Chromatographie Liquide de Haute Performance (CLHP-HPLC) Introduction

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1 Chromatographie Liquide de Haute Performance (CLHP-HPLC) Introduction

2 Principe de la CLHP Séparation de constituants dans un mélange complexe Mise en solution dans un solvant ou un mélange de solvant (éluant) Analyse qualitative Analyse quantitative

3

4 Principe

5 Schéma

6 CLHP Apparition : années 1950 Chromatographie : séparation et quantification Liquide : travail en solution Haute performance : Grande efficacité de la séparation

7 Comparaison CPG-CLHP CPG : Chromatographie en Phase Gazeuse : composés volatils, faibles masses molaires CLHP : toutes molécules trouvent un solvant pour y être dissoutes : méthode universelle

8 Exemple de chromatogramme Rétention différée

9 Performance - Efficacité N th 2 2 t r t r = 16 = 5,54 ω ω 0 1/ 2 Nombre de plateaux théoriques N > 2000

10 Résolution R tr t A r t B r t A rb = 2 = 1,18 ω + ω ω + ω 0 0 1/ 2 1/ 2 A B A B R ~ 1,5

11 Asymétrie As = A/B

12 Autres paramètres Temps de rétention réduit : t R = t R t 0 Facteur de capacité : k, 1 = t R 1 t t 0 0 k, 2 = t R 2 t t 0 0

13 Temps mort (t m ou t 0 ) Temps que met un produit pour traverser la colonne sans être retenu. Se calcule si on connaît la porosité de la colonne, définie par : ε = V éluant = d t V l / cm π r / cm colonne vide 3-1 / cm.min m / min 2 2 Le temps mort dépend des caractéristiques de la colonne : la longueur (l), son diamètre (2r), sa porosité (ε) et du débit imposé par la pompe (d). t m = επ l r d 2

14 Autres paramètres Sélectivité : Sous réserve de certaines approximations : = α t t, R, R 2 1 R S = 1 4 α 1 α k' k' + 1 N

15 Objectif Séparation individuelle de tous les constituants d un mélange Deux facteurs : Miscibilité dans la phase mobile Interaction (affinité) avec la phase stationnaire

16 Principe d une séparation Temps d analyse : minimal Performance : maximale

17 Constitution de la chaîne

18 Les pompes Délivrer un débit constant sous une pression élevée, constante

19 Vanne d injection

20 Boucle d injection

21 Colonnes

22 Détecteur UV

23 Détecteur UV

24 Détecteur réfractométrique

25 Détecteur fluorimétrique

26 Constitution de la colonne Colonne remplie de billes Billes de silice tapissées d un revêtement

27 Billes

28 Phase inverse (RP) / phase normale Complémentarité

29 Physico-chimie de la rétention Compromis entre: phase stationnaire phase mobile

30 Interactions intermoléculaires

31

32 Interactions intermoléculaires

33 Moment dipolaire

34 Autres moments

35 Interaction dipôle-dipôle

36 Interaction dipôle-dipôle

37 Polarisabilité

38 Interaction dipôle permanent-dipôle induit

39 Dispersion

40 Interactions de Van der Waals

41 Liaison hydrogène

42 Bilan

43

44 O O H O O O H O H O

45 «Magic» LogP octanol/eau Constante de partage octanol / eau i,octanol P i = C Ci,eau? O O O H O H H O O H O H O H O H H O H H H H H H H O O H O H O H H H O H H H O H H O O H H H O H H H O H H O H H O O O H H H O H H O H H H O H H

46 Version Chemsketch (ACDLABS)

47 LogP par la méthode de Villar (Int. J. Quantum Chem., 44, 203 (1992))

48 LogP / Villar en PM3

49 LogP par la méthode Ghose, Pritchett et Crippen (J. Computational Chem., 9, 80 (1988))

50 Influence de la polarité de l éluant Notion de force éluante : Influence de la proportion de solvant apolaire Isothermes de van t Hoff H S ln k' i ln i + + RT R i i ( ) = φ

51

52

53 Préparation d une séparation

54 Choix de l éluant

55 Gradient d éluant

56 Gradient d éluant

57

58

59 Couplages Identifier les produits sortants par : Spectrométrie de masse Résonance magnétique nucléaire Spectroscopie Infra-Rouge

60 Couplage CLHP-SM

61 Couplage CLHP-RMN

62 Couplage CLHP-IR

63 Optimisation d une séparation t analyse le plus petit possible Résolution : 1,7 > R > 1,4 Asymétrie : centrée sur 1 Performance élevée Robustesse : une légère modification des paramètres ne doit pas influer sur la qualité de la séparation et de l analyse.

64 Facteurs d optimisation Colonne (longueur, diamètre, particules, chaîne alkyle) Débit - Pression Eluant (%polaireapolaire, ph) Température

65 Efficacité - Débit Anisotropie d écoulement

66 Van-Deemter / Knox Hauteur Equivalente en Plateaux Théoriques : H = L N BVD Van Deemter : H = AVD + + CVD. v v 3 BKn Knox : H = AKn. v + + CKn. v v

67 Efficacité d une colonne (nombre de plateaux théorique): Efficacité réelle (nombre de plateaux efficace) : avec ,54 5 = = = ω δ σ R R R t t t N ' 16 ' 5,54 ' = = = ω δ σ R R R eff t t t N ' t 0 t t R R =

68 Perte de charge

69 Exemple : optimisation de la séparation des bases de l ADN

70 Stabilisation

71 Choix judicieux des concentrations

72 Spectre UV-visible

73

74 Débit

75 % MeOH

76 ph

77 Température

78 Bilan

79 Bilan de l optimisation

80 Applications de la CLHP Analytique CLHP Analytique Gamme d étalonnage Ajouts dosés Etalon interne CLHP préparative Dérivation en sortie Boucle d injection à gros volume

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