Etapes générales. Polonator. Protocole. Préparation des échantillons. Dover. Séquençage par hybridation/ligation de nonamères. Mise en service en 2009

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1 Next Generation DNA Sequencing Pourquoi? Séquençage par la méthode de Sanger est pour l instant le «gold standard» Besoins de séquencer toujours plus, plus vite et moins cher But: Séquencer 1 génome humain en moins de 24h et pour moins de 1000$ Plateformes Dr Stéphane PINSON Responsable du Plateau Commun de Génétique Diagnostique Coordonnateur du réseau clinique Neurofibromatose Rhône-Alpes Auvergne Service de Génétique Moléculaire et Clinique Consultation Oncogénétique Hôpital Edouard Herriot - Bâtiment 7 5 Place d'arsonval Lyon France Archon X PRIZE Foundation 1ère équipe à séquencer 100 génomes humains en 10 jours gagne 10 millions $ (error rate <1/100000bp;coverage>98%and cost<10000$ each) 454 FLX genome sequencer Solexa genome analyser Solid system Life sciences Roche Pyroséquençage à ultra haut-débit Mise en service en 2005 Illumina Séquençage par resynthèse via terminateurs réversibles Mise en service en 2006 Applied Biosystems Séquençage par hybridation/ligation d octamères Mise en service en

2 Polonator Préparation des échantillons Etapes générales Dover Séquençage par hybridation/ligation de nonamères Mise en service en 2009 Protocole Coupure aléatoire (random fragmentation) de l ADN génomique Ligation de fragments adaptateurs Fixation et amplification des fragments plusieurs techniques différentes Extension enzymatique avec émission de fluorescence cycles plusieurs techniques différentes Capture d image de la plaque à chaque cycle D après Shendure et al. Emulsion PCR Solid-Phase amplification: Bridge PCR Préparation des échantillons Les fragments d ADN sont amplifiés dans une goutte d huile qui contient des bead (perle) 1 primer (amorce) est attaché à la surface de la bead 1 primer différent par bead Utilisé par les technologies 454, SOLiD et Polonator. Support constélé de primers correspondants aux adaptateurs Fixation des matrices sur le support Amplification par cycles avec chaque adaptateur qui va former un pont avec les adapteurs déjà fixés Utilisé par la technologie Solexa. 2

3 Solid-Phase amplification: Bridge PCR 454 FLX genome sequencer (1) Séquençage Pyroséquençage à ultra haut-débit D après Ansorge et al. 454 FLX genome sequencer (2) Solexa genome analyser Séquençage par re-synthèse via terminateurs réversibles Film 1 D après Ansorge et al. 3

4 Solid system 2/3 Solid system 1/3 Solid system 3/3 Séquençage par hybridation/ligation d octamères avec 2 bases codantes Film 2 D après Voelkerding et al. D après Voelkerding et al. D après Voelkerding et al. Quel machine pour quelle activitée? 454 : séquençage de novo et re-séquençage Solexa : re-séquençage SOLiD : re-séquençage, détection de SNP et étude de l'organisation des génomes. NGS vs SANGER Préparation de la banques de matrices plus facile pour le sequençage de novo (plus besoin de clonage in vitro et notamment transformation bactérienne et picking des colonies) Augmentation du nombre de spots par diminution de la surface nécessaire Utilisation des réactifs en cycle grâce à la fixation des matrices Mais Taille de lecture continue faible Précision et certitude du basecalling Volume de données produit Stockage ( 1Gb par run) Analyse compétences bio-informatiques Vérification de la qualité (reproductibilité technique ; obtention des données consensus) Nombreuses applications... Reséquençage massif des génomes (Re-SEQ) pour en identifier les variations, (SNP, indels, grandes duplications et délétions, inversions, insertions, translocations, anomalies de ploïdie, etc ) Séquençage ciblé d'une collection d'échantillons (Target-SEQ) Séquençage de novo Identification des petits ARN (srna-seq) Expression des gènes (RNA-SEQ) Cartographie des sites de méthylation (M-SEQ) Cartographie des sites de fixation des protéines et des modifications, épigénétiques de la chromatine (ChIP-SEQ) Recherche des interactions chromatiniennes à distance (Chromosome Conformation Capture) Metagenomics= Code barre moléculaire de solutions complexes Utilisation de puces (Recaptage, exome,...) Applications diagnostiques (Seq bacterien / multigéniques / pangénomique...) 4

5 sanger 454 Solexa Solid Polonator Taille de lecture (en bp) Méthode de production des polonies Enzyme de séquençage Méthode de séquençage Durée 1 run PCR polymerase Dyes terminator 3 heures Emulsion PCR polymerase Pyrosequencing 10 heures Bridge PCR polymerase Reversible dyes terminator 2.5 jours Emulsion PCR ligase Octamers with twobase encoding 6 jours Emulsion PCR ligase nonamers 3.5 jours Next Next generation Nombre total de bases lues par run (en Gb) Coût de reviens par kilobase (en $) Single molecule sequencing Pas d amplification Préparation des échantillons + simple Durée de séquençage + courte Coût des réactifs - cher Heliscope sequencer Helicos SMRT Pacific Biosciences VisiGen Visigen Biotechnologies OmniMoRA Reveo Qui? Heliscope sequencer Helicos Séquençage par re-synthèse via des extensions asynchrones Mise en service en 2008 Film 3 D après Pettersson et al. 5

6 Immobilizing single molecule template Heliscope sequencer SMRT Single Molecule Real Time Film 4 Séquençage par re-synthèse via des extensions asynchrones Pas d amplification, seulement fixation de la matrice Utilisé par la technologie Heliscope Polymérase attachée au fond du puits VisiGen Basé sur la technique FRET : Fluorescence Resonance Energy Transfer OmniMoRA Omni Molecular Recognizer Application 2 fluorophores différents: 1 fluorophore sur la polymérase (donneur) et 1 fluorophore sur le nucléotide (accepteur) Transfert d énergie d une polymérase à un nucléotide 1 fluorophore différent par base (soit 4 fluorophores accepteurs différents) Quand un nucléotide est incorporé, déclenchement d un signal FRET: La molécule d ADN s illumine et la couleur indique la base lue D après Pettersson et al. Nano-pore: reconnaissance physique de la base lors de son passage à travers un pore par mesure de la conductivité Nano-Knife: Immobilisation du fragment et mesure de la conductivité entre chaque base Films 5 &6 6

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10 FUTURE PERSPECTIVE 10