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3 Table des matières 1. Contenu Stockage Matériel nécessaire et non fourni Précautions générales Informations générales Principe du procédé du test Description du produit Protocole Extraction de l ADN Préparation de la PCR Programmation du système LightCycler Interprétation Aide au dépannage Spécifications Sensibilité analytique Spécificité Sensibilité et spécificité diagnostiques Remarques particulières concernant l utilisation du produit Informations de sécurité Contrôle qualité Références bibliographiques Explication des symboles artus MTHFR LC PCR Kit 06/2007 3

4 artus MTHFR LC PCR Kit * Pour une utilisation avec le système LightCycler. 1. Contenu Étiquetage et contenu Réf réactions Réf réactions Bleu MTHFR LC Master 2 x 12 rxns 8 x 12 rxns Rouge MTHFR LC Control 1 x 200 µl 1 x 200 µl Blanc Water (PCR grade) 1 x µl 1 x µl 2. Stockage Les composants de l artus MTHFR LC PCR Kit doivent être stockés à -20 C et peuvent être utilisés jusqu à la date de péremption indiquée sur l étiquette. Éviter de répéter les étapes de congélation/décongélation (> 2 x) qui pourraient réduire la sensibilité. En cas d utilisation occasionnelle, répartir les réactifs en aliquotes. Si les composants doivent être stockés à +4 C, la période de stockage ne doit pas dépasser cinq heures. 3. Matériel nécessaire et non fourni Gants de laboratoire sans talc Kit d extraction d ADN (voir 8.1 Extraction de l ADN) Pipettes (réglables) Pointes de pipette stériles avec filtre Mixeur Vortex Micro-centrifugeuse avec rotor pour tubes de réaction de 2 ml Color Compensation Set (Roche Diagnostics, (réf. cat ) pour la création d un fichier Crosstalk Color Compensation Capillaires LightCycler (20 µl) * MTHFR = Méthylènetétrahydrofolate réductase. 4 artus MTHFR LC PCR Kit 06/2007

5 «Cooling Block» LightCycler Système LightCycler «Capping Tool» LightCycler 4. Précautions générales L utilisateur doit toujours respecter les mesures suivantes : Utiliser des pointes de pipette stériles avec filtre. Conserver et purifier les éléments positifs (échantillons, contrôles, amplicons) séparément des autres réactifs et les ajouter au mélange réactionnel dans une autre pièce. Décongeler complètement tous les composants à température ambiante avant le début du test. Mélanger ensuite soigneusement les composants et les centrifuger brièvement. Toujours travailler dans de la glace ou dans le «Cooling Block» LightCycler. 5. Informations générales Plusieurs facteurs tels que l âge, le sexe, l alimentation, les interactions entre médicaments et en particulier les facteurs génétiques peuvent influencer l activité enzymatique. On sait que les patients avec une activité de l enzyme méthylène tétrahydrofolate réductase (MTHFR) génétiquement modifiée présentent sous thérapie à base de méthotrexate une incidence plus élevée d apparitions d effets secondaires (p.ex. altérations graves du bilan sanguin, mucite, hyperhomocystéinémie). Le méthotrexate est un antagoniste de l acide folique et est employé entre autres au cours de thérapies de l arthrite rhumatismale et de maladies tumorales. Une analyse du gène MTHFR permet d estimer les risques d origine génétique d effets secondaires induits par une thérapie. Les porteurs d un variant génétique du gène MTHFR peuvent donc être identifiés avant le début d une thérapie et si nécessaire, suivre un traitement alternatif ou à dose réduite. artus MTHFR LC PCR Kit 06/2007 5

6 L activité enzymatique de méthylène tétrahydrofolate réductase est déterminée entre autres par des altérations du gène MTHFR. Des altérations génétiques peuvent engendrer par exemple un échange d acides aminés. La conformation ainsi modifiée de l enzyme a des conséquences sur l activité enzymatique. Les variants génétiques les plus fréquents du gène MTHFR concernent les nucléotides nt 677 et nt D autres variants génétiques sont rapportés dans la documentation, mais qui n ont été observés que rarement, voire une seule fois dans une population. L enzyme MTHFR est un des acteurs principaux dans le métabolisme de l acide folique. Une activitié déficitaire de l enzyme aura des conséquences sur la synthèse de méthionine à partir de l homocystéine. Un enrichissement en homocystéine pouvant provoquer plusieurs maladies (thrombose, artériosclérose), la présence d un variant génétique du gène MTHFR représente un risque plus élevé d apparition de ces maladies. Le génotypage permet une sélection optimale d une thérapie individuelle par médication, une réduction des coûts occasionnés par des effets secondaires indésirables (séjour hospitalier prolongé, etc.) ou une identification précoce d un risque d origine génétique d une hyperhomocystéinémie. 6. Principe du procédé du test Lors du diagnostic génétique par amplification en chaîne par polymérase (PCR), des régions spécifiques du génome humain sont amplifiées. La détection a lieu à l aide de marqueurs fluorescents au cours de la PCR en temps réel. Ceux-ci sont généralement couplés à des sondes oligonucléotidiques, qui se lient spécifiquement à l amplicon de la PCR. L analyse de la courbe de fusion immédiatement après l amplification de la PCR permet l identification et la différenciation des variants génétiques. Une ré-ouverture des tubes d échantillons après la PCR n étant plus nécessaire, le risque de contamination est réduit de manière significative. (Mackay, 2004). 6 artus MTHFR LC PCR Kit 06/2007

7 7. Description du produit Une analyse de l ADN humain peut être effectuée de manière simple, rapide et fiable à l aide de l artus MTHFR LC PCR Kit pour le dépistage de variants génétiques cliniquement importants du gène MTHFR. Cette analyse permet une estimation des risques induits par une thérapie, p.ex. un traitement au methothrexat. L analyse est effectuée par la détection des variants génétiques du gènes MTHFR avec le système LightCycler. Les réactifs contiennent les sondes nécessaires à l amplification d une séquence du gène humain MTHFR ainsi que des sondes fluorescentes pour la détection des variants génétiques aux positions nucléotidiques nt 677C>T et nt 1298A>C. De plus, un contrôle positif est fourni pour contrôler la réaction dans une série indépendante. Le test étant basé sur l amplification d ADN génomique humain, les signaux de fluorescence de la courbe de fusion doivent pouvoir être identifiés indépendamment de la présence d un variant allélique. Le cas contraire met en évidence une extraction inefficace de l ADN ou une inhibition de la PCR. Un contrôle interne additionnel n est pas nécessaire avec ce test génétique. Attention : Les signaux de l analyse de la courbe de fusion sont décisifs pour l interprétation. Lors de l emploi de l artus MTHFR LC PCR Kit, aucune amplification quantitative au cours des séries sur le système LightCycler n est généralement observée. Ceci n a aucune influence sur l analyse de la courbe de fusion. artus MTHFR LC PCR Kit 06/2007 7

8 8. Protocole 8.1 Extraction de l ADN Différents fabricants proposent des kits d extraction d ADN à partir de sang. Procéder à l extraction d ADN conformément aux instructions, tel que le préconise le fabricant, en utilisant la quantité indiquée d échantillon. Le kit d extraction suivant est recommandé : Échantillon sang Kit d extraction QIAamp DNA Blood Mini Kit (50) Référence du catalogue Fabricant QIAGEN L artus MTHFR LC PCR Kit ne convient pas aux procédés d extraction à base de phénol. Dans le cas d extractions utilisant des tampons de lavage contenant de l éthanol, s assurer impérativement qu une étape de centrifugation supplémentaire (trois minutes, tr/min) est exécutée avant l élution pour éliminer les résidus d éthanol. Cela permet de prévenir d éventuelles inhibitions de la PCR. 8.2 Préparation de la PCR S assurer que le «Cooling Block» et les adaptateurs qu il contient (accessoires du système LightCycler ) sont refroidis à +4 C. Placer le nombre de capillaires LightCycler nécessaires pour le nombre de réactions prévues dans l adaptateur du «Cooling Block». Avant le début du test, décongeler complètement tous les réactifs à température ambiante, bien les mélanger (aspirer et rejeter plusieurs fois à l aide de la pipette ou vortexer brièvement) et immédiatement après les centrifuger brièvement. S assurer qu un contrôle positif (MTHFR LC Control) et un contrôle négatif (Water, PCR grade) fournis avec l artus MTHFR LC PCR Kit sont exécutés parallèlement à chaque série de PCR. 8 artus MTHFR LC PCR Kit 06/2007

9 Pour préparer les réactions PCR, utiliser le tableau de pipetage suivant (voir également la représentation schématique à la Fig. 1) : Préparation de la réaction PCR Nombre d échantillons 1 MTHFR LC Master 18 µl Échantillon 2 µl Volume total 20 µl Pipeter 18 µl de MTHFR LC Master dans le réservoir en plastique de chaque capillaire. Ajouter ensuite 2 µl de l éluat d extrait d ADN. De la même manière, utiliser 2 µl de MTHFR LC Control comme contrôle positif et 2 µl d eau pour contrôle négatif (Water, PCR grade). Fermer les capillaires. Pour transférer le mélange du réservoir en plastique aux capillaires, centrifuger les adaptateurs contenant les capillaires dans une micro-centrifugeuse pendant dix secondes à 400 x g (2 000 tr/min) maximum. Attention : La mise en place du bouchon sur les capillaires doit avoir lieu avec le «Capping Tool» de LightCycler afin d éviter tout risque de contamination. artus MTHFR LC PCR Kit 06/2007 9

10 Préparation de la PCR Fig. 1 : Schéma de procédure. * A chaque pipetage, s assurer impérativement que les solutions à utiliser sont complètement décongelées, bien mélangées et brièvement centrifugées. 10 artus MTHFR LC PCR Kit 06/2007

11 8.3 Programmation du système LightCycler Pour détecter l ADN de variants génétiques du gène MTHFR, créer un profil de thermocyclage sur votre système LightCycler, conformément aux cinq étapes suivantes (voir Fig. 2-6). A. Activation initiale de l'enzyme «Hot Start» Fig. 2 B. Étape «Touch Down» Fig. 3 C. Amplification de l'adn Fig. 4 D. Courbe de fusion Fig. 5 E. Refroidissement Fig. 6 Bien tenir compte des paramètres pour Analysis Mode, Cycle Program Data et Temperature Targets. Pour plus de clarté, les paramétrages à effectuer sont encadrés en noir dans les figures. Pour plus de détails sur la programmation du système LightCycler, se reporter au guide LightCycler Operator s Manual. Fig. 2 : Activation initiale de l'enzyme «Hot Start». artus MTHFR LC PCR Kit 06/

12 Fig. 3 : Étape «Touch Down». Fig. 4 : Amplification de l'adn. 12 artus MTHFR LC PCR Kit 06/2007

13 Fig. 5 : Courbe de fusion. Fig. 6 : Refroidissement. artus MTHFR LC PCR Kit 06/

14 9. Interprétation Lors d analyses multi-couleurs, il peut y avoir des interférences entre les canaux de fluorimétrie. Le logiciel du système LightCycler comprend un fichier appelé Color Compensation File qui compense ces interférences. Ouvrir ce fichier avant, pendant ou à l issue de la série de PCR, en activant l onglet Choose CCC File ou Select CC Data. Si aucun fichier Color Compensation File n est installé, créer le fichier en respectant les instructions du guide LightCycler Operator s Manual. Une fois le fichier Color Compensation File activé, des signaux apparaissent séparément dans les canaux de fluorimétrie F1, F2 et F3. Pour interpréter les résultats de la PCR obtenus avec l artus MTHFR LC PCR Kit, sélectionner les fonctions d affichage F2/Back-F1 et F3/Back-F1pour la PCR analytique de MTHFR. Lors de l emploi de l artus MTHFR LC PCR Kit, aucune amplification quantitative au cours des séries sur le système LightCycler généralement observé. n est Les composants de l artus MTHFR LC PCR Kit permettent la détection de deux variants génétiques (type sauvage (wildtyp) = wt ; variant = var) aux positions nucléotidiques nt 677 et nt 1298 du gène MTHFR. La détermination des variants génétiques a lieu à l aide du programme Melting Curve. Dans l analyse de la courbe de fusion, les points de fusion aux températures indiquées dans le tableau suivant démontrent la présence d un type sauvage ou de variants génétiques. En cas d hétérozygotie, la courbe présente deux sommets. Tableau 1: Points de fusion pour le type sauvage (wt) ou les variants génétiques (var). Canal F2 Canal F3 nt wt var nt wt var C 53 C C 57 C Remarquer bien que les points de fusion peuvent varier de ± 2 C des températures données. Pour une meilleure visualisation de l analyse de la courbe de fusion, il est recommandé dans plusieurs cas de désactiver le Digital Filter. 14 artus MTHFR LC PCR Kit 06/2007

15 Les figures suivantes (voir Fig. 7 et Fig. 8) illustrent l analyse de la courbe de fusion pour la détection de polymorphismes aux positions nucléotidiques nt 677 et nt 1298 sous la forme homozygote type sauvage ainsi que les formes altérées hétérozygote et homozygote. Fig. 7: Analyse de la courbe de fusion pour la détection des échanges nucléotidiques nt 677 dans le canal de fluorimétrie F2/Back-F1 à l aide de l artus MTHFR LC PCR Kits. NTC: non-template control (contrôle négatif). Fig. 8: Analyse de la courbe de fusion pour la détection des échanges nucléotidiques nt 1298 dans le canal de fluorimétrie F3/Back-F1 à l aide de l artus MTHFR LC PCR Kits. NTC: non-template control (contrôle négatif). artus MTHFR LC PCR Kit 06/

16 Le génotypage peut être déterminé par la combinaison des variants alléliques. Bien noter qu en cas de présence de deux variants hétérozygotes, ceux-ci peuvent être situés sur le même allèle ou sur deux allèles différents. Jusqu à ce jour, on ne retrouve dans la documentation aucun cas d une présence simultanée de deux variants génétiques sous la forme homozygote. Dans tous les cas, un déficit de l activité enzymatique de la MTHFR peut être anticipé en présence d au moins un des variants génétiques. Une activité enzymatique normale est anticipée chez les porteurs de deux allèles type sauvage, à condition qu elle ne soit influencée par aucun autre facteur non-génétique. Un déficit de l activité enzymatique est anticipé chez les porteurs d au moins un allèle altéré génétiquement (MTHFR wt677/var677, wt1298/var1298). Si les deux allèles sont concernés, le risque d effets secondaires génétiquement induits est accru. Les différents génotypes possibles proviennent des combinaisons d allèles décrits précédemment. Ils sont énumérés dans le tableau suivant (voir Tableau 2). Tableau 2: Influence du génotype sur l activité enzymatique. Génotype homozygote Wildtyp MTHFR wt677/wt677 wt1298/wt1298 Activité enzymatique normale Génotype hétérozygote variants MTHFR wt677/var677 wt1298/wt1298 MTHFR wt677/wt677 wt1298/var1298 MTHFR wt677/var677 wt1298/var1298 Génotype homozygote variants MTHFR var677/var677 wt1298/wt1298 MTHFR wt677/wt677 var1298/var1298 Activité enzymatique déficitaire Les contrôles positifs (MTHFR LC Control) fournis avec l artus MTHFR LC PCR Kit représentent une forme allèlique hétérozygote (voir Fig. 7 et Fig. 8). 16 artus MTHFR LC PCR Kit 06/2007

17 10. Aide au dépannage Aucun signal pour les contrôles positifs (MTHFR LC Control) dans le canal de fluorimétrie F2/Back-F1 ou F3/Back-F1 : Il y a une erreur de programmation du thermocyclage du système LightCycler. Comparer le profil de thermocyclage avec les directives du protocole (voir 8.3 Programmation du système LightCycler ). Il y a une erreur de composition de la réaction PCR. Vérifier les étapes de pipetage à l aide du schéma de pipetage (voir 8.2 Préparation de la PCR) et si nécessaire, répéter la PCR. Les conditions de stockage d un ou plusieurs composants du kit ne sont pas conformes aux directives précisées en 2. Stockage ou la date de péremption de l artus MTHFR LC PCR Kit a été dépassée. Vérifier aussi bien les conditions de stockage que la date de péremption des réactifs (voir l étiquette du kit) et si nécessaire, employer un nouveau kit. Il y a eu inhibition de la PCR. S assurer que l un des kits d extraction recommandés (voir 8.1 Extraction de l ADN) est utilisé et respecter scrupuleusement les instructions du fabricant. S assurer que lors de l extraction d ADN, l étape de centrifugation supplémentaire recommandée est effectuée avant l élution pour éliminer complètement les résidus d éthanol (voir 8.1 Extraction de l ADN). Il y a eu perte d ADN lors de l extraction. S assurer que l un des kits d extraction recommandés (voir 8.1 Extraction de l ADN) est utilisé et respecter scrupuleusement les instructions du fabricant. Faible pic de fluorescence Bien mélanger les composants avant de les employer. Vérifier les conditions d amplification. Refroidir le «Cooling Block» avec les adapteurs à +4 C. artus MTHFR LC PCR Kit 06/

18 Refroidir tous les composants réactifs pendant le pipetage. Pour toute autre question ou en cas de problèmes, merci de contacter notre service technique. 11. Spécifications 11.1 Sensibilité analytique L artus MTHFR LC PCR Kit permet la détection de la constitution génétique individuelle en ce qui concerne les variants génétiques nt 677 et nt 1298 du gène humain MTHFR à l aide de la technologie LightCycler. L ADN génomique humain fut extrait à partir d échantillons sanguins, quantifié avec le spectrophotomètre et soumis à une série de dilutions. Une quantité minimale de 0,12 ng d ADN génomique (20 copies) par PCR suffit pour détecter les variants génétiques (ceci correspond à 0,005 0,02 µl de sang, selon les donneurs et l extraction) Spécificité La spécificité de l artus MTHFR LC PCR Kit est garantie en premier lieu par la sélection des amorces et des sondes ainsi que des conditions de réaction des plus strictes. Une analyse par comparaison de séquences des amorces et des sondes a été effectuée afin de rechercher d éventuelles homologies avec toutes les séquences représentées dans les banques génétiques. De plus, la spécificité pour la détection de ce polymorphisme génétique a été garantie par un séquençage de chacun des variants alléliques et par une comparaison de séquences avec les banques de données internationales Sensibilité et spécificité diagnostiques L analyse de 300 échantillons d ADN avec les composants du kit a confirmé la fréquence de polymorphisme dans la population caucasienne, tel que mentionné par Botto & Yang (2000). 18 artus MTHFR LC PCR Kit 06/2007

19 12. Remarques particulières concernant l utilisation du produit Tous les réactifs doivent être utilisés exclusivement pour le diagnostic in vitro. L utilisation est réservée aux personnes spécialement formées aux procédés de diagnostic in vitro (EN375). Le protocole doit impérativement être respecté scrupuleusement, afin d optimiser les résultats PCR. Respecter les dates de péremption figurant sur l emballage et les étiquettes des différents composants. Ne pas utiliser les réactifs dont la date de péremption est dépassée. 13. Informations de sécurité Pour obtenir des informations relatives à la sécurité de l artus MTHFR LC PCR Kit, consulter la fiche de données de sécurité correspondante (material safety data sheets, MSDS), disponible sur notre site Internet au format PDF, un format compact et convivial. 14. Contrôle qualité En accord avec le système de gestion de la qualité de QIAGEN certifié ISO 9001 et ISO 13485, chaque lot de l artus MTHFR LC PCR Kit a été testé conformément aux spécifications prédéterminées afin d assurer une qualité constante du produit. artus MTHFR LC PCR Kit 06/

20 15. Références bibliographiques (1) Botto LD, Yang Q. 5,10-Methylenetetrahydrofolate reductase gene variants and congenital anomalies: a HuGE review. Am J Epidemiol May 1; 151 (9): (2) Junker R, Nowak-Göötl U, Fobker M. The methylenetetrahydrofolate reductase (MTHFR) C677T polymorphism and other genetic causes of hyperhomocysteinemia in venous thrombosis. J Lab Med. 2001; 25 (7/8): (3) Kang SS, Wong PW, Susmano A, Sora J, Norusis M, Ruggie N. Thermolabile methylenetetrahydrofolate reductase: an inherited risk factor for coronary artery disease. Am J Hum Genet Mar; 48 (3): (4) Mackay IM. Real-time PCR in the microbiology laboratory. Clin. Microbiol. Infect. 2004; 10 (3): (5) Toffoli G, Veronesi A, Boiocchi M, Crivellari D. MTHFR gene polymorphism and severe toxicity during adjuvant treatment of early breast cancer with cyclophosphamide, methotrexate, and fluorouracil (CMF). Ann Oncol Mar; 11 (3): artus MTHFR LC PCR Kit 06/2007

21 16. Explication des symboles Utiliser jusque Code du lot Fabricant Référence du catalogue Référence du matériel Manuel Dispositif médical de diagnostic in vitro <N> Kit contient des réactifs pour <N> tests Limites de température artus MTHFR LC PCR Kit 06/

22 22 artus MTHFR LC PCR Kit 06/2007

23 artus MTHFR LC PCR Kit 06/

24 7HI$AJ K $5 K K 4@3$3(B@3$ @$8 K F)6,EK.F(8..L K 4333(B3336 < 333 " *+,-./2$14 K 433(B336 < 33 "! # &- 'A5 K 433(B336 $# (6I++3'9 <4M8 <! 8 <3M'6M3 6:<3$3@(B3$3@@6 < 3$3@!% & - I@@1! 0 <M K 4333(B3336 < 333 '! $607& 8, K 4@33@$(B@3$@36 $()$