Séquençage de l ADN: les premiers pas. Francis Galibert 19 janvier 2012

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1 Séquençage de l ADN: les premiers pas Francis Galibert 19 janvier 2012

2 Comment séquencer une macromolecule?

3 Une macromolécule résulte de l enchaînement de sous-unités: AA, nucleotides,oses La stratégie commune consiste à réduire sa complexité par hydrolyse enzymatique Reconstruction du puzzle «The general approach used in these studies, and in those on proteins, depended on the principle of partial degradation. The large molecules were broken down, usually by suitable enzymes, to give smaller products which were then separated from each other and their sequence determined. When sufficient results had been obtained they were fitted together by a process of deduction to give the complete sequence» Fred Sanger Nobel Prize lecture 1980

4 Dans les années 50 Frédérick SANGER et les protéines L insuline a été choisie comme modèle pour le développement d une méthode 2 chaînes de petite taille (32 et 20 aa) 1 enzyme spécifique: Trypsine (Lys-N or Arg-N) Prix Nobel de chimie en 1958

5 Dans les années 60: Holley, Sanger et le RNA Isolement et purification d un petit RNA, Ala trna par contre-courant. Isolement et purification de l ARN 5s par chromatographie sur gel d agarose

6 Rnase T1 cleaves after G Rnase U2 cleaves after G and A Rnase pancreatic cleaves after C and U NaOH cleaves after A,G, C, U AUAACGAGUCCAAUGAU T1 => AUAACG AG UCCAAUG AU U2 => AUAACG P => AUAACG Base composition

7 STRUCTURE OF A RIBONUCLEIC ACID Holley RW et al. Science 1965 Mar 19;147(3664): The complete nucleotide sequence of an alanine transfer RNA Robert Holley, Prix Nobel de Médecine 1968 Nucleotide Sequences from the low molecular weight ribosomal RNA of Escherichia coli Brownlee GG, Sanger F. J. Mol Biol Feb 14;23(3):

8 La dépurination chimique Tamm, Hodes & Chargaff J.Biol. Chem A C C T T C A A A A G T T T C T A G 2 C C T T C T T T C T 3 pc C T T Cp pt T T C Tp

9 Burton & Pedersen Biochem.J ADN de thymus de veau Dépurination Fractionnement en chromatographie 2D Détection des spots en UV Analyse de quelques di et trinucléotides pyrimidiques

10 In the 70 s No DNA and no Enzyme «In spite of the important role played by DNA sequences in living matter, it is only relatively recently that general methods for their determination have been developed. This is mainly because of the very large size of DNA molecules, the smallest being those of the simple bacteriophages such as qxl74 (which contains about 5,000 nucleotides). It was therefore difficult to develop methods with such complicated systems» Fred Sanger lecture Prix Nobel 1980 Ionophorèse Homochromatographie

11 Vic Ling Fractionation and sequences of the large pyrimidine oligonucleotides J Mol Biol Feb 28;64(1):

12 Vic Ling PNAS 1972

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14 L enzyme Endo IV nuclease préfère: (Sadowski & Babika J.Biol.Chem. 1972) L ADN monobrin et les liaisons NpC 5 NpCpNpNpNpCpNpNpNpCpNpNpNpNpNpNpCpNpNp 3 pcpnpnpnpcpnpnpnoh pcpnpnpnpnpnpnoh pcpnpnpnpcpnpnpnpnpnpnoh

15 Digestion partielle endo IV de Phi174 From Ziff, Sedat & Galibert, Nature New Biology 1973, 241, 34-37

16 Hydrolyse totale EndoIV Depurination acide From Ziff et al. 1973

17 Comment déterminer la séquence d un déoxy-oligonucleotide?

18 Séquençage d un Endo IV oligonucleotide 5 CpCpTpApApGpCpTpTpApApCp 3 (1) Phosphatase alcaline, (2) Hydrolyse partielle par SPD, (3) EXO1 CpCpTpApApGpCpTpTpApApCoH CpTpApApGpCpTpTpApApCoH TpApApGpCpTpTpApApCoH ApApGpCpTpTpApApCoH CpC CpT TpA ApA SPD Cp Cp Tp Ap SVP pc pt pa pa

19 Séquençage par SVP (ou par SPD) A G C T

20 2D fingerprints Produits de dépurination de larges endo IV oligonucléotides

21 Spot # Analytical procedure Results 2 Depurination pcp, pttp, (ptcp), ptoh Partial SPD 2D Exo1, SPD, SVP Partial SVP 2D Base comp. CAGATTGGTC (CA 2 GT)TGGTCGT Deduced sequence pcagattggtcgtoh

22 Reconstitution de la séquence d un fragment complet à partir du recouvrement partiel des oligonucléotides obtenus par digestion avec Endo IV Band 8 Band 7 Spot 13 Spot 10 Spot 14 Spot 1a Spot 1b Spot Spot 8 Spot 11 Spot 29 Spot 7b Spot 12 Spot 23 Spot 13b Spot 7a Spot 14 Spot 35 Spot 13a Spot 10 Band 6 Spot 24

23 Determination of the nucleotide sequence of a fragment of bacteriophage phix 174 DNA. Ziff EB, Sedat JW, Galibert F. Nat New Biol Jan 10;241(106): nt Direct determination of DNA nucleotide sequences. Structure of large specific fragments of bacteriophage phix174 DNA. Sedat J, Ziff E, Galibert F.J Mol Biol Nov 15;107(4): >500 nt

24 Les ribosomes E.coli se fixent spécifiquement sur l ADN de PhiX et le protège de l hydrolyse par la Dnase pancréatique Robertson, H. D., Barrell, B. G., Weith, H. L. & Donelson, J. E., Nature, New Biol. 2441, 38 (1973)

25 Cercle infernal brisé mais à quel prix!!!!

26 Autre approche pour obtenir des fragments d ADN La replication Template 3 T p A p G p C p C p T p A p C p T p T p Gp Primer 5 T p C p G p G p AOH + 4 nucleotide triphosphates dont l un est marqué au 32 P en position α + DNA polymerase Template 3 T p A p G p C p C p T p A p C p T p T p Gp Primer 5 T p C p G p G p A p T p G p A p A p COH

27 La séquence Trp-Met-Val en positions de la protéine majeure d enveloppe du phage f1 permet de prévoir la séquence 5 TGGATGGT(N)3 sur le brin sens et donc celle du primer: 5 ACCATCCA3 et de procéder à une élongation en présence des 4NTP 3 Primer ADN

28 Ribosubstitution Phage f1: Single Strand DNA Coat protein: Trp - Met - val TGG,ATG,GT primer 8 nt A: élongation aléatoire B: élongation contrainte 1/ 3 nucleotides + ribog / Klenow fragment Rnase T1 Oligo 2/ 3 nucleotides + riboc / Klenow frament Rnase pancréatique 3) Idem avec ribo A + U2 Overlap

29 Use of DNA Polymerase I primed by a synthetic Oligonucleotide to determine a nucleotide sequence in Phage F1 DNA Sanger, Donelson, Coulson, Kossel, Fischer PNAS

30 Plus / Minus ADN ADN + 4 dntp ADN ADN - G AGCTTGCTGGAACCTAC TCGA AGCTTGCTGGAACCTAC TCGAA AGCTTGCTGGAACCTAC TCGAACGACCTT AGCTTGCTGGAACCTAC TCGAACGACCTTGG

31 Plus / Minus ADN ADN + 4 dntp ADN ADN + A AGCTTTTGCTGGAACCTAC TCG AGCTTTTGCTGGAACCTAC TCGAAAA AGCTTTGCTGGAACTAC TCGAAACGACCTT AGCTTTGCTGGAACCTAC TCGAAACGA

32 Plus / Minus ADN ADN + 4 dntp ADN ADN - A AGCTTTTGCTGGAACCTAC TCGAA AGCTTTTGCTGGAACCTAC TCG AGCTTTTGCTGGAACTAC TCGAAAACGACCTT AGCTTTTGCTGGAACCTAC TCGAAAACGACCTTGG

33 ACTAAGCTTTTTTTTACGTACCG TGATTCGAAA -A ACTAAGCTTTTTTTTACGTACCG TGATTCG -G ACTAAGCTTTTTTTTACGTACCG TGATTCGAAAAAAAAT +A ACTAAGCTTTTTTTTACGTACCG TGATTCGAAAAAAAA +G ACTAAGCTTTTTTTTACGTACCG TGATTCG -C +C ACTAAGCTTTTTTTTACGTACCG TGATTCGAAAAAAAATG ACTAAGCTTTTTTTTACGTACCG TGATTC -T +T ACTAAGCTTTTTTTTACGTACCG TGATTCGAAAAAAAA ACTAAGCTTTTTTTTACGTACCG TGATT

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35 Nucleotide sequence of PhiX 174 DNA Sanger F, Air GM, Barrell BG, Brown NL, Coulson AR, Fiddes JC, Hutchison CA III, Slocombe PM, Smith M. Nature 1977, 265, /- nt

36 B B B I I I ribo dx ddx

37 ddx Pol dntp + datp 32 + ddg, 4dNTP + dda, 4dNTP CCGTACAAGCGC GG GGCATG GGCATGTTCGCG CCGTACAAGCGCT GGCA GGCATGTTCGCGA + ddc,4dntp CCGTACAAGCGC GGC GGCTAGTTC GGCTAGTTCGC + ddt, 4dNTP CCGTACAAGCGC GGCATCT GGCATCTT GGCT GGCTACT

38 DNA sequencing with chain terminating inhibitors. Sanger, Nicklen, Coulson

39 The Nucleotide Sequence of the lac Operator WALTER GILBERT AND ALLAN MAXAM PNAS Aug. 9, 1973 ABSTRACT The lac repressor protects the lac operator against digestion with deoxyribonuclease. The protected fragment is double-stranded and about 27 base-pairs long. We determined the sequence of RNA transcription copies of this fragment and present a sequence for 24 base pairs. It is: 5'--TGGAATTGTGAGCGGATAACAATT 3' 3'--ACCTTAACACTCGCCTATTGTTAA 5'

40 La methode des dégradations chimiques

41 Le Concept 1) Modification chimique des bases 2) Elimination des bases modifiées H H H $$ 3) Rupture spécifique des liaisons phosphates adjacentes

42 Préparation d un fragment à séquencer Déphosphorylation et marquage P P Séparation des 2 extrémités marquées P P

43 Préparation d un fragment d ADN en vue de son séquençage 1) Hydrolyse par ER 2) Déphosphorylation 3) Marquage en 5 4) Fractionnement et purification 5) Récupération 6) Séparation des 2 brins ou des 2 extrémités 5

44 P P P P Traitement chimique spécifique P P P P A>G DMS ph 7 A<G DMS ph 1 G DMS/piperidine C>T Hydrazine C Hydra/NaCl C/T depurination

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46 Les Enzymes de Restriction I I I I I I I I I I I I I

47 J. Messing et les vecteurs de clonage (1) Proc Natl Acad Sci U S A Sep;74(9): Filamentous coliphage M13 as a cloning vehicle: insertion of a HindII fragment of the lac regulatory region in M13 replicative form in vitro. Messing J, Gronenborn B, Muller-Hill B, Hans Hopschneider P. A HindII restriction fragment comprising the Escherichia coli lac regulatory region and the genetic information for the alpha peptide of beta-galactosidase has been inserted into 1 of the 10 Bsu I cleavage sites of M13 by blunt end ligation. A stable hybrid phage was isolated and identified by its ability to complement the lac alpha function.

48 J.Messing et les vecteurs de clonage (2) Gene Jun;10(1): A versatile primer for DNA sequencing in the M13mp2 cloning system. Heidecker G, Messing J, Gronenborn B. AAACAGCT ATG ACC ATG ATT ACG AAT TCA CTG GCG Met Thr Met Ile Thr Asn Ser Leu Ala

49 R.Staden A strategy of DNA sequencing employing computer programs Nucleic Acid Res ,

50 En dépit de progrès remarquables Sur le plan technique gels, réactifs, PCR, informatique oligonucléotides de synthèse etc

51 Sur le plan de la connaissance Gènes imbriqués (1978) Séquence Hbv (1979) Code génétique non universel (1982) etc La communauté scientifique française reste très en arrière et dans l ensemble peu convaincue de l intérêt d investir dans cette méthodologie

52 Le CEPH Le Centre d Etude du Polymorphisme Humain a été créé par Jean Dausset et Daniel Cohen en 1984 L AFM et Bernard Barataud 1er Téléthon 1987 Le CEPH et l AFM créent le Génethon en 1991

53 Le GREG Groupement d Intérêt Public (GIP) intitulé «Groupement de Recherches et d Etudes sur les Génomes» (GREG) a été créé initialement pour six ans,par un arrêté du 25 janvier 1993 du Ministère de la Reherche et sa direction confiée à Piotr Slonimski. A la suite d un changement de gouvernement, un nouvel arrêté, en date du 29 octobre 1996, abroge le précédent et met fin au GREG. En fait, dès 1995, ses crédits sont fortement diminués et aucun financement ne lui est accordé en Raisons invoquées: pas d intérêt selon certains pas assez humain selon d autres Le Centre de Séquençage Proposition à usage ministériel de la création d un centre de séquençage en 1993, création en 1997 avec l aide de l AFM

54 Quelques réflexions en guise de conclusion

55 Quelques réflexions en guise de conclusion La technologie n est pas prisée en France

56 Quelques réflexions en guise de conclusion La technologie n est pas prisée en France Discordance entre les capacités techniques et la demande biologique

57 Quelques réflexions en guise de conclusion La technologie n est pas prisée en France Discordance entre les capacités techniques et la demande biologique Le financement

58 MERCI

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