Diagnostic Virologique du VIH

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1 Diagnostic Virologique du VIH Pr S. Fafi-Kremer Institut de Virologie, CHU de Strasbourg Séminaire de Formation Jeudi 14 Novembre

2 Objectifs Comprendre la cinétique des marqueurs de l infection par le VIH connaitre les principes généraux des tests de dépistage conventionnels et des TROD connaitre et comprendre les performances d un TROD et ses limites connaitre l algorithme de dépistage VIH à partir d un TROD 2

3 VIH: Structure virale Famille Retroviridae- genre lentivirus Virus ARN (2 copies), enveloppé Transcriptase inverse: ARN ADN Intégration génome cellule hote ADN proviral Enveloppe virale: RT (p55-p63) Intégrase (p32) Protéase (p11) gp120 gp41 Core: Nucleocapside (P7) Capside (p24) Matrice (p17) ARN viral 3

4 VIH: Diversité et origine Afrique de l Ouest A B C D F G H J K Sous-types 56 recombinants (CRF 01 à 56) CRF: Circulating Recombinant Form 4

5 Marqueurs virologiques de la primo-infection par le VIH en l'absence de traitement taux des marqueurs Phase d éclipse Risque majeur de transmission anti-gp 160 anti-gp 120 anti-gp 41 anti-p24 ARN viral seuil de détection des marqueurs Ag p24 Contage J Temps (jours) 5

6 Tests de diagnostic de l infection par le VIH Diagnostic sérologique: Mise en évidence des anticorps (Ac) anti-vih et/ou de l Ag P24 Tests de dépistage Méthode immuno-enzymatique type ELISA Tests mixtes: Detection Ac anti-vih1 et anti-vih2 Tests combinés (4 ème génération): détection Ac anti-vih et Ag P24 Tests de confirmation Western blot ou Immunoblot Diagnostic moléculaire: Mise en évidence de acides nucléaires Quantification de l ARN VIH Détection et/ou quantification de l ADN proviral 6

7 Tests de dépistage 7

8 Evolution des tests de dépistage ELISA Test ELISA 1 ère génération (1985) 2 ème génération 3 ème génération 4 ème génération (1990) cible Virus purifié Protéines d enveloppe purifiés Protéines recombinantes Peptides de synthèse Détection IgG anti-vih IgM + IgG anti-vih IgM + IgG anti-vih + Ag P24 8

9 Evolution des tests de dépistage ELISA Branson and Stekler JID 2012 Amélioration progressive des performances: + 20 jours entre 1 ère et 3 ème génération jours entre 3 ème et 4 ème génération 9

10 Marqueurs virologiques de la primo-infection par le VIH en l'absence de traitement taux des marqueurs Phase d éclipse 4 ème génération 2 ème génération 1 ère génération anti-gp 160 anti-gp 120 anti-gp 41 anti-p24 seuil de détection des marqueurs 3 ème génération Ag p24 Contage J Temps (jours) 10

11 Performance des tests Sensibilité : Spécificité : AMM: 100% (hors per-seroconversion) capacité à donner un résultat positif lorsque l infection est présente. Si sensibilité faible, risque important de faux négatif AMM: >99,5% capacité à donner un résultat négatif lorsque l infection n est pas présente. Si spécificité faible, risque important de faux positif Valeur prédictive positive: probabilité pour un individu ayant un test positif d être infecté par le VIH Valeur prédictive négative: probabilité pour un individu ayant un test négatif de ne pas être infecté par le VIH 11

12 Les limites des tests de dépistage 12

13 Diversité VIH en France A? HIV-1 4 groupes HIV-1 P HIV-2 B HIV-1 O A B C D HIV-1M (E) F virus mosaïques G HIV-1N H K J (I) CRF02 A B C D E 56 formes recombinantes ou CRFs H G F 13

14 Diversité VIH en France A. Maillard, Formation SFLS

15 Stade de l infection taux des marqueurs Fenêtre sérologique Phase d éclipse anti-gp 160 anti-gp 120 anti-gp 41 anti-p24 Test ELISA mixte combiné (4 ème génération) un résultat négatif du test 6 semaines après l exposition peut être considéré comme négatif seuil de détection des marqueurs Ag p24 Contage J Temps (jours) 4 ème génération 15

16 Dépistage de l infection par le VIH en pratique 16

17 Diagnostic de l infection par le VIH Chez l adulte et l enfant >18 mois: Test ELISA 4 ème génération + test de confirmation Confirmation positivité sur 2 ème prélèvement Charge virale si test sérologique indéterminé Chez le nouveau-né et le nourrisson <18 mois: Charge virale (quantification ADN proviral) 17

18 Test ELISA 4 ème génération Spécificité minimale: 99,5% Sensibilité: 100% 18 A. Maillard, Formation SFLS Rennes

19 Confirmation: Immunoblots ou western blots Immunoblot mixte Enveloppe virale: gp120 gp41 Core: Nucleocapside (P7) Capside (p24) RT (p55-p63) Matrice (p17) VIH 1 Intégrase (p32) Protéase (p11) ARN viral VIH 2 Réalisé en cas de test de dépistage positif ou douteux Spécifique du type de virus (VIH-1 ou VIH-2) Mise en évidence spécificité des Anticorps anti-vih 19

20 Quantification de l ARN viral = charge virale VIH Enveloppe virale: RT (p55-p63) Intégrase (p32) Protéase (p11) gp120 gp41 Core: Nucleocapside (P7) Capside (p24) Matrice (p17) ARN viral Réalisée sur plasma EDTA si test de confirmation indéterminé (et avant traitement) Très bonne sensibilité, très bonne spécificité Test couteux, risque de faux négatif chez les patients controleurs 20

21 Barin F et Simon F, Virologie

22 Tests rapides d orientation diagnostique (TROD) 22

23 Tests Rapides d Orientation Diagnostique VIH 23

24 Principes généraux des TROD ligne contrôle Ligne du test Conjugé avec or colloidal +proteine A. Prélèvement Absorbant Ac anti anticorps humain Antigene HIV-1/2 Or Colloidal Conjugé à la Proteine A AC Humains non HIV Ac HIV-1/2 Immunofiltration sur membrane (Through flow) Immunochromatographie (lateral flow) Ag HIV1/2 de synthèse fixés sur support Détection IgG et IgM (1 seul test détecte Ag P24) Contrôle de migration et qualité de l échantillon (Ac anti Ig humaines le plus souvent): Positivité du contrôle indispensable à la validation du test+++ Révélation du complexe Ag-Ac par colorimétrie 24

25 Sérum/ plasma: recueil après centrifugation en milieu spécialisé Matrices des TROD Sang total:sang non décanté avec globules rouges et plasma Fluide gingival (créviculaire): Recueil standardisé entre gencive et face interne lèvre Non autorisé en France (arrêté nov 2010) 25

26 Délai de 1 ère positivité des TROD Risque majeur de transmission taux des marqueurs 4 ème génération anti-gp 160 anti-gp 120 anti-gp 41 anti-p24 seuil de détection des marqueurs Contage J 0 3 ème génération Ag p Temps (jours) Délai de 1 ère positivité des TROD Sensibilité équivalente aux tests EIA 3 ème génération pour les TRODs les + performants 26

27 Les tests disponibles en France Vikia Biomérieux Oraquick Advance Orasure/Orgentec Determine Inverness/Alere INSTI Nephrotek Réalisation simple auprès du patient (pas d instrumentation) Test unitaire Lecture subjective visuelle Rendu rapide (qq minutes 30 min) 27

28 Les tests disponibles en France Pavie et al, PlosOne

29 TROD: prélèvement sang capillaire 29

30 Réalisation simple manuelle 30

31 Réalisation simple manuelle 31

32 Lecture Subjective Visuelle = négatif = positif Un trait Deux traits 32

33 Limites des TROD - Moins sensible que les tests Elisa (risque de faux négatifs). Sang total capillaire < sérum. Pas adapté en primo-infection délai d apparition Ac VIH : jours Variabilité individuelle Diversité virale Risque de faux positifs nécessité de test de confirmation Opérateur dépendant Difficulté d évaluation (contrôle qualité) Négligeance des autres IST 33

34 Sensibilité des TROD sur sang capillaire et «salive» Entre , étude comparative 200 patients: HIV-1 (n=194) 63,3% sous type B ; HIV-2 (n=6); 68, 5% traités par ARVs; HIV neg (n=20) Sang capillaire > salive Pavie et al, PlosOne 2010 Taux Ac dans liquide créviculaire 100 à 1000 fois inférieur au taux AC dans sérum 34

35 Sensibilité combinée sang capillaire + sérum Sérum> Sang capillaire > salive Pavie et al, PlosOne 2010 Diminution affinité Ag-Ac à cause de l hémolyse Dilution des Ac dans le sang total Durée contact Ag-Ac plus courte sur TROD Réaction à température ambiante au lieu de 37 C 35

36 Moins adaptés à la primo-infection Etude comparative Population étudiée: 64 patients en primo-infection ou infection VIH très récente Pandori et al, JCM

37 TROD et diversité VIH Pavie et al, PlosOne

38 Tests Rapides d Orientation Diagnostique. opérateur dépendant. contrôle de qualité difficile hors laboratoire La bande contrôle reste bleu

39

40 TROD 4 ème génération: Determine Combo(Ac+AgP24 (12,5 25 pg/ml) 40 Laperche et al, JID 2012

41 Algorithme d interprétation des TROD TROD Négatif TROD Positif ou indéterminé Nouveau prélèvement ELISA 4G et WB ELISA 4G + WB + ELISA 4G - WB + ou - ELISA 4G + WB +/- ou - VIH négatif VPN 100% si exposition > 3mois Infection VIH Réaction non spécifique Erreur d identification PI probable Attention prise tt Contrôle sérologique charge virale 41

42 Cas pratiques (A. Maillard, Rennes 2012)

43 Patient 1

44 Patient 2

45 Patient 3

46 Patient 4 4 4

47 Patient 5

48 Patient 6

49 Délai de 1 ère positivité des TROD Risque majeur de transmission taux des marqueurs 4 ème génération anti-gp 160 anti-gp 120 anti-gp 41 anti-p24 seuil de détection des marqueurs Contage J 0 3 ème génération Ag p Temps (jours) Délai de 1 ère positivité des TROD Sensibilité équivalente aux tests EIA 3 ème génération pour les TRODs les + performants

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