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4 Oxoid s area of expertise )&' )' & ' ' & '' ' (

5 Oxoid Products Dehydrated Media Prepared Media Latex Agglutination Kits BAX System from DuPont Qualicon

6 DuPont Qualicon et Oxoid Association avec Oxoid en Europe et en Australie. Support technique, installation-formation et développement de produits Deux automates de biologie moléculaire

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8 Les méthodes de détection des bactéries Méthodes traditionnelles méthodes normalisées : - longues - fastidieuses

9 Les méthodes de détection des bactéries Méthodes traditionnelles méthodes normalisées : - longues - fastidieuses Développement des méthodes alternatives : - réduire les temps d analyse - réduire les temps de manipulations

10 Les méthodes de détection des bactéries Méthodes traditionnelles méthodes normalisées : - longues - fastidieuses Développement des méthodes alternatives : - réduire les temps d analyse - réduire les temps de manipulations Tests biochimiques Milieux chromogènes Tests immuno-enzymatiques : - tests manuels - tests semi-automatisés

11 Les méthodes de détection des bactéries Techniques de Biologie moléculaire - hybridation ARN - PCR manuelle - PCR automatisée Méthodes traditionnelles méthodes normalisées : - longues - fastidieuses Développement des méthodes alternatives : - réduire les temps d analyse - réduire les temps de manipulations Tests biochimiques Milieux chromogènes Tests immuno-enzymatiques : - tests manuels - tests semi-automatisés

12 la PCR POLYMERASE CHAIN REACTION

13 Principe de la PCR La PCR permet d obtenir des millions de copies d un fragment d ADN. La succession de cycles PCR dans un thermo-cycleur permet d obtenir ces copies. Les fragments amplifiés sont ensuite détectés.

14 Evolution de la PCR 1985 lancement de la PCR - invention par le Dr Kary Mullis de la méthode PCR, puis vente de la licence à Hoffman-La Roche pour 300 millions $ en La PCR a de nombreuses applications dans différents domaines scientifiques mais sa mise en oeuvre requiert un personnel qualifié et de nombreuses étapes.

15 Evolution de la PCR Examples de domaines d applications : -Diagnostic clinique -Études génomiques - archéologie - Détection rapide des pathogènes alimentaires

16 La PCR amplifie uniquement les segments d ADN cible : spécificité ADN cible de l organisme + PCR ADN autre + PCR Pas d amplification

17 La PCR est une méthode de détection très sensible: des millions de copies du gène cible sont générées ADN cible de l organisme + PCR

18 La PCR permet de détecter les bactéries stressées : l ADN n est pas affecté par les conditions environnementales Réactions anti-corps ADN ARN Protéines Réactions métaboliques Profils acides-gras

19 La mise en oeuvre de la PCR manuelle nécessite: d avoir un personnel qualifié d avoir une pièce séparée pour l amplification-détection du fait des risques de contaminations PCR lors de la détection. De mettre en place des mesures pour la gestion de déchets comme le BET.

20 Tous les inconvénients de la PCR manuelle disparaissent avec l automatisation.

21 Système BAX automatisé Un automate pour la détection PCR des germes pathogènes alimentaires en routine

22 Système BAX automatisé Un automate pour la détection PCR des germes pathogènes alimentaires en routine *+, Oui Non

23 Une méthode PCR simplifiée et automatisée 1. Préparation de l ADN 2. Amplification de l ADN 3. Détection de l ADN

24 Une méthode PCR simplifiée et automatisée 1. Préparation de l ADN 2. Amplification de l ADN 3. Détection de l ADN

25 Une méthode PCR simplifiée et automatisée 1. Préparation de l ADN - préparer les réactifs et les tubes - lyse des cellules à partir du bouillon d enrichissement - ajouter les échantillons lysés aux tubes PCR

26 Une méthode PCR simplifiée et automatisée 1. Préparation de l ADN 2. Amplification de l ADN 3. Détection de l ADN

27 Une méthode PCR simplifiée et automatisée 2. Amplification de l ADN - Réactifs PCR sous forme de comprimé - élimine multiples étapes de transfert - réduit les risques potentiels d erreur de manipulation. L amplification et la détection se font dans l automate.

28 Une méthode PCR simplifiée et automatisée 1. Préparation de l ADN 2. Amplification de l ADN 3. Détection de l ADN

29 Une méthode PCR simplifiée et automatisée Détection de l ADN - Analyse automatique des courbes de fusion - affichage des résultats sous forme + ou -.

30 Principe de détection

31 Les courbes de fusion ADN

32 Le principe des courbes de fusion Le marqueur produit un signal fluorescent quand il est lié à de l ADN double brin. La température de fusion (Tm) est celle à laquelle un fragment d ADN donné devient simple brin. Tm dépend de la longueur du fragment d ADN et du contenu en G-C Plus de paires de bases --> Augmentation de Tm contenu G-C plus élevé --> Augmentation de Tm

33 Exemple de courbe de fusion ADN Données brutes Données traitées

34 Interprétation automatique des courbes de fusion par le logiciel Courbes de fusion pour Listeria - Pic contrôle à C - Pic cible à C

35 Resultats

36 BAX system pour la détection des pathogènes alimentaires Kits disponibles Salmonella (AOAC RI, AOAC OMA, AFNOR) Listeria monocytogenes (AOAC RI, AOAC OMA) Genus Listeria E. coli O157:H7 (AOAC-RI) Enterobacter sakazakii Et bientôt disponible : Campylobacyter coli/jejuni; levures/moisissures.

37 Kits Automated BAX System 96 tests par kit tubes PCR avec comprimé capuchons tubes PCR supplémentaires tampon de lyse Protease

38 Le système BAX automatisé Avantages

39 Le système BAX Vous permet de réduire les temps de manipulation grâce à : des outils et consommables adaptés pour minimiser les temps de manipulation : - la majorité des étapes permettent de traiter les échantillons avec une pipette multi-canaux - outils de fermeture/ouverture des tubes Un protocole simple comportant peu de manipulations, adapté aux grosses séries : - pas de centrifugation, reprise de culots...

40 Un exemple de planning journée pour 70 analyses BAX Listeria 8h 8h30 9h 9h30 10h 11h 12h BAX : 70 échantillons Listeria lyse des 70 Listeria (transfert MOPS-BLEB dans tubes de lyse, préchauffage des bains à sec) chauffage 60' à 55 C programmation de l'appareil chauffage 10'à 95 C puis 5'dans cooling block, transfert dans les tubes PCR- 3h30 de process dans l'appareil 13h 14h 15h Résultats des 70 analyses BAX Listeria à 14h00 temps manip : 1h30 16h

41 Le système BAX Les délais de résultats courts (dès J1) vous permettent de : libérer plus rapidement matières premières et produits finis : baisse des coûts de stockage Production Temps (jours) Test matières premières Test produis finis vente Gain 10 jours

42 Le système BAX Les délais de résultats courts (dès J1) vous permettent de : libérer plus rapidement matières premières et produits finis : baisse des coûts de stockage Mieux gérer la répartition des analyses sur la semaine

43 Un exemple de planning semaine pour les analyses BAX Salmonella Test Automated BAX Salmonella- Exemple de planning semaine lundi mardi mercredi jeudi vendredi samedi dimanche lundi enrichisst EPT 16h-20h BHI BAX enrichisst EPT BHI 16h série 1 BAX enrichisst EPT BHI 16h série 2 BAX enrichisst EPT BHI 16h série 3 BAX enrichisst EPT BHI 16h série 4 3h stockage à 4 C série 5 BAX

44 Le système BAX Vous permet de bénéficier des avantages de la technologie PCR : spécificité totale : 100% - pas d interactions avec d autres bactéries sensibilité élevée : - Salmonella : 1 à 10 UFC/25g Délai de réponse : à UFC/ml de BHI. - Salmonella, Enterobacter sakazakii, E. coli 0157:H7 : résultats dès J1

45 Le système BAX tout en ayant une méthode très simple à mettre en place : Start-Up package BAX system : - tout l équipement, y compris les pipettes sont incluses - permet de démarrer de zéro

46 Le système BAX tout en ayant une méthode très simple à mettre en place : Automatisation de la détection et tubes PCR fermés: - élimination des risques de contamination. - pas de pièce séparée nécessaire Réactifs PCR sous forme de comprimés - élimine les étapes cruciales de pipetage Résultats accessibles directement, sans interprétation grâce à un logiciel convivial : - pas d analyses de courbes de fluorescence à réaliser

47 Le système BAX avec une grande souplesse d utilisation : Jusqu à 96 échantillons à la fois les différents germes peuvent être recherchés simultanément sur l automate.

48 Le système BAX, la solution PCR Validée AFNOR, AOAC, UKAS, Adopté et reconnu par le FSIS (USDA) Validé et adopté par des sociétés internationales : Nestlé, Kraft, Cargill, Smithfield group

49 La biologie moléculaire, des solutions pour : La détection L identification/caractérisation BAX Screening System RiboPrinter System

50 Le RiboPrinter System - Appareil basé sur un principe de biologie moléculaire complètement automatisé pour rechercher l origine de contamination et faire de la traçabilité. - Permet d obtenir en 8h l empreinte génétique de toute bactérie.

51 Les profils RiboPrint permettent de différencier clairement les genres bactériens

52 Les profils RiboPrint permettent d observer la diversité au sein des genres et espèces

53 Un exemple de profils Riboprinter montrant une discrimination intra-spécifique

54 Le Riboprinter, un outil pour la traçabilité rapide des bactéries Ecologie d atelier comparaison au cours du temps des souches prélevées sur un même site, ou sur plusieurs sites de production. Déterminer l origine d une contamination comparaison des profils des souches isolées sur un même site pendant une période de crise outil complémentaire à la démarche HACCP Evaluation du risque Contrôle qualité

55 Recherche de l origine de la contamination d un produit fini Les tests de routine sur les produits finis montrent une contamination Staphylococcus spp. Des investigations sont réalisées à l aide du Riboprinter sur les échantillons suivants : Produits finis environnement Matières premières personnel Appareillages Staphylococcus epidermidis est isolé du produit fini, des matières premières et des mains du personnel.

56 Recherche de l origine de la contamination d un produit fini Staphylococcus epidermidis est isolé du produit fini, des matières premières et des mains du personnel. S. epidermidis (mains du personnel) S. epidermidis (matières premières) S. epidermidis (produits finis)

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