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1 TD DOSAGE DE PROTEINES ET ELECTROPHORESE : PARTIE THÉORIQUE BST1 SVT Daniela LENER IBMC Texte conseillé pour consultation : Biochimie, Voet & Voet, ed. De Boeck.

2 Dosage des protéines Pendant une purification il est nécessaire de vérifier la présence de protéine avant de passer à l étape suivante. Il est possible de vérifier la présence aussi bien que l'activité d'une protéine. Les premières étapes se contentent généralement de vérifier la présence de protéines par spectrophotométrie. Plus tard pendant la purification on commencera à vérifier la présence d'une protéine particulière ou de son activité: anticorps spécifiques réaction enzymatique--->produit détectable directement ou indirectement fixation de ligands spécifiques radioactifs ou fluorescent REGLE GENERALE : Il faut toujours garder des aliquotes de matériel à chaque étape pour retracer le déroulement de la purification et améliorer le protocole.

3 La spectrophotométrie Méthode analytique quantitative, rapide et non destructive, qui consiste à mesurer l'absorbance ou la densité optique d'une substance chimique donnée en solution. Plus cette espèce est concentrée plus elle absorbe la lumière dans les limites de proportionnalité énoncées par la loi de Beer-Lambert. La densité optique des solutions est déterminée par un spectrophotomètre préalablement étalonné sur la longueur d'onde d'absorption de l'espèce chimique à étudier. Spectrophotomètre Le monochromateur génère, à partir d une source de lumière visible ou ultraviolette, une lumière monochromatique, dont la longueur d onde est choisie par l utilisateur. La lumière monochromatique incidente d intensité I 0 traverse alors une cuve contenant la solution étudiée, et l appareil mesure l intensité I de la lumière transmise. La valeur affichée par le spectrophotomètre est l absorbance à la longueur d onde étudiée.

4 Loi de Beer-Lambert Lorsqu un faisceau d intensité I 0 traverse une solution contenant une substance dissoute il est partiellement absorbé et le faisceau émergeant possède une intensité inférieure: I = I lc = coefficient d extinction molaire du soluté l = longueur du trajet parcouru par la lumière dans la solution c = concentration du soluté L intensité de la lumière transmise diminue de façon exponentielle en fonction de, de c et de l. Transmittance ou transmission T = I/I 0 = 10 - lc La transmittance est définie comme pourcentage de lumière transmise.

5 I = I lc I/ I 0 = 10 - lc si on prends le logarithme décimal Log I/ I 0 = Log T= - lc Log I 0 / I = Log 1/ T = lc on défini absorbance A le Log I 0 / I = Log 1/ T A = lc La loi de Beer-Lambert établi, donc, une relation de proportionnalité directe entre A, la concentration du soluté à doser (c), la longueur (l) du trajet parcouru par la lumière dans la solution et la nature du soluté ( ). A est une valeur positive sans unité. Elle est d autant plus grande que l intensité transmise est faible car A = Log 1/ T. Le coefficient d'extinction molaire, caractéristique de la substance étudiée à une longueur d'onde donnée, est exprimé en mol -1 L cm -1 et correspond à l absorbance à une certaine longueur d onde d une solution de concentration 1M obtenue en utilisant une cuvette de trajet optique de 1 cm ( 1M = A / l.c). x nm l l'épaisseur traversée est exprimé en cm c la concentration est exprimé en mol.l -1.

6 Remarques -La loi de Beer-Lambert est additive (mais pas la transmittance) : si la solution contient différentes substances qui absorbent dans une longueur d'onde donnée, l'absorbance totale pour cette longueur d'onde est la somme des absorbances de chaque substance. - La loi de Beer-Lambert a des limites. A = f(c) n'est linéaire que dans un intervalle de concentrations réduit : les concentrations ne doivent pas dépasser 10-2 M (10 mm). A D'autres facteurs peuvent dégrader la loi de Beer-Lambert : c -Erreurs de lecture du détecteur : le domaine de mesure est idéal pour 20%<T<60%. -Erreurs due à la lumière diffuse (un peu de lumière arrive au détecteur sans traverser la solution). -Erreurs due à des particularités chimiques. - Aberrations optiques (diffusions, réflexions, diffractions indésirées).

7 Quelle méthode de dosage des protéines? Method Range Accuracy Convenience Interference UV Absorbance 280 nm mg/ml Fair Excellent Detergents, nucleic acids nm Fair Poor 0.05mg/ml nm Fair Excellent Colorimetric Biuret 1-6 mg/ml Good Good Ammonium salts Lowry mg/ml Good Fair strong acids, ammonium sulfate Bicinchoninic mg/ml Good Excellent strong acids, ammonium sulfate, lip ids Dye bindi n g Bradford mg/ml Good Excellent

8 Dosage des protéines: absorption aux UV (280 nm) Systèmes de chromatographie ---> cellule spectrophotométrique. Le tryptophane (Trp, W) et la tyrosine (Tyr, Y) absorbent la lumière UV avec un pic à 280 nm d intensité décroissante. Hybride Tryptophane O Tyrosine O H 2 N CH C OH H 2 N CH C OH CH 2 CH 2 Formes de résonance de l anneau benzénique. Il est présent dans le tryptophane et la tyrosine. Absorbance à 280 nm. HN OH Le coefficient d'extinction de chaque protéine variera selon sa richesse en W et Y.

9 Dosage des protéines: absorption aux UV (280 nm) Le coefficient d'extinction molaire de chaque protéine variera selon sa richesse en W et Y. Dosage de la concentration des protéines totales d un extrait: on utilise le coefficient d extinction massique générique pour toutes les protéines qui correspond à l absorbance à 280 nm d une solution protéique de concentration de 1mg / ml mesuré dans une cuvette de 1 cm. Cette valeur est de 1. 1mg/mL = 1,0 280nm Méthode de Warburg-Christian: lecture de l absorbance à 280 nm et à 260 nm (correction pour les acides nucléiques). On calcule le rapport des absorbances 280/260 et on détermine le pourcentage d acides nucléiques dans la solution en utilisant le tableau. Rapport A 280nm /A 260nm Teneur en acides nucléiques (%) On calcule la concentration des protéines (mg /ml) par la relation suivante: C = d x ( A 280 nm x 1,55 - A 260 nm x 0,76) d = facteur de dilution de la solution protéique utilisé pour les mesures d absorbance.

10 Dosage des protéines: absorption aux UV (~ 190 nm) Tous les peptides pourraient absorber l'uv aux environs de nm, mais la plupart des tampons absorbent aussi massivement dans cette région... Formes de résonance de la liaison peptidique. Absorbance à nm. Cette mesure est moins dépendante de la composition en acides aminées des protéines. NB Toutes les mesures d absorbance aux UV sont effectuées avec des cuves en quartz, car elle sont les seules à ces longueurs d onde à permettre 100% de transmission des rayons.

11 Dosage des protéines: par méthodes colorimétriques. Ces techniques demandent un traitement de l'échantillon à mesurer par une substance chimique qui, au contact des protéines, produira un changement de couleur que l'on peut quantifier par spectrophotométrie si on dispose d'une courbe standard fiable. Méthode du biuret Technique pour détecter les protéines dans une solution, qui prends son nom de la substance biuret (H2NCONHCONH2), formée quand l urée est chauffée (elle présente une liaison de type peptidique). En conditions alcalines le cuivre (Cu 2+ ) apporté sous forme de sel (sulfate de cuivre) réagit avec les liaisons peptidiques des protéines et la solution se colore en violet avec une absorption maximum à 550 nm. Cette coloration ne se développe pas en présence de acides aminées libres. Méthode linéaire : couleur ---> complexe liaison peptidique et ion cuivre Cu 2+, pas de dépendance de la composition en aa. Peu sensible (1-6 mg/ml): complexe à bas coefficient d extinction. Interférence avec les sels d'ammonium.

12 Dosage des protéines: par méthodes colorimétriques. Méthode de Lowry En condition alcalines, dans la méthode du biuret, le cuivre (Cu 2+ ) se réduit en oxydant les aa aromatiques. Dans la méthode de Lowry, qui est une modification de la méthode du biuret, le cuivre réduit (Cu + ) est utilisé pour réduire le réactif de Folin (une solution phénolique contenant des composés de tungstène et de molybdène) qui change sa couleur du jaune au bleu. On lit la réaction à 750 nm. Plus sensible que le biuret, quantités de 0,1-1,5 mg/ml. Elle est sensible à plusieurs agents, dont l'edta, le DTT, le -mercapto, l'hepes, le Tris, le triton X- 100, le NP-40, etc.

13 Dosage des protéines: par liaison de colorant Méthode de Bradford Le bleu de Coomassie se lie à l'arginine (Arg, R), la tyrosine (Tyr, Y), le tryptophane (Trp, W), l'histidine (His, H) et la phénylalanine (Phe, F). En solution, il a une forme cationique rouge qui absorbe à 470nm. Lié aux protéines, il a une forme anionique bleue qui absorbe à 595nm. Il est assez insensible aux agents des tampons, mais est sensible aux détergents. La méthode de Bradford est encore plus sensible que celle de Lowry (5-100 μg/ml en microplaque). Blue de Coomassie brilliant

14 Purification des protéines Tout le long de la procédure de purification il faut déterminer des paramètres précis pour vérifier si notre procédure est adéquate: 1) Volume de la solution 2) Concentration protéique 3) Activité enzymatique Ces trois paramètres nous permettrons de calculer: 4) Activité spécifique 5) Activité totale 6) L enrichissement 7) Le rendement

15 Unités d activité enzymatique Unité enzymatique ou unité internationale (UI): quantité d enzyme permettant la formation d une mmole de produit par minute dans des conditions définies de ph, T C, force ionique, concentration saturante de substrat. Si l on rapporte le nombre de UI au volume de la fraction de purification, on obtient l Activité enzymatique (AE) exprimée en UI/ml. Ce paramètre augmente avec la purification. Si l on rapporte le nombre de UI à la masse de protéines contenue dans la fraction de purification, on obtient l Activité spécifique (AS) exprimé en UI/mg. Ce paramètre augmente avec la purification et il est une mesure de la pureté de la fraction enzymatique. L Activité totale (AT) correspond au nombre de Ui contenus dans le volume total de la fraction de purification. On l obtient en multipliant l AE pour le volume totale de la fraction. Elle est exprimée en Ui. Ce paramètre diminue avec la purification. Le Rendement R correspond à la totalité d UI en fin de purification divisée par la totalité UI avant la purification (en %). L Enrichissement (ou degré de purification, E) correspond à l AS en fin de purification divisée par l AS avant la purification. L Activité Moléculaire (AM) correspond au nombre de UI/μmol d enzyme. L Activité spécifique et l Enrichissement atteignent une valeur maximale lorsque l'enzyme est pure.

16 Suivi de purification: dosage d activité enzymatique Pour pouvoir calculer l activité enzymatique il faut calculer la vitesse initiale de la réaction catalysé par l enzymes que nous sommes en train de purifier. Phosphatase = catalyse la déphosphorilation du substrat (par ex. L-histidinol phosphatase - dephosphorile le L-histidinol phosphate). Dephosphorilation du paranitrophénylphosphate (PNPP) en paranitrophénol (PNP). 415nm PNP= M -1 cm -1 Cinétique : Temps min A 0 0,093 0,191 0,296 0,401 B dil 20X 0 0,075 0,146 0,221 0,292 Vitesse initiale est la pente de la tangente à la courbe. via= 0,296-0,093/ 3-1= 0,102 (variation d absorbance - A- par minute) A = lc A/ t = l c/ t => c / t = A / t. 1/ l => 0, / mol -1 L cm -1. cm

17 A/ t = l c/ t c / t = A / t. 1/ l. d d = facteur de dilution (1 dans notre cas) c / t = 0,102 /min. 1 / mol -1 L cm -1 cm c / t = AE = 0,102 mol / L min AE = 0, μmol / ml. min AE = 0, μmol / ml. min AE = 0,0054 μmol / ml. min Mais μmol / min = Ui AE = 0,0054 Ui / ml

18 ELECTROPHORESE

19 Electrophorèse sur gel de polyacrylamide Les gels de polyacrylamide sont obtenus par polymérisation de molécules linéaires d acrylamide pontées par la bis acrylamide. La réaction est réalisée en présence d un catalyseur (tétraéthylméthyldiamide - TEMED) et d un initiateur (persulfate d ammonium). Réseau de mailles dont la porosité est déterminé par la concentration de l acrylamide et bisacrylamide.

20 Electrophorèse sur gel de polyacrylamide - Dépôt du mélange de protéines Déplacement des protéines (et acides nucléiques) : en fonction de la charge sous la force du champ électrique en fonction de l encombrement à cause des mailles du gel Champ électrique _ Déplacement du cathode (-) vers l anode (+) dans l ordre: de la charge nette (-) croissante de l encombrement décroissant On peut effectuer des électrophorèses en conditions natives à ph acide ou basique selon le point isoélectrique de la protéine d'intérêt. +

21 Electrophorèse sur gel de polyacrylamide: l appareillage

22 Electrophorèse sur gel dénaturant de polyacrylamide Le système le plus utilisé pour l'analyse d'un mélange de protéines est le gel de SDS (ou SDS- PAGE, pour sodium dodecyl sulfate -polyacrylamide gel electrophoresis). On met 2% de SDS dans le gel d'électrophorèse, dans le tampon de migration et dans le tampon de charge. Le SDS = détergent anionique (1charge négative par molécule) qui dénature les protéines en enveloppant la chaîne polypeptidique selon un ratio de masse de 1,4g SDS pour 1g protéine. Charge négative proportionnelle à leur longueur; même densité de charge par unité de longueur (1charge négative pour 2 aa). On utilise aussi 0,1M -mercaptoethanol (HO-CH2-CH2-SH) dans le tampon de charge des échantillons. Le -mercaptoéthanol brise les ponts disulfures intra et inter-protéiques. Puisque les protéines sont uniformément chargées par le SDS, leur vitesse de migration sur gel pendant l électrophorèse, sera proportionnelle à leur seule masse. Les protéines dans le gel sont colorées avec le bleu de Coomassie qui se lie à l'arginine (Arg, R), la tyrosine (Tyr, Y), le tryptophane (Trp, W), l'histidine (His, H) et la phénylalanine (Phe, F).

23 Electrophorèse sur gel dénaturant à ph discontinu Ions glycine Gel de concentration (Stacking gel) Cl - prend de l avance et laisse un vide ionique dans lequel les protéines n avancent pas. Les ions glycine avancent lentement: leur front de migration porte les protéines qui vont se concentrer en une bande fine Gel de séparation (Running gel) Ions glycine A l interface entre le gel de concentration et le gel de séparation les ions glycine deviennent plus mobile (ph 9) et le front de ions dépasse les protéines qui sont concentrées en une bande Les protéines ont maintenant assez d'électrolytes de part et d autre pour se séparer selon leur poids moléculaire.

24 Electrophorèse sur gel dénaturant à ph discontinu

25 Electrophorèse sur gel dénaturant à ph discontinu Cette technique peut être utilisé pour déterminer le poids moléculaire d une protéine car dans ces condition la mobilité est directement proportionnelle au Log de la masse moléculaire. On peut aussi déterminer l'oligomèrie d une protéine en mettant en corrélation le poids moléculaire trouvé par gel filtration (conditions natives) avec ceux des sous-unités trouvés par SDS-PAGE. Mobilité Protéine inconnue Marqueur Protéine de poids inconnue moléculaire Log MM

26 Focalisation isoélectrique (FIE) Le principe de base de la focalisation isoélectrique (FIE) est de créer un gradient de ph dans lequel les protéines pourront se déplacer soumises à un champ électrique. Arrivées au ph correspondant à leur phi, les protéines s'immobiliseront puisque leur charge nette sera nulle. De cette façon, il est possible de séparer les protéines d'une préparation selon leur phi. On peut créer un tel gradient de ph avec des ampholytes. Ampholytes = oligomères de faible masse moléculaire (300 à 600 Da) qui portent des groupes amino (+) et carboxyliques (-) aliphatiques ---> éventail de phi sous l effet de E. Ampholytes -CH 2 -N-(CH 2 ) n -N-CH 2 (CH2) n R NR 2 n = 2 ou 3 R = H ou -(CH 2 ) n -COOH Acide phosphorique H 3 PO 4 triéthanoamine

27 Electrophorèse bidimensionnelle L électrophorèse bidimensionnelle (E2D) est la combinaison d'une focalisation isoélectrique, qui sépare selon le phi, suivie d'une électrophorèse dénaturante SDS, séparant selon le poids moléculaire. E2D = séparer un mélange selon deux paramètres complètement indépendants. Ainsi, une FIE ou une SDS-PAGE peuvent séparer environ 60 à 100 composantes. Combinant ces deux méthodes dans une E2D, on peut résoudre au-delà de 1000 polypeptides.

28 Electrophorèse bidimensionnelle PM ,5 5 5,5 6 6,5 7 8 ph

29 Western blot Révéler la présence d une protéine à l aide d un anticorps spécifique. Transfert de protéines d'un gel SDS à une membrane pouvant être ensuite traitée avec un anticorps. L'anticorps reconnaît sa protéine cible. Un deuxième anticorps, qui reconnaît le premier, est alors appliqué. Ce second anticorps est d'ordinaire couplé à une phosphatase alcaline qui dégradera soit un substrat qui génère la production de photons (chemioluminescence) ou l'apparition locale d'une coloration foncée.

30 Western blot Cette technique permet de suivre la purification de protéines qui n ont pas d activité enzymatique, si un anticorps spécifique contre la protéine en question est disponible. Cette technique est utilisé lors des premières étapes de purification, quand la protéines d'intérêt est mélangée à beaucoup d autres protéines. Avec l avancement de la purification on doit pouvoir suivre la protéines par coloration des gels par Coomassie.

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