Les vecteurs rétroviraux du transfert de gènes. Critères de choix: Les outils du transfert de gènes. L intérêt du transfert de gènes

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1 Les vecteurs rétroviraux du transfert de gènes L intérêt du transfert de gènes Recherche fondamentale Compréhension de la fonction d un gène : gain ou perte de fonction dérégulation du gène piégeage de gènes Anne Dubart-Kupperschmitt, Institut Cochin, Département d'hématologie Maternité de Port-Royal, 5e étage 123 Bd du Port-Royal, PARIS tel: (0) fax: (0) mel: dubart@cochin.inserm.fr Applications cliniques : la thérapie génique Maladies: héréditaires infectieuses (SIDA) acquises (cancer) Les outils du transfert de gènes Vecteurs non viraux - Électroporation - Liposomes Vecteurs viraux - Adénovirus - Virus associés aux adénovirus - Rétrovirus - Oncorétrovirus (Type Moloney) - Lentivirus (Type VIH) Critères de choix: Expression du transgène Transgène Toxicité pour les cellules Taille de l ADNc Spécifique de tissu Court/ Long terme Permanente Transitoire régulation Vecteur Non-viral Viral Physique Chimique Gène endogène Nouveau gène régulation Cible cellulaire Cellules en division ou non Voie d administration Quantité de cellules Type de cellules Efficacité Vecteur Promoteur Mode d administration Transgène In vivo Intra-veineuse Locale Ex vivo In vitro Voie d administration Réponse immune Fonction cellulaire Anti-oncogène Anti-infection Études in vitro Pour l environnement Pour les cellules Pour le patient Problèmes de sécurité Effet recherché Spécificité de lignée Niveau d expression Durée d expression Promoteur Figure 4 : Facteurs gouvernant le choix du vecteur, du transgène, du promoteur et du mode d administration 1

2 Les vecteurs viraux/non viraux Les adénovirus Viraux Non viraux Efficacité +++ ± Capacité de Limitée Illimitée transport Sécurité + à d utilisation Stabilité d expression +++ ± - Virus non enveloppés très immunogènes - Génome ADN linéaire double brin très grand ( 40 kb) - Interagit avec les MHC classe I, le récepteur CAR et des intégrines puis est endocyté. - Pas d intégration du virus dans le génome cellulaire Les rétrovirus Caractéristiques communes - Virus enveloppés - Génome : un dimère d ARN simple brin codant - Transcription inverse - Intégration du provirus dans le génome cellulaire Deux sous-familles - Oncorétrovirus (Type virus de Moloney) Os Moëlle osseuse La cellule souche hématopoïétique CSH Progéniteurs Plaquettes - Lentivirus (Type VIH-1) Autres sources: Sang de cordon Cellules mobilisées Globules rouges Lymphocytes Granuleux 2

3 L'hématopoïèse Cellules souches hématopoïétiques CSH progéniteurs précurseurs et cellules matures Les contraintes du transfert de gènes dans les CSH Cellules souches Progéniteur Myélo-érythroïde CFU-GEMM Rareté des cellules cibles Stratégie de transfert de gènes efficace Utilisation de vecteurs viraux Moelle osseuse Thymus Progéniteur lymphoïde sang Tissu périphérique Pérennité du transgène dans les cellules hématopoïétiques Nécessité d une intégration stable du transgène Utilisation de vecteurs dérivés des rétrovirus Cycle réplicatif des rétrovirus Les vecteurs Les oncorétrovirus oncorétroviraux pour le transfert de gènes dans les CSH Maturation Fusion Transcription inverse Traduction Relargage Reconnaissance du récepteur Intégration Transcription Assemblage et bourgeonnement Ψ gag Gène pol thérapeutique env LTR 5' LTR 3' 3

4 Production de vecteurs oncorétroviraux L'hématopoïèse Plasmide GAG/POL Plasmide ENV Transfection transitoire Plasmide vecteur Maturation Globules rouges Plaquettes Granulocytes Traduction Relargage Cellule souche Hématopoïétique (CSH) Monocytes Lymphocytes B Transcription Assemblage et bourgeonnement Lymphocytes NK Thymus Lymphocytes T Thérapie cellulaire par transplantation de cellules souches hématopoïétiques Premières transplantations de CSH: 195 Irradiation accidentelle 1965 Patients leucémiques 196 Patients immunodéficients Depuis lors, les indications se multiplient en hématologie et en cancérologie Transplantation de CSH: de moëlle osseuse, mobilisées dans le sang périphérique de sang de cordon Drs. M. Cavazzana-Calvo, A. Fischer Hôpital Necker, Paris Transplantation de CSH: allogreffe autogreffe 4

5 Immunodeficiences Combinées Sévères (SCID, fréquence ~1:0 000) Immunodéficiences sévères liées à l X Inconnu AR (21%) Hypoplasie Cartilagineuse (1%) Inconnu (9%) Dysg?n?sie R?ticulaire (1%) - Forme la plus fréquente des SCID (1/ ) - N affecte que les garçons JAK3 (6%) - Défaut complet de la lymphopoïèse ADA (16%) IL7Ra (1%) 45% de X-SCID X-SCID (45%) - Infections récurrentes sévères - Mortalité dans les deux premières années de vie (Buckley RH, N Engl J Med, 343:1313, 2000) X-SCID Immunodéficience combinée sévère liée à l'x Traitement actuel par thérapie cellulaire Récepteur de facteur de croissance des lymphocytes T et NK la protéine γc Thymus Lymphocytes T 1) Transplantation de la moëlle totale d un donneur HLA identique (frère ou sœur): traitement curatif dans 90% des cas Mais moins de 20% des patients peuvent en bénéficier Lymphocytes NK 2) Transplantation de moëlle d un donneur «haplo-identique» déplétée en lymphocytes T Lymphocytes B Mais 60% de survie réaction du greffon contre l hôte (GVH) lymphomes mauvaise => Nécessité reconstitution d une de alternative l immunitéthérapeutique 5

6 Thérapie cellulaire utilisant des CSH "corrigées" Thérapie génique Le vecteur thérapeutique pour le transfert de gènes dans les CSH Utiliser pour la greffe les CSH du patient lui-même LTR 5' Gène γc LTR 3' (pas de problème de compatibilité HLA, pas de GVH) corrigées par l ajout de la séquence codante de γc Comment ajouter cette séquence? Modèle de souris SCID Thérapie génique du X-SCID: Etudes précliniques de sécurité Lymphocytes T anormaux ou absents Lymphocytes T mémoire CD4 + activés Lymphocytes T absents Pas ou peu de lymphocytes B Blocage de maturation au stade prob Faible niveau d Ig Pas de switch des Ig BLOOD 1999, 3: MOL THER 2000, 1: BLOOD 2000, 95: BLOOD 2001, 97: Pas de lymphocytes NK MOL THER 2001, 3:

7 Thérapie génique du X-SCID: Conclusions des études sécuritaires pré-cliniques Protocole de la thérapie génique In vitro: Modification du génome des CSH du patient La correction génétique des cellules souches de la moëlle osseuse hématopoïétique resulte en la restauration de l immunité de la souris invalidée pour le gène γ c. CSH de la moëlle osseuse du patient Vecteur γc Pas de problème rencontré au cours des 1 mois de suivi des souris. CSH ayant intégré le gène γc LTR 5' Gène γc LTR 3' Différences avec les essais thérapeutiques chez l homme: Transduction de moëlle osseuse totale d animaux adultes Vecteurs et cytokines diffèrent au cours de la culture in vitro Utilisation d une irradiation totale des animaux Les animaux traités sont de jeunes adultes Résultats de la thérapie génique La mutagenèse insertionnelle Onze enfants greffés: après quelques semaines 9 d entre eux sont rentrés à la maison et mènent une vie normale Mais, environ 3 ans après la greffe, deux des enfants développent une leucémie possiblement liée au site d insertion du vecteur γc dans le génome. LTR 5' Gène γc LTR 3' Gène LMO-2 7

8 LMO-2 La thérapie génique a-t-elle encore un avenir? Oncogène dans les lymphocytes T: Une erreur dans la recombinaison V(D)J médiée par RAG aboutit à une translocation chromosomique t(11:14)(p13:q11) qui active LMO-2 induisant une leucémie T chez l enfant. Les modèles murins d invalidation de LMO-2 démontrent qu il a un rôle important dans les cellules souches hématopoïétiques. Les souris transgéniques pour LMO-2 développent une leucémie T après une longue latence. L expression de LMO-2 est donc nécessaire mais pas suffisante pour aboutir à la transformation cancéreuse dans ce modèle. OUI, MAIS IL FAUT Comprendre les complications survenues - liées à cette maladie particulière? - liées à l âge de l enfant au moment de la greffe? - liées à une maladie infectieuse déclenchante? Redoubler de précautions préalables Sécuriser les vecteurs de transfert de gènes Contrôler leur insertion au niveau du génome Quelques éléments de réponse: et de nouvelles questions! Les deux patients qui ont développé des leucémies sont les plus jeunes au moment du traitement (1 et 3 mois) Rôle de la jeunesse des cellules souches hématopoïétiques? Ce sont aussi ceux qui ont reçu la plus forte dose de cellules transduites Augmente la probabilité d intégration oncogéniques? Les deux patients ont des intégrations impliquant le gène LMO-2 Y-a-t il une intégration préférentielle des vecteurs rétroviraux à proximité des oncogènes? ou L intégration à proximité de LMO-2 favorise-t elle la prolifération? Quelques éléments de réponse: et de nouvelles questions! (suite) Y-a-t il des co-facteurs (susceptibilité familiale au cancer, infections) qui apportent un élément favorisant la transformation leucémique dans les intégrants LMO-2? Y-a-t il une coopération spécifique entre γc et LMO-2 qui provoque la leucémie? La signalisation via γc induirait-elle une expansion clonale des cellules qui expriment LMO-2? Le risque leucémogène est-il spécifique aux X-SCID, commun à tous les SCIDs, ou à tous les transferts de gènes dans les cellules hématopoïétiques? Faut-il ré-évaluer la validité des modèles animaux existants?

9 Nouveaux pré-requis pour la thérapie génique Limites des vecteurs oncorétroviraux pour le transfert de gènes dans les CSH Modifications sécuritaires des vecteurs: gènes suicide vecteurs auto-inactivants éléments isolants Nécessité d étudier l activation des oncogènes après culture et transduction des cellules hématopoïétiques. Etude des sites d intégration des vecteurs. Développement de nouveaux modèles animaux. LTR 5' Ψ transgène LTR 3' - Les vecteurs oncorétroviraux dont la LTR 3 est délétée sont très peu efficaces. - Les vecteurs oncorétroviraux n intègrent leur génome dans celui de leurs cellules cibles que lors de la mitose. Les particularités des lentivirus Vecteur lentiviral TRIP dérivé de VIH-1 - Transport nucléaire actif du complexe pré-intégratif. LTR infectent les cellules qu elles prolifèrent ou non. gag Ψ pol Vif CMVR env U Rev Vecteur lentiviral Tat Faible efficacité. R = Vpr U = Vpu Nef LTR!U3 cppt CTS Séquences contrôlant la formation du triplex (17pb) EF1-α CMV!U3 La Le délétion L ADN promoteur triplex des séquences de central EF1-a U3 corrige permet des LTR le une défaut supprime meilleure d import toute expression nucléaire transcription du résiduelle transgène et à long augmente terme des le et niveau vecteurs dans tous d expression lentiviraux. les lignages du transgène. hématopoïétiques. 9

10 Le vecteur TRIP#U3-EF1α Le vecteur TRIP#U3-EF1α CMV!U3 cppt CTS EF1-α!U3 CMV!U3 cppt CTS EF1-α!U3 NOD-SCID-RC LTC-IC Prog.Multipotents Cellules CD34 + Efficacité de transduction de cellules CD34 + : BFU-E CFU-MK CFU-baCFU-Eo CFU-GM Pro-B Pro-T Progéniteurs clonogéniques Sang de cordon Moelle osseuse Mobilisées dans le sang CFU-E Erythroblaste MK Pre-B Pre-T Précurseurs GFP 7.5% 3.5% 75% Erythrocyte Plaquettes P.B P.Eo P.N. Mono B T Cellules matures BFU - E CFU - GM CFU mix Control + - GFP T 92,5±5%, n= 5,5±6%, n=4 2 et 75% L expression du transgène persiste in vitro au cours de la différenciation GPA-PE Erythrocytes 95% CD61 PE Mégacaryocytes 91% L expression du transgène persiste in vivo Dans les souris NOD/SCID 15 semaines après greffe: Lymphocytes B dans la moelle osseuse Lymphocytes T dans le thymus CD14 PE Macrophages 9% CD15 PE Granulocytes 1% CD19 PE R5 R4 95% CD4 PE CD4 PE Cy5 CD PE 95%

11 Aspects sécuritaires des vecteurs lentiviraux - Les vecteurs sont délétés des séquences U3 des LTR 3 et 5 Pas d activité transcriptionnelle résiduelle, donc pas de «read-through» Pas de risque d activation en trans de gènes voisins du site d intégration Un modèle original de thérapie génique de l'hémophilie B CSH Facteur IX Facteur IX Prom. #U3 cppt CTS #U3 Les plasmides d encapsidation ne codent pas les protéines auxiliaires Aucun test n a permis de mettre en évidence de virus recombinant Plaquettes 11