Cytogénétique et biologie moléculaire

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1 Cytogénétique et biologie moléculaire apport au diagnostic, à l évaluation pronostique et au suivi des hémopaties malignes C Bastard, DESC, 21 septembre 2009

2 Pourquoi est-ce possible? Parce que les anomalies génétiques des hémopathies (comme celles des autres tumeurs) sont : - acquises - limitées à la tumeur - spécifiques - clonales

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4 Par rapport aux classifications antérieures, morphologiques, l OMS prend en compte: - la clinique - l immunologie - la génétique - la cellule d origine pour le diagnostic des hémopathies

5 Qu apporte la génétique à la classification des hémopathies et à la prise en charge des patients? - un élément objectif - une indication physiopathologique - une indication concernant d éventuelles cibles thérapeutiques - divers outils d évaluation et de suivi

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7 Le chromosome philadelphie 1960 délétion chromosome translocation 9; translocation réciproque 1980 translocation BCR-ABL 1985 tyrosine kinase 1999 STI 571

8 Conséquences des translocations des hémopathies: plusieurs modèles gène de fusion substitution de promoteur

9 translocations spécifiques : À chaque type de leucémie correspond une translocation particulière : - t(9;22) des LMC - t(8;21) des LAM2 avec maturation - t(15;17) des LAM3 - t(4;11)(q21;q23) des LAL - t(9;11)(p21;q23) de certaines LAM - t(11;19)(q23;q13) d autres LAM générant des transcrits de fusion

10 translocation spécifique : À chaque type de lymphome correspond une translocation particulière : - t(14;18)(q32;q21) des folliculaires - t(8;14)(q24;q32) des Burkitt - t(11;14)(q13;q32) des manteaux - t(3;14)(q27;q32) des DLCL - t(9;14)(p13;q32) des plasmocytaires - t(14;19)(q32;q13) des slp atypiques responsables d'une substitution de prmoteur

11 Les outils du diagnostic génétique: - cytogénétique conventionnelle - cytogénétique moléculaire - biologie moléculaire, et surtout PCR, RT-PCR RT-PCR quantitative

12 Technique cytogénétique dissociation, mise en suspension culture choc hypotonique, fixation, étalement marquage, photographie

13 Résultats cytogénétique Anomalies de nombre perte de chromosomes = perte de fonction gain de chromosomes = gain de fonction? ou perte de fonction?

14 Résultats cytogénétique Anomalies de structure gain ou perte de matériel génétique juxtaposition de séquence normalement situées sur des chromosomes différents

15 Résultats cytogénétique Anomalies primaires présentes dès le diagnostic parfois isolées rôle dans la pathogénie => spécifiques intérêt diagnostic outil de suivi

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17 Résultats cytogénétique Anomalies secondaires additionnelles non spécifiques non aléatoires non isolées rôle dans la progression

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19 Limites de la cytogénétique faible contingent tumoral faible prolifération tumorale qualité des images

20 cytogénétique moléculaire La cytogénétique moléculaire a pour objectif de repousser les limites de la cytogénétique conventionnelle en utilisant la propriété qu a l ADN dénaturé de se réassocier avec une séquence complémentaire sur un chromosome ou sur un noyau interphasique

21 Hybridation in situ fluorescente FISH principe Préparation cytologique ou cytogénétique dénaturation de l ADN in situ hybridation avec une sonde - fluorescente - ou marquée par un haptène observation au microscope

22 Peintures chromosomiques

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24 Séquences uniques

25 t(2;5) sonde ALK

26 t(2;5) sonde ALK

27 dup(1q) 2 nl 2 transloqué t(1;14)

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30 M-FISH mix 24 sondes

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34 PRECISION add(3)(p) 3 add(3)(p) mar der(3)t(3;4;18) dup(3)

35 CORRECTION 5 Inv(5)(q14q31) 6 Inv(6)(q12q23) der(4)t(4;12)(q12;q21) der(6;13)t(6;13;2)

36 biologie moléculaire La biologie moléculaire dispose d outils classiques : Southern blot, Northern blot d outils plus récents, reposant essentiellement sur des techniques d amplification : PCR, RT-PCR, PCR quantitative, PCR longues, LDI-PCR d outils d avenir : micro arrays

37 Elle peut répondre à des questions concernant la clonalité le diagnostic le pronostic

38 Southern blot hybridation avec une sonde JH détection - des réarrangements somatiques des gènes d Ig - des translocations impliquant la région JH-Switch µ

39 PCR : identification des translocations spécifiques Des leucémies aigues LAM : t(8;21), inv(16), t(15;17), t(11;19) etc LAL : t(9;22), t(4;11), t(1;19), t(12;21) De la LMC : t(9;22)

40

41 PCR : identification des translocations spécifiques Des lymphomes: t(14;18) des folliculaires t(11;14) des manteaux t(2;5) des anaplasiques T t(9;14) des lympho plasmocytaires t(11;18) des MALT plus difficilement t(8;14) des Burkitt t(3;14) des lymphomes diffus à grandes cellules dont la detection est plus facile en FISH

42 PCR quantitative LA SONDE TAQMAN R Q 5 3 R = Reporter Q = Quencher (TAMRA) Structure d une sonde TaqMan Taille de nt Tm : C

43 L ESSAI 5 NUCLEASE AVEC SONDE TAQMAN Polymérisation Primer Forward 5' 3' 5' R Q Primer Reverse 5' 3' 5' R = Reporter Q = Quencher Déplacement de la sonde 5' 3' 5' R Q 5' 3' 5' Clivage 5' 3' 5' R Q 5' 3' 5' Polymérisation terminée R Q 5' 3' 5' 5' 3' 5'

44 PCRquantitative : construction des courbes standards BCL6 BCL6 PBGD PBGD

45 Les circonstances : - diagnostic - objectifs - confirmation diagnostique - évaluation pronostique - conception du suivi - inclusion dans les protocoles - suivi - objectif - évaluation de la maladie résiduelle

46 Confirmation diagnostique toute technique, cytogénétique ou moléculaire permettant la mise en évidence d une translocation spécifique Evaluation pronostique dépendant de la translocation identifiée mauvais pronostic: Phi, t(4;11), t(8;14) bon pronostic: t(8;21), inv(16), t(12;21) dépendant d un autre réarrangement duplication de FLT 3, de MLL mutation de NPM1, CEBPa...

47 Evaluation pronostique dépendant de la pathologie LLC : mutations Ig, FISH del(11), p53, +12, del(13)(q14) CD 38, ZAP 70 myélome : del(13), hypodiploïdie, t(4;14), t(11;14) Myélodysplasies : IPSS, dépendant du caryotype dépendant de la cinétique de réponse diminution du clone Ig ou TCR dans les LAL diminution d un transcrit de fusion dans les LAM

48 Maladie résiduelle Ce qui reste de la tumeur après une séquence thérapeutique appréciation variable en fonction de l abord technique utilisé: clinique imagerie morphologie (cytologie, histologie) immuno-phénotype génétique (caryotype, Southern, PCR, PCR en temps réel)

49 xxxx

50 xxxxxx xxxxx

51 xxxxxxxxxxxx xxxxxxxxx

52 Inclusion dans les protocoles Thérapeutiques Suppose de plus en plus souvent une confirmation génétique du diagnostic LNH du manteau et t(11;14) ou hyper expression de cycline D1 LAM 3 et t(15;17) ou transcrit PML-RARA

53 Intérêt des abords complémentaires Cytogénétique et biologie moléculaire Biologie moléculaire et FISH Identification de points de cassure inhabituels Développement d outils de suivi spécifiques des transcrits variants (LMC, LAM3)

54 Mise en évidence d un transcrit de fusion inhabituel : Globules blancs : 68.4 Giga/L ( ), Polynucl. Neutro Giga/L ( ), Myelocytes 14% (0), Metamyelocytes 2% (0), Cellules hyperbasophiles 3% (0) Caryotype : 46, xy, t(9;22)(q34;q11)[20] Typage de la translocation par RT-PCR en temps réel Amorce BCRe1 Amorce ABLe2 Amplification du transcrit de fusion par PCR conventionnelle Témoins m-bcr (dilution au 1/10) Patient (moelle au diagnostic) Amorce BCRe1 Insertion ~850pb Amorce ABLe2 Séquençe du transcrit de fusion : jonction BCRe1 e8 -ABLe2 BCR e1 e2 e8 ABL H G D A D G S F G TCCATGGAGACGCAGATGGCTCGTTCGGAA BCR exons 1 BCR exons 2 P A S T P R R Q S N E A L Q R P V A S D TCCAGCATCAACACCCCGACGGCAGTCCAATGAAGCCCTTCAGCGGCCAGTAGCATCTGAC BCR exons 8 ABL exon2 (incomplet, -20 pb en 3 ) insertion 3pb

55 Un mot des microarrays outils pangénomiques couteux non encore adaptés au diagnostic et à l évaluation pronostique explorent la transcription les variation de nombre de copies des gènes - array CGH, SNP arrays principe hybridation simple ou compétitive d'un ADN/ADNc sur des oligonucléotides fixés sur un support

56 µarrays : hétérogénéité des LDGC (Staudt et al, 2000, 2002)

57 µarrays : prediction de la réponse au traitement (Shipp et al, 2001)

58 CGH array : délétion 9p

59 CGH array : délétion 9p

60 SNP - arrays Principe - le génome contient des polymorphismes affectant un unique nucléotide - distants les uns des autres de quelques Kb - la probabilité, chez un individu, que sur une certaine distance aucun de ces polymorphismes ne soit présent à l état hétérozygote est extrêmement faible - détecte aussi les disomies uniparentales

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62 Conclusion Analyses de plus en plus nombreuses Techniques de plus en plus variées - PCR, PCR quantitative, séquence y compris du génome entier Difficulté à concilier variété des examens et fiabilité, proximité et diversité Nécessité d une mise en réseau avec pour objectif d offrir à tout malade un diagnostic biologique et un suivi optimal

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