SVE 222 & PCL-442. Fascicule de Travaux Pratiques
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- Gustave Tassé
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1 SVE 222 & PCL-442 Fascicule de Travaux Pratiques Institut Supérieur de l Education et de la Formation Continue Bassem Jamoussi & Radhouane Chakroun 1
2 Sommaire PCL 442/SVE222 - TP N 1 : Etude d un Spectromètre d Absorption Moléculaire (UV/Vis)- Dosage d un Antiseptique du Commerce Principe simplifié Réglage Du Spectrophotomètre (CECIL CE 3041) Expériences... 4 PCL 442/SVE222 - TP N 2 : Chromatographie Liquide à Haute Pression (HPLC)- Dosage de l acide trans,trans-muconique urinaire
3 PCL 442/SVE222 - TP N 1 : Etude d un Spectromètre d Absorption Moléculaire (UV/Vis)- Dosage d un Antiseptique du Commerce 1. Principe simplifié Triangle des couleurs : Le bleu, le jaune et le rouge sont les couleurs primaires Les couleurs reliées par des pointillés sont complémentaires l une de l autre : le jaune est complémentaire du violet, le rouge, du vert Les couleurs des sommets sont obtenues par le mélange des couleurs des deux cotés adjacents : vert=jaune + bleu, orange = jaune+rouge.. Une solution colorée transmet les longueurs d onde correspondant à sa couleur, et absorbe majoritairement les longueurs d onde de la couleur complémentaire. Ex : une solution on rouge transmet les radiations rouges et absorbe majoritairement les radiations vertes. L absorption d une lumière monochromatique par une solution colorée et caractérisée par une grandeur appelée ABSORBANCE, notée «A».. C est cette grandeur qui est mesurée par le SPECTROPHOTOMÈTRE. «A» n a pas d unité «A» varie en théorie entre O (solution transparente) et l infini (solution opaque), mais les appareils sont souvent limités à quelques unités d absorbance. Pour des solutions colorées peu concentrées (C < 10-2 mol.l -1 ), l absorbance «A» est proportionnelle à la concentration C selon la loi de Beer-Lambert :.. A = absorbance, sans unité l = épaisseur en m de la solution traversée C = concentration molaire en mol. L -1 3
4 ε = coefficient d extinction molaire qui dépend de la longueur d onde et de la nature du soluté (en L.mol -1.cm -1 ) Pour une plus grande précision et une plus grande sensibilité des mesures, on règle l appareil à la longueur d onde λ correspondant au maximum d absorbance de la solution. 2. Réglage Du Spectrophotomètre (CECIL CE 3041) Allumer le spectrophotomètre Ouvrir le logiciel Datastream (raccourci sur le bureau) double clique. Dans l assistant, sélectionner Goto Entrer la longueur d onde maximale λ max Dans l assistant, sélectionner le mode Quantitative Sélectionner le mode de travail en cliquant sur b : curve Fit Cliquer sur multipoint : e Clique sur Load Blank Zéro Introduire le Blanc et presser sur Entrer Entrer N standard (nombre de solutions étalons) : 4 ou 5 A chaque fois que vous introduisez le standard dans l appareil en spécifiant la concentration cliquer sur Entrer Dans les paramètres d étalonnage, sélectionner comme méthode de traitement : Force through Origin? 0=No ; 1 : YES 1=Lin ; 2=Quad ; 3=Cub Press RUN Accept curve 0:NO ; 1:YES Sauvegarder la méthode. Store curve Entrer name Entrer pass code :0 3. Expériences Les cuves du spectrophotomètre mesurent 1 cm d épaisseur A- Spectre d absorption du permanganate de potassium Réaliser le tracé du spectre entre 400 et 800 nm d une solution de permanganate de potassium au spectrophotomètre qui permet ce tracé (réaliser d abord la ligne de base avec une cuve contenant de l eau distillée) Reproduire sur votre feuille l allure de la courbe représentant A en fonction de λ Indiquer la couleur des radiations absorbées majoritairement par le permanganate de potassium Rechercher, grâce à la fonction curseur, λ max qui correspondent au pic d absorbance (A maximum). 4
5 B- Vérification de la loi de Beer-Lambert - dosage d un antiseptique A partir d une solution mère de permanganate de potassium de concentration molaire mol.l -1, Réaliser les dilutions suivantes dans des fioles jaugées de 50 ml, puis les transférer dans des tubes à essai numérotés : Tube X Concentration Molaire C en mol.l , X Volume de solution mère à prélever en ml 0 0 Absorbance à nm Régler l appareil à λ max déterminé précédemment Régler le Zéro de l appareil avec l eau distillée Mesurer A pour les différentes solutions en rinçant le cuve avec la solution à étudier, de la solution la moins concentrée à la solution la plus concentrée. Pour X d antiseptique (eau de Dakin), en versa directement du produit dans une cuve de spectrophotométrie C- Exploitation 1. Tracer la courbe représentant A en fonction de C 2. Commenter la courbe : la loi de Beer-Lambert est elle vérifiée? 3. Calculer le coefficient directeur de la droite obtenue et exprimer ainsi A en fonction de C 4. Déterminer graphiquement la concentration en permanganate de potassium dans l antiseptique commercial. 5
6 PCL 442/SVE222 - TP N 2 : Chromatographie Liquide à Haute Pression (HPLC)- Dosage de l acide trans,trans-muconique urinaire Introduction Le benzène est un composé hémo-toxique, avec des effets comprenant la leucocytopénie, thrombocytopénie, pancytopénie voir même, l anémie aplasique. Il peut être à l origine d une leucémie myéloïde aiguë et a été classé par le CIRC (agence de recherche sur le cancer de l OMS) comme cancérogène de type 1. Il est de ce fait considéré comme agent cancérogène avéré ou certain. Bien que remplacé par d autres solvants en milieu industriel, l exposition professionnelle au benzène demeure d actualité étant donné qu il est encore utilisé dans certains laboratoires et qu on le trouve à des teneurs variant de 1,88 à 3,10% dans les essences de type ordinaire, super et super sans plomb. On peut également le trouver en impureté dans certains solvants de qualité industrielle. Le benzène est métabolisé principalement au niveau du foie où il subit d abord une oxydation. L oxyde de benzène obtenu subit ensuite un réarrangement non enzymatique, conduisant à la formation de Phénol. Schéma simplifié du métabolisme du benzène L oxyde de benzène peut également subir une conjugaison en se liant au Glutathion sous l action d une Glutathion transférase, pour donner l Acide S-phénylmercapturique. L ouverture du noyau benzénique, probablement à partir de la forme époxyde ou de la forme dihydrodiol conduit à la 6
7 formation du trans,trans-muconaldéhyde, qui sera métabolisé par oxydation et/ou réduction des groupements aldéhydes aboutissant à la formation de l Acide trans,trans-muconique. En France, la valeur limite d exposition professionnelle (VLEP) au benzène dans l air sur 8 h de travail correspondant à la valeur moyenne d exposition (VME) a été fixée à 1 ppm (3,25 mg/m3). La surveillance et l évaluation biologique de l exposition aux polluants chimiques en milieu professionnel se basent le plus souvent sur le dosage de leurs métabolites urinaires. Pour le benzène, le phénol étant peu sensible, ce sont les acides S-phénylmercapturique et trans,trans-muconique urinaires qui sont utilisés à ces fins. Les concentrations urinaires en fin de poste de travail de ces deux métabolites sont biens corrélés avec les niveaux moyens d exposition au benzène dans l air durant la journée de travail. Généralement, afin d éviter les biais dus à la dilution urinaire, il est recommandé de rapporter les concentrations des métabolites à celle de la créatinine urinaire. Dans ces travaux pratiques nous réaliserons un dosage de l Acide trans,trans-muconique urinaire par HPLC après purification par extraction sur phase solide (SPE). Sachant que pour une exposition moyenne à 1 ppm de benzène durant le poste de travail, correspond une concentration d acide trans,trans-muconique urinaire de 1,5 mg/g créatinine en fin de poste, déterminer les concentrations du métabolite dans les échantillons qui vous seront fournis et interpréter les résultats trouvés. Principe Extraction de l acide trans,trans-muconique urinaire sur colonne échangeuse d ion et analyse par chromatographie liquide à haute pression (HPLC). Matériel et réactifs HPLC muni d un détecteur UV et d une colonne C18 (ODS2 : 4,6mm x 250mm x 5µm) et d une une vanne RHEODYNE avec une boucle d injection de capacité 20µl. Seringue d injection pour HPLC Cartouche d extraction sur phase solide type Bond Elut remplies avec 500mg SAX avec un réservoir de volume 3ml Système d extraction SPE sous vide muni d une pompe à membrane ou d une trompe à eau Fioles jaugées de classe A ayant une capacité de 5, 10 et 50 ml Tubes en plastique de capacité 10ml Solution étalon d Acide trans,trans-muconique 50 mg/l. Phase mobile : mélange d une solution aqueuse d acide acétique à 1 % et de Méthanol aux proportions 90 : 10 (V/V). Solution d acide acétique 10%(v/v) Solution d acide acétique 1 % (v/v) Eau ultra pure (résistivité =18MΩ.cm) Mode Opératoire Préparation des solutions étalons : A partir de la solution mère (50 mg/l), préparer les solutions étalons de concentrations : 0,5 ; 1 et 5mg/l selon le schéma ci-dessous : 7
8 50mg/l 1/10 5 mg/l 1 mg/l 1/50 1/10 0,5 mg/l Préparation des échantillons : Les échantillons subissent une extraction sur phase solide, au cours de laquelle l aspiration sous vide doit permettre un écoulement moyen (goutte à goutte). Cette extraction comporte trois étapes : 1. Conditionnement des cartouches d extraction : Placer les tubes de récupération des solutions de lavage et les cartouches Bond Elut sur l extracteur SPE (voir figure) Conditionner chaque cartouche avec 3 ml de méthanol Répéter la même opération avec 3ml d eau ultra pure, éviter à chaque fois d aspirer le vide Support des récipients de récupération des solutions Emplacement des cartouches SPE Voie de sortie de l air aspiré 2. Dépôt de l échantillon et lavage : Déposer 1ml de l échantillon d urine Laisser écouler goutte à goutte Laver avec 3ml d acide acétique (1%) 8
9 3. Elution : Remplacer les tubes par des fioles de 5ml Eluer chaque cartouche avec 3ml d acide acétique 10% Ajuster au trait de jauge le volume de l éluat récupéré dans chaque fiole avec de l eau ultra pure Analyse par HPLC : Faire fonctionner l appareil HPLC dans les conditions suivantes : Débit de dégazage à l Helium : 60ml/mn Débit de la phase mobile : 1ml/min Volume d injection : 20 µl Température : 35 C Longueur d onde de détection : 264nm Injecter les solutions étalon en commençant par la concentration le plus faible. Noter le temps de rétention et la surface du pic chromatographique Injecter l échantillon Résultats 1) Tracer la droite d étalonnage : 2) En utilisant la droite d'étalonnage, calculer la valeur de la concentration d acide muconique dans l échantillon urinaire. 3) En supposant que la concentration de la créatinine urinaire est égale à 1g/l, interpréter le résultat obtenu. 9
(aq) sont colorées et donnent à la solution cette teinte violette, assimilable au magenta.»
Chapitre 5 / TP 1 : Contrôle qualité de l'eau de Dakin par dosage par étalonnage à l'aide d'un spectrophotomètre Objectif : Vous devez vérifier la concentration massique d'un désinfectant, l'eau de Dakin.
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