Modelage du génome de la souris par recombinaison homologue. Exemples en cancérologie. - forme familiale de cancer - cancer acquis du poumon.

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1 Modelage du génome de la souris par recombinaison homologue Exemples en cancérologie - forme familiale de cancer - cancer acquis du poumon.

2 Modelage du génome de la souris par recombinaison homologue Exemples en cancérologie - forme familiale de cancer

3 Melanome : tumeur maligne induite par les UV 95% sporadiques 5% familiaux Gène de succeptibilité p16 INK4a 25-50%

4 Mutation germinale de Cdk4 dans des familles prédisposées aux mélanomes. G G C C C G T G G C C T G T Nature Genetics,1996;12:97-9 CDK4 Arg24 Cys CDK4 R24C oncogène?

5 Mutation affectant le domaine d interaction de Cdk4 avec p16 INK4 INK4 CDK4 Inactif CDK4 CDK4 Cycl D PCNA CIP/ KIP prb/e2f PCNA CIP/ KIP CDK4 R24C CDK4 R24C Cycl D INK4 CIP/ CDK2 KIP Cycl E Inactif CIP/ KIP + ++ CDK2 Cycl E Actif prb + E2F CDK2 CDK2 Cycl E CIP/ KIP CIP/ Cycl E KIP Inactif (Science, 1995;169:1281-4)

6 Allèle CDK4 + ATG TGA Vecteur PGK-TK LoxP PGK-Neo LoxP ATG HindIII* TGA Allèle CDK4 (ou Neo*) LoxP PGK-Neo LoxP ATG HindIII* TGA

7 Electroporation des cellules ES Culture sous double sélection Southern Blot ES + / Neo* Implantation Agrégation dans morula Chimeres (+/+, +/Neo*) X +/+ Transmission Germinale +/+ +/Neo*

8 CDK4 Knockout +/Neo* X +/Neo* +/+ +/Neo* Neo*/Neo* 25.5% 55 % 19.5% RT-PCR CDK4 -Actine +/+ Neo/Neo +/+ Neo/Neo +/+ Neo/Neo +/+ Neo/Neo Allèle bp Allèle Neo* Neo 800 bp +/+ +/Neo Neo/Neo Testicule Ovaire Pancréas 800 bp 640 bp

9 Cre +/Neo* X +/+ Lignée CDK4 R24C 740 bp 640 bp Allèle + 640bp Allèle R24C 740bp - HindIII - HindIII Cre +/R24C 460 bp 280 bp +/+ R24C/R24C Allèle CDK4 (ou Neo*) LoxP PGK-Neo LoxP ATG HindIII* TGA Cre recombinase Allèle CDK4 R24C LoxP ATG HindIII* TGA

10 Survie (%) Courbes de survie : souris CDK4 R24C/R24C Cdk4 R24C/R24C Males (n=61) Cdk4 R24C/R24C Femelles (n=44) Cdk4 +/+ (n=40) Semaines

11 Hyperplasies et tumeurs pancréatiques endocrines précoces

12 Tumeurs multiples tardives CDK4 R24C/R24C Asymptomatiques (n=50) 4 4 % CDK4 R24C/R24C Symptomatiques (n=105) Nombre de tumeur(s) / souris

13 Tumeurs chez les souris CDK4 R24C / R24C Symptomatiques Asymptomatiques % (N=105) (14 à 16 mois) (N=50) 60 Mésenchymateuses 50 Endocrines 40 Epithéliales non endocrine Autres

14 Souris Cdk4 R24C/R24C : Tumeurs mésenchymateuses

15 CD31 (x200) CD34 (x400 )

16 Souris Cdk4 R24C/R24C : Tumeurs endocrines Symptomatiques (N=105) Asymptomatiques (N=50) % * % Males * Pancréas Testicule Hypophyse Autre Hyperplasie * Pancréas Testicule Hypophyse

17 INS INS+PP INS+GLU

18 Cdk4 +/+ Cdk4 -/- IHC Anti-Cdk4

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20 Tumeurs épithéliales non endocrines Souris CDK4 R24C/R24C % Symptomatiques (N=105) 35 Asymptomatiques (N=50) Poumon Foie Autre Poumon Foie Autres Carcinomes Adénomes

21 Conclusion Tumeurs souris CDK4 R24C/R24C - multiples, forte incidence - mais tardif (>10 mois) - Sous types : endocrines hyperplasie puis tumeur angiosarcomes de novo Modèles : Anomalies surajoutées? Mécanismes de progression tumorale Coopération oncogenique in vivo Test in vivo d inhibiteurs de la phase G1

22 Tumeurs Mélanocytaires? Spontanés : Non Induites? mélanomes) Initiateur DMBA (0.5 mg) TPA (5 mg) : DMBA+TPA (papillomes & Promoteur 7,12-dimetylbenzanthracene 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate Histologie J7 J21 S15 S30 Suivi : taille / carte des lésions PNAS, 2001;98:

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24 Cdk4 R24C/R24C DMBA+TPA

25 Lésions cutanées (DMBA+TPA) Type

26 Modelage du génome de la souris par recombinaison homologue Exemples en cancérologie - forme familiale de cancer - cancer acquis du poumon.

27 Introduction Modèle préclinique de tumorigénèse De rares cancers résultent d une prédisposition familiale. Mais pour la plupart, les cancers sont des maladies acquises de la cellule. Difficulté de modèlisation - Introduire une / des anomalie(s) acquise(s).

28 Les 3 gènes Ras J. Harvey : 1964 Murine Leukaemia virus capable de provoquer des sarcomes chez le rat. W. Kirsten : 1967 Murine erythroleukaemia virus capable de provoquer des sarcomes chez le rat. Terminologie v-ras pour virus «Rat Sarcoma» Oncogènes humains identiques aux séquences virales : 1981 (H-Ras et K-Ras) Activation par mutation ponctuelle dans cancers ( ) 1982 Homologue cloné dans neuroblastome humain : N-Ras

29 Rappel sur protéines RAS Médiateurs de signaux prolifératifs (facteurs de croissance), essentiel pour prolifération cellulaire (sortie G0 et G1). Tyrosine Kinase Receptor Growth Factor GEFs: Guanine nucleotide exchange factors GAPs: GTPase-activating protein DOWNSTREAM SIGNALLING

30 Mutation des gènes Ras dans les tumeurs humaines DEFECT OR MUTATION TUMOR TYPE FREQUENCY (%) RAS mutations Pancreas 90 (K) Lung adenocarcinomas Colorectal 35 (K) 45 (K) Thyroid (follicular) Thyroid (undifferentiated papillary) 55 (H, K, N) 60 (H, K, N) Seminoma 45 (K, N) Melanoma 15 (N) Bladder Liver Kidney 10 (H) 30 (N) 10 (H)

31 Cancers du poumon Première cause de mortalité par cancer dans le monde

32 Ex. : Analyse Immuno-Histochimique Cytokératine 7 TTF-1 La détection par immuno-marquages de TTF-1 et CK7 indique l origine terminale respiratoire des cellules carcinomateuses (TTF-1 = marqueur de l unité terminale respiratoire, exprimé par l épithélium des bronchioles et des alvéoles)

33 Hétérogénéité moléculaire des carcinomes pulmonaires non à petite cellules Anomalie(s) inconnue(s) KRAS EGFR Mutations KRAS, ± 20% Mutations EGFR (ERBB1), ± 12% Mutations ERBB2 (HER2), ± 5% Fusions KI5B/EML4-ALK, ± 4% Mutations PI3KCA, ± 3% Mutations BRAF, ± 3% Non déterminé, ± 60% Fréquence des anomalies moléculaires à visée théranostique d après les données de l INCa 2010.

34 Thérapie ciblée dans les adénocarcinomes pulmonaires EGFR RAS-GTP Mutation 20 à 30% Perte activité GTPase Signalisation constitutivement Active Ciblage pharmacologique direct difficile 1/2 1/2

35 Modéliser la mutation de K-ras : Obtention de modèles murins précliniques - Pouvant récapituler l histoire naturelle des cancers (modèles conditionnels) - Permettant d interroger les voies de signalisation Par des approches de génétique constitutionnelle (Knock-out) effets sur l initiation de la tumeur sur la cinétique de croissance Par des approches de génétique acquise (Knock-in) une fois la tumeur en place effets sur la cinétique de croissance (thérapeutique?) Par des approches pharmacologique effets sur la cinétique de croissance validation préclinique de thérapie

36 Modéliser la mutation de K-ras - Knock-in conditionnel K-ras V12G (C. Guerra, CNIO 1999!) K-Ras (+/LSLG12Vgeo) V12 ATG * TGA f STOP f A 4B 3 UTR IRES f K-RasV12 p21* A 4B 3 UTR K-Ras p21 beta-gal LacZ-neo 3 UTR - L allèle oncogénique reste silencieux jusqu à l activation de la recombinase Cre. - En fonction de la stratégie d introduction de la Cre, possibilité d un contrôle dans le temps ou spécifique de cellules. - Permet aussi le suivi des cellules K-Ras mutées par histochimie

37 ATG Exons 1-27 Activation chez l animal adulte Kras (+/G12V lox) x RERT (ERT2/ERT2) TGA E 28 ATG IRES CreERT2 polya Lignée RERT (ERT2/ERT2) RNA pol II CreERT2 Inactive 4OH-Tamox. + 4OH-Tamox. V12 ATG * TGA f STOP f A 4B 3 UTR IRES f K-RasV12 p21* A 4B 3 UTR K-Ras p21 beta-gal LacZ-neo 3 UTR Co-expression Kras V12G & traçeur LacZ Effet dose-dépendant

38 Faibles doses d 4OH-Tamoxifen à P30 Seulement quelques cellules Kras +/G12V

39 Evolution naturelle - Hyperplasie - Adénome - Carcinome

40 Inconvénient : l activation de la Cre n est pas ciblée Mais toutes les souris traitées par l 4OH-Tamoxifen meurent de tumeurs pulmonaires (sans autres cancers)... en 8 à 12 mois

41 Survie (%) Ad-Cre Activation ciblée chez l animal adulte Kras (+/G12V lox) infectées par voie intra-trachéale par adenovirus-cre K-Ras V12 Développement tumoral Age (semaines) Avantages stratégie adenovirus-cre : ciblé sur épithélium respiratoire développement tumoral + rapide Inconvénients : lésions multiples activation de Kras G12V diffuse, différent de physiopathologie.

42 Classification des tumeurs selon atypies cellulaires et nucléaires (de I à V) Jackson, E.L. et al. Cancer Res. 65, (2005). I II III IV V = IV + fibrose (stroma)

43 Nombre de tumeurs/souris Nombre de tumeurs/souris Applications : croisements Kras (+/G12V lox) avec KO ou KO cond.* Effet sur tumorigenèse Gènes ciblés Pas d effet (ou peu) sur tumorigenèse p=0.7 P=0.01 GradeII GradeIII GradeIV A-Raf K-Ras V12 B-Raf Mek1 Mek2 Erk1 Erk2 c-raf FTase???? p=0.9 p=0.9 p=0.2 GradeII GradeIII GradeIV Cdk4 c-raf * Erk1 + Erk2 * Mek1 * + Mek2? Cdk4 Cdk6 Cdk2 Kinases cyclines dépendantes de la phase G1 du cycle cellulaire FTase * Cdk2 Cdk6 Erk1 Erk2 * Mek1 * Mek2 B-Raf *

44 Nombre de tumeurs/souris Survie (%) Exemple : craf +/+ x Kras +/G12V lox et craf lox/lox x Kras +/G12V lox Infection par adenocre Courbe de survie c-raf +/+ c-raf lox/lox 20 6 mois après activation Age (semaines) K-Ras +/LSLG12Vgeo ; K-Ras +/LSLG12Vgeo ; c-raf +/+ c-raf lox/lox 40 P=0.01 P= P= K-Ras +/LSLG12Vgeo ;c-raf lox/lox 0 GradeII GradeIII GradeIV null lox Southern blot : tumeurs collectées 8 mois après l activation oncogénique de K-Ras V12 L oncogène Kras V12G ne peut pas induire de tumeurs en l absence de c-raf

45 Exemple : Cdk4 -/- x Kras +/G12V lox x RERT ERT2/ERT2 Exemple : Cdk4 -/- x Kras lox/g12v lox x RERT ERT2/ERT2 f 1 Allèle K-ras lox Cdk4 +/+ Cdk4 -/-

46 Cdk4 : cible thérapeutique? Effet de l ablation de Cdk4 après l initiation tumorale. Cdk4 -/FRT x Kras lox/g12v lox x RERT ERT2/ERT2 Allele Cdk4 FRT C. Barrière Ciblage épithélium pulmonaire Adéno - Flpe Allele Cdk OH Tamoxifène à 3 semaines - Imagerie (CT scan) : souris pourtant tumeurs de 1 mm ou plus - Infection intra-trachéale Ad-Flpe ou Ad-GFP (contrôle) - Suivi Imagerie - Histologie terminale

47 Effet de l ablation de Cdk4 après l initiation tumorale. Cdk4 -/FRT x Kras lox/g12v lox x RERT ERT2/ERT2 Effet de l inhibition pharmacologique de Cdk4 après l initiation tumorale : Kras lox/g12v lox x RERT ERT2/ERT2 PD inhibiteur sélectif de Cdk4 et Cdk6 Souris traitées à 4 mois 0 mg/kg/j 100 mg/kg/j 150 mg/kg/j

48 Conclusions / Perspectives - c-raf, Mek1+Mek2, Erk1+Erk2 : cibles thérapeutiques potentielles. A valider sur tumeurs induites. Toxicité? - Cdk4, cible thérapeutique validée pour tumeurs pulmonaires de souris liées à l activation de K-Ras - Homme : Adénocarcinomes mutés pour KRAS - plus complexes sur le plan moléculaire - plus agressifs (local + métastases) Peut on extrapoler les résultats des modèles murins? - Vers un essai clinique du Cancéropôle G.S.O. Laboratoires L. : inhibiteur spécifique de Cdk4 Intérêts +++ pour essais de phase 1 avancée et de phase 2