus favorable (voir III 2.4.2). L apport de la souche NH50 en présence de sol non stérile peut donc donner de meilleurs rendements de réduction du chrome à condition d avoir une concentration en chromates pas trop élevée. Les résultats montrent aussi que l utilisation de surnageant pur permet d obtenir une réduction du Cr(VI) quasi complète. La dilution au ½ ne permet de réduire que la moitié du chrome présent et la dilution au 1/10 donne un pourcentage de réduction du Cr(VI) similaire à celui obtenu avec de l eau compte tenu des incertitudes expérimentales. 180

192 RÉSULTATS ETUDE DE LA RÉDUCTION DU CR(VI) EN PRÉSENCE DE SOL POLLUÉ Cette troisième série d expériences a donc donné des résultats encourageants quant à l utilisation des surnageants de cultures de la souche Streptomyces thermocarboxydus NH50 pour réduire le chrome (VI) contenu dans un sol pollué Utilisation de surnageants lyophilisés et concentrés Dans les expériences précédentes en microcosmes avec les surnageants de culture de la souche NH50, nous avons utilisé des volumes de liquide relativement importants par rapport aux quantités de sol à traiter (2,5 g de sol dans 25 ml de milieu liquide soit 10 litres pour 1 kg de sol). Il nous est apparu intéressant de chercher à réduire ces volumes. Nous avons, pour cela, utilisé la technique de lyophilisation à 55 C sous une pression de 10-2 bars (voir page 144). Après lyophilisation, les surnageants ont été resuspendus dans 1/10 ème du volume initial pour concentrer les molécules actives. Nous avons d abord vérifié que ces surnageants lyophilisés étaient toujours capables de réduire le chrome (VI). Nous avons incubé les surnageants SCr concentrés 10 fois (SCr conc.) avec 1 ou 10 mm de chrome (VI) en présence de 0,5 mm cuivre et nous avons comparé ces résultats à ceux obtenus avec un surnageant SCr non concentré et ceux obtenus avec le milieu de culture M63Y concentré stérile afin de vérifier que le milieu de culture seul n est pas responsable de la réduction du chrome. Les résultats sont indiqués dans le Tableau XLIII. Tableau XLIII : Pourcentage de réduction du chrome (VI) en solution par SCr et SCr et M63 Y concentrés 10 fois en présence de cuivre Cu 2+ en 24 heures à 30 C. Concentration initiale en Cr(VI) SCr SCr SCr conc. SCr conc. M63Y conc. 1 mm 10 mm 1 mm 10 mm 10 mm % de réduction 100 % 0 % 100 % 100 % 0 % Le surnageant SCr qui était actif avant la lyophilisation, l est toujours après concentration. Le surnageant SCr concentré peut réduire 10 mm de Cr(VI). En concentrant le surnageant, on peut réduire des quantités de chrome plus importantes. Ceci est un résultat important car il est possible, par cette technique, de réduire des concentrations en chrome incompatibles avec un bon développement microbien. Nous avons aussi vérifié que dans les mêmes conditions le milieu de culture concentré ne permet pas la réduction du chrome. La réduction du chrome observée est bien le résultat de l action des molécules produites par la souche NH

193 RÉSULTATS ETUDE DE LA RÉDUCTION DU CR(VI) EN PRÉSENCE DE SOL POLLUÉ Nous avons donc testé la possibilité d utiliser ces surnageants lyophilisés pour immobiliser le chrome dans le sol (re-pollué à 1800 mg de Cr(VI) par kg de sol). Pour cela nous avons incubé 1 g de sol avec 0,4 ou 0,8 ml de surnageant (provenant de cultures de 10 jours en milieu M63Y avec et sans 1 mm de chrome à 30 C) concentrés 10 fois par lyophilisation. Cette série d expériences a été réalisée en eppendorfs. Les concentrations initiales (mesurées après 1 heure) dans le milieu liquide sont très importantes : de l ordre de 1000 mg de Cr(VI).L -1 lorsque l on ajoute 0,4 ml de milieu liquide et 500 mg.l -1 pour 0,8 ml de milieu liquide (voir Figure 36). Tout le chrome (VI) contenu dans le gramme de sol ne passe pas en solution compte tenu des faibles volumes de liquide considérés. Si tel était le cas, les concentrations initiales seraient 4 fois plus élevées. Nous pouvons observer sur la Figure 36 que l apport de surnageant S ou SCr concentré sur 1 g de sol permet de diminuer la concentration du chrome (VI) en solution, phénomène que nous n observons pas si nous ajoutons uniquement du milieu M63Y concentré. Nous remarquons une fois de plus que le surnageant SCr permet d obtenir un meilleur pourcentage de réduction du chrome que le surnageant S. mg de Cr(VI).L temps en jours 400 µl S conc. 800 µl S conc. 800 µl S conc. + 1 mm Cu µl SCr conc. 800 µl SCr 800 µl SCr conc. + 1 mm Cu µl M63Y conc. 800 µl M63Y conc. Figure 36 : Suivi de la concentration en Cr(VI) en solution en fonction du temps en microcosmes : 1 g de sol (apportant 1,8 mg de Cr(VI)) incubé à 30 C avec 400 ou 800 µl de surnageants S ou SCr concentrés 10 fois. En pointillé figurent les témoins réalisés avec 1 g de sol et le milieu de culture stérile concentré 10 fois. 182

194 RÉSULTATS ETUDE DE LA RÉDUCTION DU CR(VI) EN PRÉSENCE DE SOL POLLUÉ Effet du cuivre Nous avons testé l effet du cuivre (apporté sous forme de CuCl 2 à 1 mm) mais nous n avons pas pu observer une augmentation significative de la vitesse de réduction en présence de Cu 2+ (Figure 36) contrairement à ce que nous avions observé lorsque les chromates sont apportés en solution et non pas par du sol pollué (Figure 20 page 131). Nous avons donc dosé le cuivre Cu 2+ relargué en solution pour savoir si le sol contient déjà suffisamment de cuivre Cu 2+ pour que la réaction de réduction du chrome (VI) soit maximale. Nous avons pour cela incubé 5 g de sol avec 5 ou 15 ml (ratio L/S de 1/1 et 3/1 respectivement) de milieu liquide (M63Y ou eau déminéralisée stériles) mis en contact, sous agitation (120 rpm), pendant 30 minutes à 30 C. Cette expérience étant réalisée en une demi-journée, nous n avons pas utilisé de sol stérile. Sur un intervalle de temps si court, le phénomène de bio-réduction est négligeable. La phase liquide, récupérée par centrifugation, est renouvelée toutes les 30 minutes. Nous avons dosé, sur chaque essai, le cuivre Cu 2+ et le Cr(VI) relargué en solution par les 5 g de sol. Les résultats des désorptions sont présentés dans les deux figures suivantes. masse cumulée de Cu 2+ ( mg) 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0, temps de contact en minutes M63, L/S = 1/1 M63, L/S = 3/1 eau, L/S = 1/1 eau, L/S = 3/1 masse cumulée de Cr(VI) (mg) 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0, temps de contact en minutes M63, L/S = 1/1 M63, L/S = 3/1 eau, L/S = 1/1 eau, L/S = 3/1 Figure 37 : Désorption du Cu 2+ à 30 C contenu dans 5 g de sol en présence de milieu M63 ou d eau déminéralisée. Ratio L/S de 1/1 et de 3/1 avec renouvellement de la phase liquide toutes les 30 minutes. Figure 38 : Désorption du Cr(VI) à 30 C contenu dans 5 g de sol en présence de milieu M63 ou d eau déminéralisée. Ratio L/S de 1/1 et de 3/1 avec renouvellement de la phase liquide toutes les 30 minutes. 183

195 RÉSULTATS ETUDE DE LA RÉDUCTION DU CR(VI) EN PRÉSENCE DE SOL POLLUÉ Dans la Figure 37, on observe que le milieu dans lequel est incubé le sol influe sur le relargage du cuivre Cu 2+ en solution. L eau, avec un ratio L/S de 1/1, permet d extraire 0,03 mg de Cu 2+ (pour 5 g de sol) alors qu avec le même ratio L/S, le milieu M63 permet de récupérer dans les mêmes conditions 0,3 mg. Nous remarquons aussi que la quantité de liquide en contact avec le sol joue un rôle important. Plus le volume de la phase liquide est important, plus on retrouve de cuivre Cu 2+ en solution. Le phénomène est donc limité par la solubilité de l ion. Ainsi, avec le milieu M63, avec un ratio L/S de 3/1, on peut extraire jusqu à 0,55 mg de Cu 2+ (après 7 extractions). Ce résultat montre qu en incubant le sol avec des surnageants de culture, obtenus en milieu M63Y, nous sommes dans des conditions favorables pour avoir du cuivre Cu 2+ en solution qui peut donc interagir avec les molécules réductrices pour augmenter la vitesse de réduction du chrome. De plus, la totalité du cuivre Cu 2+ n est pas passé en solution après avoir renouvelé 7 fois la phase liquide. Le chrome, quant à lui, est suffisamment soluble pour être extrait très facilement. Les cinétiques de désorption avec de l eau ou du milieu M63, et ce quel que soit le ratio L/S, sont comparables (Figure 38). Après avoir renouvelé 7 fois la phase liquide, environ 3 mg de chrome (VI) ont été mis en solution dans les 4 conditions testées. Nous pouvons remarquer que ces 3 mg de Cr(VI) ne représentent qu un tiers du chrome (VI) présent dans les 5 g de sol (5 * 1,8 mg de Cr(VI) = 9 mg). Si l on incubait 1 g de sol pollué avec 1800 mg.kg -1 de Cr(VI) dans 1 ml de milieu M63 (conditions similaires à celles utilisés en microcosmes avec les surnageants de cultures concentrés, voir Figure 36), nous aurions une concentration maximale en Cr(VI) d environ 35 mm. Ce gramme de sol contient au minimum 0,11 mg de Cu 2+ soit une concentration minimale d environ 1,7 mm dans 1 ml de M63. Ces conditions (35 mm de Cr(VI) pour 1,7 mm de Cu 2+ soit 1 mm de Cr(VI) pour 0,5 mm de Cu 2+ ) sont très proches des conditions utilisées dans les expériences pour tester l effet du cuivre sur les surnageants de culture où l on ajustait généralement la concentration en Cr(VI) à 1 mm et où l on ajoutait 0,1 mm de Cu 2+. La présence de cuivre Cu 2+, dans les quantités rencontrées dans le sol utilisé pour les expérimentations avec les surnageants lyophilisés, peut expliquer que l addition de CuCl 2 ne permet pas d augmenter la vitesse de réaction de réduction du Cr(VI). Le cuivre Cu 2+ contenu dans le sol permet d accélérer déjà au maximum la vitesse de réaction. 184

196 RÉSULTATS ETUDE DE LA RÉDUCTION DU CR(VI) EN PRÉSENCE DE SOL POLLUÉ 3.4. Conclusions Nous remarquons à la Figure 36 qu il est possible de réduire tout le chrome (VI) présent dans les échantillons (1 g de sol contenant 1,8 mg de Cr(VI)) en 18 jours en utilisant 0,8 ml de surnageant SCr concentré 10 fois. Nous avons vérifié qu il s agissait de tout le chrome présent au début de l expérience et pas seulement du chrome qui était passé en solution. Les échantillons contenant du sol et du SCr conc. dans lesquels la réduction avait été totale ont été resuspendus dans des volumes d eau plus importants pour en désorber le maximum et doser le chrome (VI) qui n aurait pas été réduit. Ces expériences ont montré que, dans ces échantillons, il n y avait plus de chrome sous forme (VI). Cette expérience montre que l on peut envisager de réduire le chrome dans un sol et l immobiliser relativement rapidement en utilisant des surnageants provenant de culture de Streptomyces thermocarboxydus NH50 en présence de chrome. La présence, au préalable, du métal oxydé permet d obtenir des surnageants contenant plus de molécules réductrices et donc plus actifs. La lyophilisation permet de concentrer les surnageants afin de diminuer le volume de liquide apporté au sol pour le traitement. D après les résultats de cette dernière expérience, il serait possible de traiter 1 kg de sol fortement pollué (1800 mg de Cr(VI).kg -1 ) par moins d un litre de surnageant lyophilisé contre 10 L de surnageant non concentré (cf. page 181). D après ces résultats, la lyophilisation n entraînerait pas de perte de molécules réductrices puisqu en concentrant le surnageant 10 fois, on diminue par 10 le volume à appliquer sur le sol. La difficulté majeure est de disposer de surnageants de culture de Streptomyces thermocarboxydus NH50 en grande quantité qu il faudra lyophiliser pour pouvoir traiter un sol pollué. Les Streptomyces sont des bactéries largement utilisées dans le monde pharmaceutique car elles produisent une grande variété d antibiotiques. Ces bactéries ont fait l objet de très nombreuses études en recherche fondamentale mais aussi pour la mise au point des procédés de fabrication des antibiotiques. Les cultures à grande échelle sont donc parfaitement maîtrisées. On peut envisager d utiliser ces procédés pour produire des quantités importantes de culture. Nous avons déterminé durant cette étude les conditions de culture qui favorisaient la production de molécules actives, c est-à-dire : en présence de glycérol (à 3 g.l -1 ) et de 1 mm de Cr(VI). 185

197 RÉSULTATS ETUDE DE LA RÉDUCTION DU CR(VI) EN PRÉSENCE DE SOL POLLUÉ Les antibiotiques produits industriellement sont récupérés sous forme de poudre ce qui suggère que les procédés pour concentrer les molécules d intérêt existent. De plus, les antibiotiques obtenus représentent un faible pourcentage en masse des cultures de Streptomyces, ceci suggérant fortement la production durant le processus d élaboration, d une grande quantité de «déchets». Ces résidus de fabrication pourraient peut-être contenir des molécules ayant une activité chromate réductase. On peut donc imaginer plusieurs façons de produire les molécules responsables de la réduction du Cr(VI) : Utiliser le même type de procédés que ceux utilisés dans la fabrication d antibiotique pour obtenir des surnageants actifs de la souche NH50 puis ensuite les concentrer. Il n est d ailleurs pas utile dans un procédé de traitement de sol de séparer les cellules vivantes du surnageants avant concentration (par lyophilisation par exemple). Ajouter des cellules vivantes au sol, ne pose a priori pas de problèmes écologiques majeurs. En effet, les Streptomyces ont pour habitat naturel le sol et ne sont pas des bactéries pathogènes ni pour la flore ni pour la faune. De plus, les surnageants actifs sont produits par la souche NH50 non modifiée génétiquement. Cette souche ne possède pas de résistance qu elle ne possédait pas «naturellement» avant d être isolée au laboratoire. Il est possible que les cultures successives en laboratoire aient provoqué des mutations mais aucune de celles-ci n est le résultat d une introduction d ADN étranger dans son génome. On pourrait envisager de tester l activité chromate réductase des déchets générés par la fabrication des antibiotiques. En effet, comme nous l avons vu dans le chapitre II 2.3 (Tableau XXIII), d autres espèces de Streptomyces (lividans et cœlicolor) sont capables de réduire le Cr(VI) et très probablement par le même processus que S. thermocarboxydus NH50. D autres espèces que celles déjà citées, utilisées en industrie pharmaceutique, produisent peut-être le même type de molécules. Si tel était le cas, les résidus des procédés de préparation des antibiotiques ou autres molécules d intérêt médical, pourraient être appliqués sur un sol pollué au chrome (VI). Dans le cas de résidus provenant d autres espèces de Streptomyces, il faudrait s assurer que dans le sol à traiter, aucune cellule vivante ne soit introduite. En effet, les bactéries utilisées en industrie pharmaceutique, si elles ont été modifiées génétiquement afin de surproduire un antibiotique par exemple, ne doivent pas être réintroduites dans le milieu naturel. 186

198 RÉSULTATS ETUDE DE LA RÉDUCTION DU CR(VI) EN PRÉSENCE DE SOL POLLUÉ 4.Etudes en lysimètres et lit bactérien 4.1. Etude en lysimètres Les essais en lysimètres ont pour but de reproduire à l échelle du laboratoire le procédé de traitement en «biopile» d un sol pollué que l on pourrait éventuellement appliquer sur le site même. Nous avons travaillé avec des quantités de sol de l ordre du kg (soit environ 500 à 1000 fois plus que pour les expériences en microcosmes). Les lysimètres utilisés sont des casiers en PVC de 50 cm sur 30, dans lesquels nous avons placé 3 kg de sol à traiter, de manière à obtenir une couche d'environ 5 cm d épaisseur pour permettre l aération sans système d aération forcée. La couche de sol est déposée sur un géotextile, évitant ainsi l'entraînement de fines particules de terre qui pourraient boucher les conduits ainsi que les pompes. Le casier est recouvert d'un dôme en PVC au sommet duquel sont disposés trois asperseurs permettant l arrosage de la surface du sol et l aération de la solution. Une circulation de trois litres d'eau ou de milieu nutritif se fait en boucle fermée, aspergeant le sol pollué de façon homogène et par alternance, par l'intermédiaire d un réacteur qui collecte par gravité la solution (cf. Figure 39). Une agitation est maintenue dans les réacteurs pour aérer la solution. Cependant l agitation est suspendue lorsque la pompe de recirculation fonctionne de façon à ne pas réinjecter les dépôts de terre qui auraient pu passer le géotextile et qui pourraient endommager l'installation. Le débit des pompes est de 12 litres/heure. Les pompes fonctionnent ½ heure toutes les deux heures sauf la nuit et les fins de semaines pour des raisons de sécurité. Les lysimètres fonctionnent à température ambiante (environ 25 C). Nous avons réalisé les essais en lysimètres avec du sol pollué à différentes concentrations en Cr(VI) : les teneurs sont d environ 300, 1200 et 2300 mg de Cr(VI) par kg de sol dans les trois types d essais. Seuls les essais en lysimètres contenant du sol pollué avec environ 1200 mg.kg -1 a fait l objet d un bilan complet (bilan matière sur le chrome total et évaluation écotoxicologique). 187

199 RÉSULTATS ETUDE DE LA RÉDUCTION DU CR(VI) EN PRÉSENCE DE SOL POLLUÉ pompe Asperseur Sol pollué Géo-textile Grille Barreau magnétique Réacteur Agitateur magnétique Figure 39 : Schéma d un lysimètre avec circulation en boucle fermée Evaluation préliminaire de la bio-stimulation et de la bio-augmentation Le sol utilisé contient une quantité de chrome (VI) d environ 300 mg.kg -1. Six kilogrammes de ce sol ont été répartis dans deux lysimètres notés 1A et 1B. Dans le premier (1A), on ne fait circuler que de l eau permutée et dans le second (1B), après 3 jours de circulation d eau, la source de carbone (300 g de glucose) et les nutriments (28,2 g de (NH ) SO et 5,4 g de Na HPO ) sont apportés dans l eau contenue dans le réacteur ainsi qu un ensemencement constitué par 150 ml d une culture de Streptomyces thermocarboxydus NH50 de 2 jours en milieu LB directement sur le sol (afin d éviter que les mycéliums n obstruent les asperseurs). Le ratio C/N/P/Cr(VI) pour cette expérience est de 100/5/1/0,75. Le carbone est ici introduit en très large excès par rapport à la quantité de Cr(VI) présente dans le sol. En effet si l on se réfère à l équation suivante, le rapport massique C/Cr(VI) est de 100/600. C H O + 8 CrO H + 8 Cr HCO + 20 H O On combine donc dans cette première approche à la fois la bio-stimulation de la flore endogène par aération et apport de glucose et de nutriments et la bio-augmentation par apport de mycélium de NH

200 RÉSULTATS ETUDE DE LA RÉDUCTION DU CR(VI) EN PRÉSENCE DE SOL POLLUÉ a Aspect du sol dans chacun des lysimètres après 15 jours Après 15 jours de circulation du milieu liquide, l aspect du sol des lysimètres est différent. Dans le lysimètre 1B dans lequel ont été ajoutés la souche NH50 et le milieu nutritif, la terre s est couverte en surface d une pellicule blanchâtre qui est le résultat du développement des micro-organismes. Il s agit certainement d un développement de champignons filamenteux, de bactéries et de la souche de Streptomyces thermocarboxydus NH50 que l on a ajoutée sous forme de mycélium au bout de 3 jours. Les conditions expérimentales dans ce lysimètre sont favorables à la croissance microbienne : nutriments (ratio C/N/P de 100/5/1), une grande quantité de glucose (ratio C/Cr(VI) de 100/0,75) et une température ambiante entre 25 et 30 C (expériences réalisées en juin). Sur la terre du lysimètre 1A dans lequel n a circulé que de l eau permutée, la terre a gardé son aspect initial (Figure 40). Figure 40 : Aspect du sol : à gauche dans le lysimètre 1A (eau permutée), à droite dans le lysimètre 1B (ensemencé par NH50 et dopé en nutriments selon le ratio C/N/P/Cr(VI) de 100/5/1/0,75) 189

201 RÉSULTATS ETUDE DE LA RÉDUCTION DU CR(VI) EN PRÉSENCE DE SOL POLLUÉ b Suivi des concentrations en chrome (VI) en solution La concentration en chrome (VI) dans les deux réacteurs a été mesurée pendant deux semaines. Les résultats sont présentés dans la Figure 41. mg de Cr(VI).L -1 Ajout des nutriments et de NH50 dans le lysimètre 1B temps en jours Lysimètre 1A Lysimètre 1B Figure 41 : Évolution de la concentration en chrome (VI) en solution dans les réacteurs des lysimètres 1A (eau permutée) et 1B (ensemencé par NH50 et dopé en nutriments selon le ratio C/N/P/Cr(VI) de 100/5/1/0,75) On constate en premier lieu que, la concentration initiale en chrome en solution n est pas celle que nous attendions. En effet le sol contient 300 mg de Cr(VI).kg -1 et compte tenu du ratio L/S de 1, nous devrions obtenir des concentrations de l ordre de mg.l -1 alors que celles mesurées ne dépassent pas 65 mg.l -1. Tout le chrome hexavalent du sol, pourtant très soluble dans l eau, ne passe pas en solution. La percolation de la solution sans agitation du sol ne permet de mobiliser qu un quart du contenu total en chrome (VI). Il est possible que l adsorption des chromates réduise leur lixiviation, ou que l existence de chemins préférentiels à l écoulement limite l entraînement des chromates par la solution du fait de la formation de zones stagnantes. Compte tenu que ce phénomène est identique dans les deux lysimètres, le suivi des concentrations en chrome en solution dans les réacteurs permet cependant de comparer les deux conditions testées. Dans le réacteur 1B dopé en glucose et nutriments et ensemencé, la concentration en chrome (VI) diminue progressivement au cours du temps, assez lentement entre les jours 4 et 9 puis plus rapidement ensuite. La première phase de 5 jours correspond à la mise en place d une microflore endogène et exogène active. On peut supposer que le chrome qui est réduit (20 %) pendant cette phase, l est principalement par 190

202 RÉSULTATS ETUDE DE LA RÉDUCTION DU CR(VI) EN PRÉSENCE DE SOL POLLUÉ des phénomènes abiotiques (réduction par la matière organique du sol et par la grande quantité glucose). Puis durant les 6 derniers jours, tout le chrome (VI) en solution a disparu. La couleur verte du réacteur témoigne de la réduction du chrome (VI) (jaune) en chrome (III) (bleu-vert). Dans le réacteur 1A percolé uniquement avec de l eau, la concentration en chrome (VI) n évolue quasiment pas pendant les deux semaines de suivi. La couleur du milieu liquide du réacteur est jaune vif reflétant la présence des ions chromate. Le fait que la concentration en Cr(VI) n augmente pas en solution durant 15 jours alors que le contenu total du sol n est pas épuisé suggère que la limitation de l entraînement des chromates n est pas due à l existence de zones stagnantes mais plutôt à des phénomènes physico-chimiques (adsorption) ou à la réduction abiotique Comparaison des techniques de bio-stimulation et de bio-augmentation Dans les expériences précédentes en lysimètres, nous avons à la fois stimulé la flore endogène par un apport de carbone et de nutriments et augmenter la biomasse en apportant des mycéliums de la souche NH50. Dans ces nouvelles expériences, nous avons apporté du carbone et des nutriments dans les deux lysimètres et seul un des deux a été ensemencé avec NH50. Nous pourrons donc apprécier la participation de la flore endogène stimulée et de la souche endogène apportée dans les phénomènes de réduction du Cr(VI) dans le sol pollué. Nous avons aussi apporté une quantité de carbone moins importante que dans les essais en lysimètres précédents. En effet, lorsque les essais sont réalisés avec des quantités importantes de glucose, la réduction abiotique du Cr(VI) est le phénomène prépondérant (voir résultats des expériences en microcosmes III 3.1 et III 3.2 pages ) Le sol utilisé contient une pollution d environ 1000 mg de Cr(VI).kg kg de ce sol ont été placé dans chacun des lysimètres contenant 2 litres d eau permutée + nutriments. Le glucose est apporté à raison de 7,5 g.l -1 dans le lixiviat de chacun des deux lysimètres. Les sels minéraux sont apportés en respectant le rapport C/N/P du milieu M63 (ratio utilisé dans les expériences en microcosmes décrites III 3.2). Les expériences en microcosmes réalisées avec un rapport massique C/N/P de 100/14/103, n avait pas permis d observer de réduction du Cr(VI) significative avec du sol non stérile et un inoculum de NH50 sous forme de mycélium en 3 semaines. Etant donné que les expériences en lysimètres sont toutes conduites avec du sol non stérile, nous avons choisi de suivre la réduction sur une durée beaucoup plus longue (6 mois). Le rapport C/Cr(VI) est dans cette expérience de 100/25. Les phénomènes de réduction abiotique seront donc mineurs. 191

203 RÉSULTATS ETUDE DE LA RÉDUCTION DU CR(VI) EN PRÉSENCE DE SOL POLLUÉ La concentration en chrome dans le réacteur de chacun des deux lysimètres a été suivie en fonction du temps. Le lysimètre 2A constitue l essai «flore endogène + NH50» (bio-augmentation) et le lysimètre 2B, l essai «flore endogène» (bio-stimulation). Le suivi de la concentration en Cr(VI) dans chacun des réacteurs est présenté sur la Figure 42. mg de Cr(VI).L Ajout de glucose temps en jours lysimètre 2A lysimètre 2B Figure 42 : Suivi des concentrations en Cr(VI) dans la solution contenue dans les réacteurs des lysimètres 2A (flore endogène +NH50) et 2B (flore endogène) a Aspect du sol dans chacun des lysimètres Le sol contenu dans les deux lysimètres a gardé son aspect initial. Il n a pas présenté de développement intense de la microflore. En effet, la concentration en glucose en solution est d environ 100 g.l -1 dans la première expérience en lysimètres ( III 4.1.1) et de 7,5 g.l -1 dans le cas présent. La microflore se développe (apparition de «flocons» dans les réacteurs et dans les tuyaux) mais pas suffisamment pour voir apparaître une pellicule blanche à la surface du sol. 192

204 RÉSULTATS ETUDE DE LA RÉDUCTION DU CR(VI) EN PRÉSENCE DE SOL POLLUÉ b Suivi des concentrations en chrome (VI) en solution Les concentrations en Cr(VI) initiales sont moitié moindre par rapport à celles attendues si tout le chrome (VI) passait en solution. Ce phénomène avait déjà été observé dans la série d expériences en lysimètres précédente. Nous avons suivi la concentration en Cr(VI) pendant 6 mois sans observer de différences significatives entre les lysimètres 2A et 2B. Que l on ajoute ou non la souche NH50 dans le sol, la réduction du chrome n est pas plus rapide. Le seul paramètre qui semble permettre d obtenir une vitesse de réduction du chrome plus rapide est l apport de glucose. En effet, après l ajout de 20 g de glucose dans chacun des lysimètres, la réduction du chrome reprend. Ces résultats confirment que la présence de glucose en large excès est nécessaire pour obtenir des cinétiques plus rapides. Les résultats obtenus dans les deux premières expériences en lysimètres confirment les résultats obtenus en milieu dispersé et en microcosme. Nous avions constaté en milieu dispersé que plus la concentration en glucose était importante, plus la réduction du chrome (VI) était rapide que ce soit avec ou sans ajout de la souche NH50 dans les essais (Figure 32 et Figure 33). Cette observation avait aussi été faite avec les résultats obtenus en microcosmes présentés dans le Tableau XL page 176. Le glucose en excès (C/Cr(VI) de 100/1 environ) est indispensable pour obtenir des pourcentages de réduction importants. Il est peut être nécessaire d apporter plus de glucose en microcosmes et en lysimètres qu en milieu dispersé car celui-ci est certainement moins bio-disponible pour la flore endogène. Cependant dans ce contexte (teneur en glucose relativement élevée) le phénomène de réduction abiotique est probablement très important. Lorsque l on travaille à des concentrations plus faibles en glucose (10 g.l -1), la bio-stimulation de la flore endogène seule ou la bio-augmentation (par apport de la souche NH50 sous forme de mycélium) ne permettaient pas d avoir des pourcentages de réduction significativement différents. Ce type de résultats avait aussi été observé en microcosmes (Tableau XXXVIII page 173 ). Si l on envisage de traiter un sol pollué au Cr(VI) avec un apport «modéré» en glucose, la réaction sera lente et ajouter des mycéliums de la souche NH50 ne permettra pas d obtenir de meilleurs résultats. Lorsque l on travaille en microcosmes ou en lysimètres, la bio-augmentation par apport de mycéliums de NH50 ne permet pas d obtenir des pourcentages de réduction du Cr(VI) supérieurs à ceux obtenus par bio-stimulation. 193

205 RÉSULTATS ETUDE DE LA RÉDUCTION DU CR(VI) EN PRÉSENCE DE SOL POLLUÉ Evaluation globale du traitement par bilan matière et caractérisation écotoxicologiques Ces essais en lysimètres ont été réalisés dans les mêmes conditions que celles des premiers essais mais avec un sol beaucoup plus pollué en chrome (VI) (2300 mg de Cr(VI).kg -1). Le ratio C/Cr(VI) est d environ 100/5. Dans le premier lysimètre (3A), on ne fait circuler que de l eau permutée et dans les trois autres (3B,C et D en triplicat), après 3 jours de circulation d eau, la source de carbone (300 g de glucose) et les nutriments (28,2 g de (NH ) SO et 5,4 g de Na HPO ) sont apportés dans l eau contenue dans le réacteur ainsi qu un ensemencement constitué par 150 ml d une culture de Streptomyces thermocarboxydus NH50 de 2 jours en milieu LB. Le ratio C/N/P/Cr(VI) est de 100/5/1/5. a Aspect du sol dans chacun des lysimètres après 15 jours Tout comme nous l avons vu précédemment (Figure 40), le sol du lysimètre témoin 3A garde son aspect initial alors que les 3 autres lysimètres présentent une pellicule blanche à la surface du sol. b Suivi des concentrations en chrome (VI) en solution en début de traitement La concentration initiale en chrome dans les réacteurs n est pas celle que nous attendions. En effet, le sol contient 2000 mg de Cr(VI).kg -1 et compte tenu du ratio L/S de 1, nous devrions obtenir des concentrations de l ordre de mg.l -1 alors que celles mesurées ne dépassent pas 1000 mg.l -1. Nous avions déjà observé ce phénomène dans les expériences précédentes. c Aspect de la solution contenue dans les réacteurs Après 1 mois d incubation, on observe la formation d une biomasse microbienne à l intérieur des réacteurs 3B, 3C et 3D contenant le milieu de culture destiné à être recirculé dans le sol. Le développement microbien sous la forme d une «mère» localisé à la surface du milieu liquide nous a posé des difficultés dans l automatisation de la recirculation du milieu nutritif suite au colmatage à répétition des buses d aspersion. Dans la solution du réacteur du lysimètre 3A (eau permutée), aucun développement microbien n a pu être observé. d Devenir du chrome après 3 mois de traitement et bilan matière L ensemble des résultats des analyses effectuées sur les solutions et le sol après 3 mois de traitement est rassemblé dans le Tableau XLV. Signalons que dans cette série d essais, la recirculation des lixiviats a été suspendue pour des raisons de sécurité durant la fermeture estivale (1 mois). 194

206 RÉSULTATS ETUDE DE LA RÉDUCTION DU CR(VI) EN PRÉSENCE DE SOL POLLUÉ Tableau XLV : Bilan des essais en lysimètre 3A, 3B, 3C et 3D après 3 mois de traitement. 3 kg de sol ([Cr total] = 4900 mg.kg -1 et [Cr(VI)] = 2300 mg.kg -1 de sol sec), 3 litres de milieu nutritif ini ini recirculé en boucle fermée à température ambiante. [Cr total] ini dans le sol (mg.kg-1) Lysimètre 3A témoin (eau) Lysimètre 3B Lysimètre 3C Lysimètre 3D Moyenne (3B+3C+3D) [Cr(VI)] ini dans le sol (mg.kg ) [Cr(VI)] ini en solution après 3 jours (mg.l ) % de Cr(VI) en solution après 3 jours 47,3 % 42,6 % 37,8 % [Cr(VI) ] en solution après 3 mois (mg.l ) [Cr total] en solution après 3 mois (mg.l ) [Cr total] dans le sol après * 3 mois (mg.kg ) [Cr(VI)] dans le sol après * 3 mois (mg.kg ) % d immobilisation après 3 mois 33 % 5,6 % 97,9 %* * Le sol des lysimètres 3B, 3C et 3D a été rassemblé et homogénéisé après traitement et avant analyse. La concentration en Cr total a été analysée par POLDEN On constate une bonne efficacité du traitement en trois mois d incubation. La quasi totalité du Cr(VI) présent a été réduit dans les essais où du milieu nutritif a circulé (glucose, azote et phosphore + mycélium NH50). Le chrome (III) présent en solution est probablement sous forme de complexes avec la matière organique et/ou les autres ions présents dans la solution. Une très faible fraction du chrome est présente sous forme hexavalente dans le sol des lysimètres B, C et D. Si nous considérons le lysimètre 3A (eau permutée), nous constatons qu environ la moitié du Cr(VI) présent initialement a été extrait par lixiviation. Si l on fait le bilan matière après 3 mois on retrouve dans l eau et dans le sol ( = 4743 mg.kg -1) la quasi totalité du chrome présent initialement (4900 mg.kg -1). La différence de 3 % entre ces deux valeurs peut être attribuée aux incertitudes de mesure. Si l on réalise le bilan matière avec les moyennes obtenues avec les 3 lysimètres où un milieu nutritif a circulé, nous constatons que la concentration en Cr total après traitement ( = 3075 mg.kg -1) est bien inférieure à celle initialement présente (4900 mg.kg -1). L explication la plus plausible serait une fixation du chrome (34 % du chrome total) sur la biomasse microbienne qui s est développée dans les 195

207 RÉSULTATS ETUDE DE LA RÉDUCTION DU CR(VI) EN PRÉSENCE DE SOL POLLUÉ réacteurs. Compte tenu de la couleur bleu-vert de cette biomasse, le chrome immobilisé sur celle-ci est vraisemblablement sous forme trivalente. Dans les lysimètres où du milieu nutritif à circuler et dans lesquels ont été apportés des mycéliums de la souche NH50, le chrome (VI) a été extrait du sol par lixiviation et réduit en grande partie en chrome (III). Une fraction importante du chrome trivalent a été immobilisé dans le sol et dans la biomasse et l autre fraction est en solution (336 mg.l -1). Compte tenu qu il reste en solution et dans le sol beaucoup moins de Cr(VI) après 3 mois de traitement, le potentiel toxique de ce sol est donc a priori beaucoup moins important qu avant traitement. Afin d évaluer cette écotoxicité, on réalise des tests écotoxicologiques sur le sol et son percolat. e Evaluation de l écotoxicité du sol et de son percolat avant et après traitement (étude réalisée par POLDEN) Le sol Les essais ont été réalisés sur des semences d'orge (Hordeum vulgare) et de cresson (Lepidium sativum). La germination des graines d orge et de cresson est mesurée après 7 jours et la croissance après 14 jours. Les graines sont placées dans du sol contenant une fraction de sol pollué avant ou après traitement mélangé à du sol de référence. Les résultats sont comparés à un essai ne contenant que le sol de référence (0 % de sol pollué) et sont présentés dans le Tableau XLVI. Nous remarquons qu avant traitement, un mélange de sol pollué/sol référence de 29 % environ permet de faire germer toutes les graines (No Observable Effect Concentration). En revanche, pour ne pas observer d effet sur la croissance de l orge et du cresson, il faut travailler avec un mélange sol pollué/sol référence de 11 et 7 % respectivement. Après traitement, on constate que pour permettre la germination de toutes les graines de cresson, la fraction de sol pollué peut être plus importante (46 % contre 29 % avec le sol pollué avant traitement). L écotoxicité du sol traité est inférieure après traitement (dans le cas du test avec le cresson). Cependant, pour les graines d orge, on observe une inhibition de la germination à partir de 18 % de sol pollué (contre 29 % précédement). Dans le cas de l orge, le sol traité a un potentiel toxique supérieur à celui présenté avant traitement. Lors du traitement du sol pollué, notre objectif était d immobiliser le chrome. La circulation du milieu liquide nutritif et l activité microbienne a peut-être mobilisé et rendu plus biodisponibles d autres métaux, et l orge et le cresson ont probablement des sensiblités différentes. 196

208 RÉSULTATS ETUDE DE LA RÉDUCTION DU CR(VI) EN PRÉSENCE DE SOL POLLUÉ Tableau XLVI : Ecotoxicité du sol pollué avant et après traitement sur les semences d orge (Hordeum vulgare) et de cresson (Lepidium sativum) - Méthode ISO Paramètre Valeur avant traitement Valeur après traitement Inhibition de germination orge (NOEC) 28,75 % 18 % Inhibition de germination cresson (NOEC) 28,75 % 46 % Inhibition de croissance orge (NOEC) 11 % ND Inhibition de croissance orge (LOEC) 18 % ND Inhibition de croissance cresson (NOEC) 7 % ND Inhibition de croissance cresson (LOEC) 11 % ND NOEC : No Observable Effect Concentration et LOEC : Lower Observable Effect Concentration Le percolat L écotoxicité de la solution obtenue à l issue de la percolation correspondant à un rapport liquide/solide cumulé de 2,0 a été caractérisée par quatre types d essais présentés dans le Tableau XLVII ci-dessous : Tableau XLVII : Ecotoxicité du percolat du sol pollué avant et après traitement (obtenu par percolation d eau permutée sur une colonne de sol avec un ratio L/S cumulé de 2,0) Paramètre Écotoxicité aiguë Méthode Résultat avant traitement Résultat après traitement Essai Microtox CE50 15 min 3,4 % 5,93 % NF EN ISO Essai Microtox CE50 30 min 0,87 % 4,09 % Écotoxicité aiguë Essai daphnies CE50 24 h NF EN ISO ,05 % 0,22 % Écotoxicité chronique Essai algues CE50 72 h NF T ,04 % 2,6 % Génotoxicité Sans activation Suspicion d effet Présence d effet Mutatox Avec activation Présence d effet Présence d effet 197

209 RÉSULTATS ETUDE DE LA RÉDUCTION DU CR(VI) EN PRÉSENCE DE SOL POLLUÉ L écotoxicité du percolat résultant de l essai de percolation en colonne du sol pollué est particulièrement importante puisque des effets toxiques aigus et chroniques sont observés en présence de concentrations très faibles en percolat. Le percolat résultant de la percolation en colonne du sol traité en lysimètre présente encore des effets toxiques importants, bien que diminués, vis-à-vis de la luminescence de Vibrio fischeri, de la mobilité de Daphnia magna, de la croissance de l algue Pseudokirchneriella subcapitata et sa génotoxicité est clairement établie dans une gamme de concentrations inférieures aux concentrations toxiques pour la souche d essai Conclusions Les essais en lysimètres par biostimulation de la flore endogène et bioaugmentation (apport de NH50) ont confirmé les résultats obtenus en microcosmes : L apport de la souche de Streptomyces thermocarboxydus NH50 sur les échantillons de sol ne permet pas d obtenir une réduction du chrome significativement plus importante qu en présence exclusive de la microflore endogène. Pour obtenir une réduction importante de chrome par la flore endogène, il faut ajouter des quantités de glucose considérables Traitement des lixiviats en lit bactérien Le traitement du sol pollué en lysimètre génère un lixiviat chargé en Cr(VI). On peut envisager de traiter ces lixiviats en utilisant la souche de Streptomyces thermocarboxydus NH50 qui réduit le chrome (VI) en Cr(III) en milieu liquide (voir chapitre II des Résultats page 123). Les Streptomyces peuvent se développer en se fixant sur différente surface en formant un biofilm. Nous avons utilisé cette propriété pour utiliser la souche NH50 que nous avons isolée au laboratoire pour réduire le Cr(VI) contenu dans un milieu liquide. Nous avons préparé 4 colonnes de 0,8 L, la première contient du bidim (bandes de 5x15 cm superposées jusqu à atteindre une épaisseur de 4 cm), les deux suivantes contiennent 23 colliers de 20 perles de céramique (anneaux de Raschig) chacun soit 460 perles et la quatrième contient 460 perles en vrac (Figure 43). Les matériaux utilisés présentent une très grande surface disponible pour la fixation des bactéries. Les quatre colonnes ont été remplies avec 0,55 L de milieu M63Y (3 g.l -1) et ensemencées par la souche NH

210 RÉSULTATS ETUDE DE LA RÉDUCTION DU CR(VI) EN PRÉSENCE DE SOL POLLUÉ coton cardé pompe tuyau Niveau maximal de liquide bulles d air garnissage anneaux de Raschig plaque en inox percée robinet Figure 43 : Schéma d une colonne contenant des anneaux de Raschig en vrac L extrémité du tuyau arrivant en haut de colonne ne plonge pas dans le liquide. Nous avons branché la pompe de manière à faire «buller» de l air dans les colonnes deux heures par jour, Streptomyces étant un genre bactérien strictement aérobie. La pompe fonctionne en sens inverse pour réaliser les prélèvements. Après 21 jours de croissance bactérienne, le chrome (VI) a été ajouté jusqu à obtenir une concentration de 0,3 mm. Nous avons choisi de travailler à des concentrations faibles en chrome au début de l expérience pour ne pas trop perturber le métabolisme de synthèse des bactéries. Le ph dans les 4 colonnes est resté quasiment stable pendant toute la durée de l expérience soit 67 jours (ph de 7,2 à 6,7 en fin d expérience). Le suivi de la concentration en chrome (VI) montre que les 4 colonnes réduisent le chrome de la même manière. La totalité de celui-ci a disparu en 10 jours. A cette date, nous avons de nouveau ajouté du chrome (VI) dans les 4 colonnes et doublé la concentration initiale. Après réduction du chrome (VI) en 8 jours, nous avons porté la concentration en Cr(VI) à 3,5 mm environ dans les 4 colonnes et ajouté 0,1 mm de Cu 2+ dans la colonne 3. Nous remarquons que la vitesse de réduction dans les quatre colonnes est toujours similaire (environ 73 % de réduction en 13 jours) comme l indique la Figure

211 RÉSULTATS ETUDE DE LA RÉDUCTION DU CR(VI) EN PRÉSENCE DE SOL POLLUÉ abs 540 nm 160 ajout Cr(VI) + ajout Cu 2+ (0,1 mm) dans la colonne 3 mm de chrome (VI) ,5 colonne ,5 colonne ajout Cr(VI) 2 1,5 colonne 3 colonne , jours 0 Figure 44 : Evolution de la concentration en Cr(VI) dans les 4 colonnes. (colonne 1 : bidim, colonnes 2 et 3 : colliers d anneaux de Raschig et colonne 4 : anneaux de Raschig en vrac) Nous avons ajouté du cuivre dans la colonne 3 et nous avons comparé la vitesse de réduction par rapport à la colonne 2 (même garnissage). Si l on observe la Figure 44, on remarque qu il n y a pas de différence significative entre la colonne 2 et 3. On peut cependant noter que le chrome (VI) a été réduit totalement dans la colonne 3 en 39 jours contre 46 jours dans la colonne 2. Chacune des 4 colonnes a permis de réduire environ 35 mg de chrome au total en 46 jours au maximum (39 jours pour la meilleure efficacité colonne 3). Les trois types de garnissage testés permettent un bon développement bactérien et une adhésion des cellules. Après l expérience, les anneaux de Raschig et le bidim ont une coloration vert-bleu qui correspond au chrome (III) qui a précipité à la surface des bactéries fixées sur les supports (Figure 45). Nous avions observé, lors de l étude en culture pure, qu après réduction du Cr(VI) les culots cellulaires de NH50 avait une coloration bleu-vert ceci suggérant fortement que le Cr(III) puisse précipité à la surface des cellules. Ces essais en colonnes permettent d envisager un traitement d effluent liquide contaminé avec du chrome (VI), cet effluent pouvant être le lixiviat d un sol pollué. Le chrome réduit précipite sur les parois cellulaires et après immobilisation, il peut être récupéré en retirant le garnissage de la colonne. Il convient de faire croître au préalable les cellules dans un environnement non pollué afin d obtenir une quantité de cellules vivantes importante. Il faut, avant d utiliser de fortes concentrations en chrome, adapter les cellules à la présence de chrome (VI) afin qu elles commencent à synthétiser les molécules actives, puis enfin, appliquer des concentrations plus conséquentes en Cr(VI). L ajout du cuivre peut être envisagé mais à la concentration utilisée il peut être 200

212 RÉSULTATS ETUDE DE LA RÉDUCTION DU CR(VI) EN PRÉSENCE DE SOL POLLUÉ déjà toxique. En effet, lors de l étude en culture pure, l ajout de cuivre à la concentration de 0,1 mm dès le début de la culture empêchait le développement des mycéliums ( II 2.3 page 127). Les molécules actives ne pourront pas être renouvelées par la souche bactérienne si celle-ci meurt. Néanmoins il faudrait tester la capacité de ces cellules à synthétiser les molécules actives en présence de différentes concentrations en cuivre. Il est possible que dans les conditions présentes dans les colonnes (cellules qui ont adhéré sur un support solide), le niveau de toxicité du cuivre soit plus faible. Figure 45 : Aspect des anneaux de Raschig : à gauche avant utilisation et à droite, après 46 jours en présence de Streptomyces thermocarboxydus NH50 et de Cr(VI) réduit en Cr(III) dans la colonne

213 CONCLUSION ET PERSPECTIVES CONCLUSION ET PERSPECTIVES Le sol étudié dans ce travail, pollué essentiellement avec des ions chromate a été l objet d une étude pour évaluer la faisabilité d un traitement biologique pour réduire le chrome (VI) et l immobiliser. L isolement de la souche responsable de la réduction du Cr(VI) a permis de mieux comprendre les mécanismes de réduction propre à cette souche bactérienne. La souche réductrice est un Streptomyces thermocarboxydus, genre bactérien vivant généralement dans les sols. Dans un premier temps, l étude de la résistance au chrome a montré que la souche Streptomyces thermocarboxydus NH50 présentait un degré de résistance au chrome (VI) plus élevé que celui d autres souches du même genre bactérien. Nous avons tout d abord vérifié que le phénotype résistant au Cr(VI) n était pas dû à la mutation du système de transport du sulfate. La présence d un plasmide (appelé pln01) d environ kb dans la souche NH50, absent chez les autres souches de Streptomyces étudiées, permet d envisager que le gène (ou les gènes) responsable(s) du phénotype Chr R (résistant au chrome) soi(en)t localisé(s) sur l ADN extra-chromosomique. Les expériences réalisées pour vérifier cette hypothèse ne nous ont pas permis de conclure quant à la participation ou non du plasmide pln01. Le phénotype Chr (sensible au Cr(VI)) de clones obtenus par mutagenèse par insertion d un transposon est associé à une concatémérisation du plasmide pln01. Nous ne connaissons pas la relation existant entre ces deux phénomènes. Il est donc possible d envisager que des séquences présentes sur le plasmide participent au phénotype de résistance au Cr(VI). S L étude en culture pure de la réduction du Cr(VI) par la souche bactérienne a montré que la souche NH50 réduit plus rapidement (2 fois plus vite) le chrome contenu en solution en présence de glycérol (3 g.l -1 soit 83 mm de carbone) qu en présence de glucose (10 g.l -1 soit 333 mm de carbone). Des analyses par rayons X (EXAFS et XANES) ont aussi permis de vérifier, en travaillant sur des culots bactériens de la souche de Streptomyces thermocarboxydus, que la disparition du chrome (VI) dans les milieux était bien liée à la réduction de la forme hexavalente en forme trivalente (Desjardin et al., 2002). 202

214 CONCLUSION ET PERSPECTIVES Si l on sépare les cellules du surnageant de culture après une quinzaine de jours de culture, les surnageants permettent de réduire le chrome (VI) (présent 1 mm) en 48 h maximum alors qu un délai d une semaine est nécessaire lorsque l on incube les cellules entières récupérées dans un milieu contenant du chrome pour voir apparaître de nouveau le phénomène de réduction. Les cellules produisent et sécrètent une ou des molécules capables de réduire le chrome. La synthèse de ces molécules est augmentée lorsque les cellules sont incubées en présence de chrome. Et la vitesse de réduction du chrome est accélérée lorsque l on ajoute du cuivre cuivrique. Le cuivre agit directement au niveau de la réaction de réduction du chrome (VI) et non pas au niveau de la synthèse des molécules actives. En effet, si l on ajoute le cuivre (0,1 mm) au début de l incubation de la souche de Streptomyces thermocarboxydus, aucune cellule ne se développe. Le cuivre est toxique à cette concentration. En revanche, une fois les molécules réductrices de chrome produites, excrétées, et récupérées dans le surnageant, le cuivre Cu 2+ permet de réduire le chrome (1 mm) en 24 heures à 30 C alors que sans Cu 2+ ajouté, 2 à 3 jours sont nécessaires. Une fois sous forme trivalente, le chrome peut vraisemblablement s adsorber sur les membranes cellulaires (couleur bleu-vert des mycéliums) et précipiter dans le milieu. Toutes les bactéries non sulfatoréductrices décrites dans la littérature ayant une activité chromate réductase réduisent le Cr(VI) grâce à des enzymes. Seules les bactéries sulfato-réductrices sont connues pour réduire le chrome (VI) de façon indirecte. Streptomyces thermocarboxydus NH50, qui a été isolé d un sol pollué au chrome, réduit le Cr(VI), non pas grâce à des enzymes, mais à une ou plusieurs molécules de faibles poids moléculaires contenant deux groupements carboxyliques et plusieurs groupements alcools. Il existe chez les eucaryotes et chez certains procaryotes, des molécules réductrices de faible poids moléculaire qui pourraient être le donneur d électrons permettant la réduction du chrome (VI) en chrome (III). Une des molécules les plus connues est le gluthation (γ-l-glutamyl-l-cysteinyl-glycine) qui possède un groupement SH très réactif. Ce groupement SH possède une affinité particulière pour le cuivre Cu 2+ qui le rend encore plus réactif. Il est donc possible que la molécule produite par la souche NH50 possède un groupement thiol, ce qui expliquerait l augmentation de la vitesse de réduction du chrome lorsque l on incube les surnageants de culture en présence de CuCl ou de CuSO. Chez les Actinomycètes, l ordre bactérien auquel appartient les 2 4 Streptomyces, il existe une molécule appelée mycothiol [2-(N-acétylcystéinyl)amido-2-deoxy-α-Dglucopyranosyl-(1 1)-myo-inositol] (Newton et al,. 1996) qui jouerait un rôle similaire au glutathion. Cette molécule contient un groupement thiol et plusieurs fonctions OH portées par des dérivés des oses. Elle a été extraite la première fois de la souche Streptomyces sp. AJ9463 sous forme de disulfure. Cette molécule est récupérée après lyse cellulaire ce qui suggère qu elle ne soit pas exportée en grande quantité dans le milieu de culture. Compte tenu du fait que la molécule réduisant le Cr(VI) produite par la souche Streptomyces thermocarboxydus NH50 est localisée dans le surnageant de culture, il est possible que la molécule présente des similarités structurelles mais soit différente. Par exemple les groupements carboxyliques eux aussi très réactifs vis-à-vis du cuivre, détectés au nombre de deux d après les spectres RMN du carbone, sont 203

215 CONCLUSION ET PERSPECTIVES absents de la molécule de mycothiol. Les surnageants actifs peuvent être lyophilisés à froid (-55 C) à 10-2 bars. Cette lyophilisation permet de les concentrer en les solubilisant dans un volume 10 fois plus petit. La lyophilisation et la concentration des surnageants permettent de conserver les propriétés du surnageant et présentent l avantage de permettre la réduction du chrome à des concentrations initiales en chromates (10 mm) plus importantes que celles imposées en cultures pures (1 mm). Le cuivre a toujours le même effet positif sur la réduction du Cr(VI). Le fractionnement des molécules présentes dans les surnageants a permis d exclure l hypothèse d une réduction enzymatique. En effet, les molécules responsables de la réduction du chrome ont une masse moléculaire inférieure à 1000 Daltons. L analyse du spectre RMN du carbone 13 de cette fraction a montré l existence de petites molécules présentant des caractéristiques semblables aux acides aminés (liaison C-N, groupements COOH, liaison alcane) et aux sucres. Nous avions remarqué que le NADH avec du cuivre Cu 2+ pouvait aussi réduire le Cr(VI) en solution. L analyse par RMN du carbone des fractions de surnageants, présentant une activité chromate réductase, a montré que les résonances présentes ne correspondaient pas aux résonances du noyau adénosine présent dans le NADH. Les premières expériences en milieu dispersé (suspension de sol en batch) ont montré que la flore endogène contenue dans le sol réduisait davantage le chrome (VI) en conditions aérobies qu en absence d oxygène. L activité réductrice de chrome de la ou des espèce(s) microbienne(s) contenue(s) dans le sol est exprimée en présence d oxygène. Cette observation a permis d exclure l intervention de bactéries sulfato-réductrices dans ce phénomène dans les conditions testées. Les expériences de réduction du chrome (VI) contenu dans le sol en batch ont montré qu il est possible de stimuler la réduction du chrome par la flore endogène en présence d oxygène à condition d apporter des nutriments et du carbone sous forme de glucose. L ajout d un inoculum enrichi de Streptomyces thermocarboxydus NH50 à du sol en milieu dispersé agité ou en microcosmes (statique) permet d augmenter très légèrement la vitesse de réduction (à condition que ce soit sous forme de mycélium et non pas de spores). Cependant, travailler avec du matériel biologique vivant présente quelques désavantages. La présence de sol pollué impose des conditions qui peuvent être défavorables au développement et au métabolisme de la souche apportée. En fonction du degré de pollution en chrome, mais aussi en fonction d autres substances qui peuvent être toxiques elles aussi, la réduction du chrome peut être beaucoup moins efficace. De bons rendements de réduction du chrome ont pu être obtenus en microcosmes et en lysimètres mais en ajoutant une quantité de glucose considérable. La part de la réduction abiotique est alors relativement grande et l intérêt économique assez faible. On pourrait envisager d apporter une source de carbone moins onéreuse telle que la mélasse. 204

216 CONCLUSION ET PERSPECTIVES L utilisation de surnageants de cultures présente l avantage de ne pas faire appel à des microorganismes vivants, ce qui permet de s affranchir du problème de toxicité du chrome et des autres substances pouvant perturber le développement cellulaire voire le rendre impossible. Le deuxième avantage des surnageants est que sous forme lyophilisée et concentrée, il est possible de réduire des quantités plus importantes de chrome tout en travaillant avec des ratios liquide/solide de l ordre de 1/1. Ces surnageants peuvent être obtenus en optimisant les conditions de cultures plus facilement maîtrisables en cultures pures qu en présence de sol. Nous avons d ailleurs montré que la présence de glycérol et de Cr(VI) permettait d obtenir un surnageant de culture actif. L avantage de travailler avec du glycérol (3 g.l soit 83 mm de carbone) est d apporter beaucoup moins de carbone organique que lorsque l on ajoute du glucose (10 g.l -1 soit 333 mm de carbone). Ceci contribue à ne pas avoir une concentration en COT trop importante. -1 La teneur du sol en cuivre Cu 2+ peut aussi être un paramètre important à considérer. En effet, si le sol en contient suffisamment et qu on lui applique un surnageant lyophilisé, la réduction sera maximale. Il faudrait en revanche envisager d ajouter du cuivre cuivrique dans certains sols pollués qui en seraient dépouvus pour augmenter la vitesse de réduction. Si l on envisage de récupérer le chrome (VI) contenu dans un sol par lavage, on peut utiliser la propriété des cultures de Streptomyces thermocarboxydus pour le réduire. Si les concentrations ne sont pas trop importantes (< à 1 mm de Cr(VI) puisque au-delà de cette concentration, les mycéliums de NH50 ont des difficultés à se développer en culture pure), on pourrait apporter la souche bactérienne sous forme de mycélium et lui laisser produire les molécules actives en apportant une source de carbone. Si par contre les concentrations sont trop importantes, il serait possible d ajouter à la solution de lavage du sol du surnageant lyophilisé et éventuellement du cuivre Cu 2+. L étude de la souche de Streptomyces thermocarboxydus NH50 permet d envisager d utiliser de préférence les surnageants de culture de celle-ci, concentrés afin de réduire le chrome (VI) présent dans un sol. Ces surnageants permettent de réduire le chrome dans des conditions qui seraient incompatibles avec une activité microbienne optimale et avec des volumes de liquide raisonnables. Ces surnageants pourraient aussi être utilisés pour réduire le chrome (VI) en solution. Il serait intéressant de produire ces surnageants en quantités importantes. L avantage du genre Streptomyces est que cette bactérie est déjà largement utilisée pour la production industrielle d antibiotiques. Il est possible qu une fraction des déchets produits pendant le procédé de fabrication des antibiotiques soit utilisable pour réduire le chrome (VI) et donc valorisée. Les expériences réalisées en colonnes contenant un garnissage permettant la fixation des bactéries permet d envisager l utilisation de la souche NH50 pour traiter des lixiviats d un sol pollué (ou d autres effluents) contenant du Cr(VI). Chirwa et Wang (1997) avaient réalisé le même type d expériences avec Pseudomonas fluorescens LB300 qui développe aussi un biofilm sur un support solide. Le chrome réduit était, d après les auteurs, essentiellement retrouvé dans la phase liquide. Les Streptomyces et les Pseudomonas 205

217 CONCLUSION ET PERSPECTIVES appartiennent à deux groupes de bactéries bien différents : les bactéries à Gram positif et à Gram négatif respectivement. Il est possible que la souche de Streptomyces thermocarboxydus NH50, compte tenu de la présence de peptidoglycannes sur sa paroi cellulaire présente une capacité à fixer le Cr(III) supérieure à celle de Pseudomonas fluorescens LB300. Des expériences complémentaires devront être réalisées afin de déterminer la capacité maximale de fixation du chrome réduit sur les membranes de la souche NH50. Ce paramètre serait intéressant à évaluer pour envisager un procédé d immobilisation sur la biomasse d une partie du chrome (III) contenu dans une solution après traitement par réduction du chrome (VI). A partir des résultats obtenus au cours de cette étude sur la bio-réduction du Cr(VI), nous pouvons proposer 2 approches pour traiter un sol pollué par des ions chromate. Avant de détailler les différentes approches, il convient de rappeler qu une pollution au Cr(VI) est une pollution très «mobile». En effet, les chromates sont très solubles dans l eau. Si le traitement du sol pollué au Cr(VI) n est pas envisageable «immédiatement», il faut protéger le sol des intempéries pour éviter que les chromates ne soient entraînés par l eau de ruissellement ou d infiltration. De plus, les 3 approches que nous allons développer ci-après impliquent l utilisation d une phase liquide aqueuse. Par conséquent, avant de traiter un sol, il faut «l isoler» physiquement de l écosystème environnant (par excavation par exemple). Le traitement du sol peut être réalisé sur site, ce qui est économiquement intéressant puisqu il n est pas nécessaire de déplacer le sol vers le site de traitement. Les différentes approches que nous proposons sont les suivantes : On peut envisager de réaliser des cultures de la souche NH50 en présence de glycérol et avec de faibles concentrations en Cr(VI) (issu du sol lui-même) pour être dans les conditions optimales d obtention des molécules réductrices d intérêt. Ces cultures pourraient être appliquées sur le sol pollué confiné (biopile type «compostage»). Il ne nous apparaît pas nécessaire de séparer le surnageant des cellules puisque la souche ne présente pas de caractère pathogène et qu elle n a pas été modifiée génétiquement. S il est possible de disposer de cultures lyophilisées, la quantité de phase liquide apportée sur le sol sera moindre ce qui peut présenter l avantage de réduire la taille de la zone où le procédé est mis en œuvre. Il faudra bien sûr comparer le coût de la lyophilisation à celui de la mise en place des structures de traitement. Dans ce procédé, le chrome serait immobilisé dans le sol. On peut aussi envisager d extraire le Cr(VI) contenu dans le sol en lavant celui-ci avec de l eau en utilisant des procédés similaires à celui des lysimètres. Une fois le lixiviat récupéré, on peut appliquer soit une culture de la souche NH50 contenant les molécules réductrices, soit faire circuler ce lixiviat dans des colonnes contenant un garnissage colonisé par la souche NH50. Si le lixiviat présente une toxicité trop importante (présence de fortes concentrations de chromates et autres polluants) pour permettre la 206

218 CONCLUSION ET PERSPECTIVES synthèse des molécules réductrices, la première proposition sera privilégiée. On peut éventuellement envisager d ajouter du cuivre Cu 2+ (si le sol pollué n en apporte pas suffisamment) pour permettre une réduction du Cr(VI) plus rapide. L avantage de ce procédé est que les cultures auront été réalisées avec du glycérol ce qui permet de ne pas trop augmenter la COT du lixiviat. Un autre paramètre intéressant est que le glycérol peut réduire photochimiquement le Cr(VI). En effet, les fonctions alcools du glycérol peuvent réduire, grâce à la lumière naturelle et les UVA ( nm), le Cr(VI) en Cr(III). Une récente étude (Yurkow et al., 2002) a montré que cette réduction pouvait avoir lieu à ph neutre mais surtout à ph acide. En réalisant la réduction du Cr(VI) en bio-réacteur placé à la lumière naturelle, on pourrait combiner réduction bactérienne et photo-réduction. Le chrome (III) formé par réduction se retrouvera soit en solution, soit adsorbé sur la biomasse. En fonction des objectifs de traitement, il faudra envisager de récupérer le Cr(III) en solution et fixé sur la biomasse. La précipitation du chrome (III) sur la biomasse ayant colonisé le garnissage d une colonne pose le problème de la gestion de ces garnissages après réduction. 207

219 ANNEXES ANNEXES 208

220 ANNEXES 1.Les Streptomyces Nous présenterons dans cette partie la bactérie du genre Streptomyces car la souche bactérienne isolée au laboratoire et responsable de la réduction du chrome (VI) appartient à ce genre très particulier Caractéristiques du genre Streptomyces Généralités Les Streptomyces ont pour niche écologique le sol où ils jouent un rôle important dans la décomposition de différents bio-polymères et dans la minéralisation de la matière organique. Ces bactéries saprophytes produisent diverses enzymes extracellulaires impliquées dans la dégradation de nombreuses macromolécules issues des plantes et des animaux (chitine, pectine, amidon, kératine, élastine, etc ). Ce sont des eubactéries de l ordre des Actinomycétales (Figure 46). Cette sous-division des bactéries à Gram positif est caractérisée notamment par leur haut pourcentage de bases guanine (G) et cytosine (C) dans leur génome. Généralement, le pourcentage G+C chez ces bactéries est de 72 % contre 50 % chez Escherichia coli. Les Streptomyces sont les Actinomycètes les mieux connus. Ils sont très étudiés pour leur propriété à synthétiser des antibiotiques (streptomycine, kanamycine, chloramphénicol...), des antifongiques (amphotéricine, candicine...), des antitumoraux (mitomycine, actinomycine...), des antiparasitaires (hygromycine, salinomycine...), des antiviraux (Ara-C, tunicamycine), des insecticides (avermectine, milbémycine) et des herbicides (bialphos, phosphinothricine). 209

221 ANNEXES ORDRE Actinomycétales Nocar diaceae Actinoplanaceae Actinobacteriaceae FAMILLE Thermomonosporaceae Str eptomycetaceae Str eptover ticullium Norcadioides Intrasporangium GENRE Spor ichthya Str eptomyces autres lividans coelicolor albus griseus ambofaciens ESPECE thermocarboxydus SOUCHE AT37 NH50 Figure 46 : Classification des Streptomyces Cycle de différentiation cellulaire Les Streptomyces se distinguent des autres bactéries par leur cycle de différentiation. Très souvent, on considère qu une colonie bactérienne est un ensemble de bactéries toutes identiques entre elles (puisque qu elles dérivent par scissiparité d un clone isolé). Dans le cas des Streptomyces, on observe des colonies formées de cellules qui n ont pas la même morphologie. Elles sont pourtant issues du même clone initial. Cette particularité est le résultat d une différenciation morphologique par étapes successives (Figure 47). La germination d une spore, sur milieu solide, donne d abord naissance à un mycélium basal. Celui-ci «s incruste» dans le milieu de croissance par action d enzymes hydrolytiques synthétisées par les cellules. Ensuite, selon les souches et les conditions environnementales, on observe le développement d un mycélium aérien. Les hyphes qui le composent peuvent être de forme variable selon les souches (droite, spiralée, branchée...). C est à ce stade que certaines colonies synthétisent les pigments dont la couleur et l intensité varient selon les souches et le milieu de culture solide. Les hyphes, contenant plusieurs copies de l ADN génomique, donnent naissance à une cinquantaine de spores haploïdes après septation régulière. Ce développement sous forme de mycélium ressemble beaucoup à celui de certains champignons d où le suffixe «-myces». 210

222 ANNEXES Mycélium basal Mycélium aérien Figure 47 : Cycle de différenciation des Streptomyces sur milieu solide. Source : Génétique des Streptomyces Le génome Le génome est très riche en bases guanine (G) et cytosine (C). Cette richesse en G et C aurait pu laisser présager un contenu protéique chez les Streptomyces différent qualitativement de celui des autres bactéries. En effet, pour la synthèse d une protéine, un gène est d abord transcrit en ARN (Acide RiboNucléique) messager (ARNm) par l ARN polymérase, puis cet ARNm est traduit au niveau des ribosomes, ensemble complexe de protéines et d ARN ribosomiaux. Ces ribosomes assurent la mise en place de l ARN de transfert (ARNt) qui porte un acide aminé. La reconnaissance entre l ARNm et l ARN de transfert se fait par un système de codon / anticodon. Les bases A (adénine), U (uracile), G et C, qui composent l ARNm peuvent s appareiller avec ces mêmes bases qui composent l ARNt : A toujours avec U et G toujours avec C. A un codon UUA, est associé un anticodon AAU sur l ARNt qui porte l acide aminé leucine. Si le génome est riche en G et C, on peut penser que les protéines seront composées différemment de celles d autres micro-organismes. Si l on reprend l exemple du codon UUA, il est rarement rencontré dans le génome de Streptomyces. Mais les protéines contiennent proportionnellement autant de leucine que les protéines d autres origines bactériennes. Ceci est dû à la dégénérescence du code génétique. Pour un acide aminé, plusieurs codons lui sont associés. Pour avoir un résidu leucyl dans une protéine, il faut rencontré sur l ARNm UUA ou UUG. La base située en troisième position des codons n est pas forcément déterminante pour définir un acide aminé et chez les Streptomyces, on rencontre d avantage UUG sur l ARNm pour coder une leucine que UUA. La composition en acides aminés des protéines n est donc pas affectée du fait de la dégénérescence du code génétique (Wright et Bibb, 1992). 211

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