METHODES DE DETECTION ET DE DOSAGE DES ANTIMALARIQUES DANS LES LIQUIDES BIOLOGIQUES

Transcription

1 METHODES DE DETECTION ET DE DOSAGE DES ANTIMALARIQUES DANS LES LIQUIDES BIOLOGIQUES Enquête épidémiologique sur la surveillance du paludisme N. HASSELOT *, A. KEUNDJIAN **, J. ABDOULAYE * RESUME Pour détecter et doser les antimalariques dans les liquides biologiques deux types de méthodes ont été envisagés : - des techniques simples de terrain permettant une appréciation rapide de la présence dans les urines de chloroquine, quinine, ou proguanil utilisés aux doses prophylactiques. - des techniques de chromatographie liquide haute performance sensibles et spécifiques assurant l identification et le dosage de tous les antimalariques et leurs métaboliques, après extraction, avec une sensibilité moyenne de l ordre de 10 ng/ml. L analyste dispose d une gamme très étendue de méthodologies qu il peut mettre à profit pour le dépistage, l identification et le dosage des antipaludéens.. Dans le contexte d un vaste programme de surveillance épidémiologique et de prophylaxie du paludisme dans les armées, nous avons été amenés à choisir deux groupes de techniques d analyse dont la finalité est différente : * Des méthodes simples colorimétriques de dépistage des antimalariques dans les urines dans un but de surveillance prophylactique, sur le terrain. Ces techniques de recherche des antimalariques dans les urines sont très utiles voire indispensables : - Pour contrôler la prise prophylactique d antipaludéens dans une population exposée, - Pour écarter des tests de résistance in vivo des malades ayant récemment absorbé un anti-malarique dont la présence fausserait le résultat de l épreuve, - Pour apprécier la biodisponibilité de la médication administrée au cours du test in vivo. de tous les antimalariques et de leurs métabolites dans le plasma, dans le but : - de contrôler l absorption du médicament en cas de paludisme maladie survenant au cours d une chimioprophylaxie, - de déterminer la concentration critique de certains médicaments en cas d échec thérapeutique (Quinine, Méfloquine, Halofantrine) ou prophylactique (méfloquine, Proguanil). I - STRUCTURE CHIMIQUE DES ANTIMALARIQUES Les molécules étudiées font partie de trois familles (amino- 4-quinoléines, arylméthanols et biguanides) et leurs structures sont développées ci-dessous. 1 - Arylméthanols : 2 - Amino-4-quinoléines : 3 - Biguanides : * Des méthodes chromatographiques spécifiques et sensibles qui permettent un dosage et une identification précise * Laboratoire de Biochimie et Toxicologie Tropicales. I.M.T.S.S.A. Le Pharo. Marseille Armées. ** Laboratoire de Chimie Parasitaire. I.M.T.S.S.A. Le Pharo Marseille Armées.

2 10 N. HASSELOT, A. KEUDJIAN, J. ABDOULAYE II - METHODES DE DEPISTAGE DES ANTIMALARIQUES DANS LES URINES Amino-4-quinoléines et biguanides sont excrétés à plus de 60 % dans les urines, la majorité sous forme intacte et environ 30 % sous forme de leur principal métabolite. - monoidéséthyl- chloroquine pour la chloroquine - cycloguanil pour le proguanil Les formes d élimination urinaire ne sont pas conjuguées ce qui permet une recherche directe dans les urines sans hydrolyse au préalable. A cause de la fixation tissulaire importante, l excrétion urinaire est lente et durable. Ainsi, une prise orale unique de 600 mg de chloroquine entraîne une excrétion urinaire pendant plusieurs semaines, elle peut se produire jusqu à 120 jours mais, il est vrai, à des taux très faibles. Une administration quotidienne et prolongée de 100 mg de chloroquine amènera une chloroquinurie de 15 à 90 mg/l. La recherche d antimalariques dans les urines doit donc pouvoir être pratiquée sur le terrain à l aide de réactifs et de techniques simples et rapides ne nécessitant aucun matériel spécial et suffisamment sensibles pour mettre en évidence des doses prophylactiques. Les techniques que nous avons retenues ne concernent que les molécules utilisées largement en prophylaxie : les amino-4-quinoléines, en particulier la chloroquine, les biguanides (proguanil) qui présentent actuellement un regain d intérêt devant la chimiorésistance à la chloroquine, éventuellement la quinine. Elles n ont pas été testées avec la méfloquine, elles ne réagissent pas avec l halofantrine. Leur sensibilité est plus ou moins bonne selon la technique, mais leur spécifité reste assez médiocre. Ce sont des réactions de groupes qui ne permettent pas d éviter les interférences avec des médicaments portant les mêmes fonctions saminées basiques. Nous décrirons 4 méthodes soulignant leurs avantages et leurs inconvénients. 1 - Test de Wilson et Edeson Ce test utilise une solution aqueuse de chlorure-mercurique et d iodure de potassium, le réactif de TANRET. On obtient en présence d amino-4-quinoléine et de quinine un trouble ou un précipité qui disparait à l ébullition et réapparait après refroidissement. - techniqe extrèmement simple puisqu il suffit d ajouter quelques gouttes de réactif à 5 ml d urine dans un tube à essai, - technique très sensible puisqu elle détecte une chloroquinurie de l ordre de 2 mg/l. Aucune spécificité. Il existe de très nombreuses interférences : - avec les protéines et l hémoglobine (dans ce cas le trouble persistera après chauffage) - avec de très nombreux médicaments à groupement aminé basique (alcaloïdes, en particulier la codéine, les phénothiazines, les antidépresseurs tricycliques, certains antibiotiques comme les tétracyclines). - le proguanil ne donne aucune réaction. - la corrélation entre la chloroquinémie et l intensité du trouble due à l élimination urinaire est très limitée, la réaction n étant plus linéaire au-delà de 50 mg/l. 2 - Test de DILL et GLAZKO L extrait chloroformique de l urine est additionné d un mélange d éosine et d acide chlorhydrique. En présence d amino-4-quinoléine et de quinine on obtient une coloration violette. - simplicité de la technique : 2 ml d urine sont mélangés à 10 gouttes de réactif. - sensibilité médiocre, la positivité du test est inconstante quand la concentration est inférieure à 70 mg/l. - faible spécificité puisque l on a des interférences avec l hémoglobine et les protéines, avec les phénothiazines; elles sont moins nombreuses avec les alcaloïdes. - la réaction est négative avec le proguanil. Cette technique bien que recommandée par l O.M.S. manque à la fois de spécificité et de sensibilité et conduit à de faux résultats positifs ou négatifs inexpliqués. 3 - Test de HASKINS Les antimalariques (amino-4-quinoléine, quinine et pro-

3 METHODE DE DETECTION ET DE DOSAGE DESS ANTIMALARIQUES DANS LES LIQUIDES BIOLOGIQUES 11 guanil) sont extraits de l urine par le chloroforme en milieu alcalin et mis en évidence par le méthyl orange avec lequel ils forment un complexe coloré en jaune. - c est une réaction sensible (4 mg/l pour la chloroquine) - aucune interférence avec les protéines et l hémoglobine. - il existe une bonne corrélation entre l intensité de la coloration obtenue dans l urine et la chloroquinémie qui permet une évaluation semi-quantitative. - la technique est un peu délicate à mettre en oeuvre sur le terrain. Il faut amener les urines à PH 8 par un tampon phosphate puis extraire les antimalariques par le chloroforme, centrifuger et éliminer la phase acquise et enfin ajouter le réactif de coloration. - les interférences sont identiques à celles du test de WILSON EDESON. 4 - Test de BERGQVIST Les amino-4-quinoléines, la quinine et le proguanil forment avec le bleu de bromothymol un complexe coloré en jaune extractible par le dichlorométhane. L intensité de la coloration est proportionnelle à la concentration urinaire de l antimalarique. - Aucune interférence avec l hémoglobine et les protéines. Très peu avec les médicaments à groupements aminés basiques. - réaction sensible à 3mg/l de chloroquine - réaction quantitative et linéaire jusqu à 100 mg/l et bien corrélée à la chloroquinémie plasmatique. - sur le terrrain elle peut être quantifiée visuellement grâce une gamme pré-établie. Il est préférable, quand on le peut, de procéder à une lecture spectophotométrique à 410 nm. - le mode opératoire original nécessite 2 extractions successives au dichlorométhane. Nous l avons modifié avec une seule extraction et l emploi de chloroforme, solvant moins onéreux et plus facile à se procurer dans les pays du tiers monde. - ce mode opératoire n a pas la simplicité du test de DILL et GLAZKO mais reste très accessible à un manipulateur peu entraîné. La technique de BERGQVIST nous parait actuellement la mieux adaptée des techniques simples de dépistage des antimalariques dans les urines. III - DOSAGE DES ANTIMALARIQUES PAR CHROMATOGRAPHIE LIQUIDE HAUTE PERFORMANCE (HPLC) Cette technique permet une détection très sensible et donc entraîne une réévaluation des propriétés pharmacocinétiques des molécules antimalariques. Elles apportent également une augmentation de la sélectivité permettant la détermination séparée des métabolites : ceci revêt une importance quand la molécule et le métabolite ont des activités biologiques variables. (ex : Proguanil Cycloguanil, seul actif). A - Le matériel Nos dosages sont réalisés sur une chaîne HPLC KONTRON - pompe injecteur automatique détecteur pilotage et intégration des résultats par le Data System 450 MT2 B - Les réactifs Tous les solvants sont de qualité HPLC : méthanol lichrosolv MERCK, acétonitrile, 1-2 dichlorométhane ou éthane FLUKA, PIC B7, B8, low UV B5 WATERS. Pour les réactifs n existant pas en qualité HPLC, ils ont été choisis dans la qualité la plus pure pour analyse. L eau ultrapure est obtenue par un système Milli-Q MILLI- PORE. C - Les extractions Elles ont été réalisées à partir du plasma : centrifugation rapide, moins de 2 heures après prélèvement et congélation à - 20 C pour éviter la diffusion des molécules à partir des cellules sanguines (important dans le cas de la chloroquine) et le risque de dégradation à la lumière.

4 12 N. HASSELOT, A. KEUDJIAN, J. ABDOULAYE Si la technique de récupération du plasma ne peut pas être bien standardisée, il vaut mieux utiliser le sang total pour lequel une étape supplémentaire de lyse cellulaire est nécessaire. Quant aux urines, l extraction est pratiquée comme pour le plasma. Trois types d extraction ont été mis en oeuvre : 1 - Une extraction liquide par paire d ions en présence de solvant 1.2 dichlorométhane ou éthane en milieu acide ou basique (fonction des molécules utilisées) pour la chloroquine, la méfloquine et la quinine. 2 - Une extraction lsolide-liquide réalisée avec des minicolonnes Bond Elut en C8 ou en C18 de 500 mg de phase. Proguanil et cycloguanil : colonne en C18 Halofantrine : colonne en C8 3 - Enfin une précipitation des protéines par l acétonitrile et injection directe après centrifugation sur colonne, réalisée pour la quinine. Cette méthode présente l avantage d éviter le trop grand nombre de manipulations et le risque de perte mais n élimine pas les molécules médicamenteuses qui peuvent interférer avec les antimalariques au moment de l analyse. Dans tous les cas, il est conseillé, pour minimiser les pertes dues à l absorption sur verre (caractère aminé de la plupart des antimalariques) de prétraiter les tubes (soit par l Hcl 0,1 N, rinçage et séchage à l acétone soit par silanisation). Grâce aux techniques de dosage très sensibles, l extraction des molécules d antimalariques à partir des milieux biologiques, est devenue l étape limitante de leur détermination. Nos rendements moyens sont voisins de 85 %. D - Les dosages Les dosages sont réalisés en spectrophotométrie UV sur les pics séparés par chromatographie liquide haute performance (HPLC) sur colonne de phase inverse. E - Résultats Les conditions du dosage et les concentrations plasmatiques habituellement trouvées dans les schémas prophylactiques et thérapeutiques sont résumées pour chaque molécule dans le tableau I. F - Conclusion Le titrage par la technique HPLC des antimalariques constitue maintenant la méthode de référence. Celle-ci permet une détection pharmacocinétique des antimalariques. Elle apporte également une augmentation de la sélectivité permettant la détermination séparée des métabolites qui sont parfois plus actifs que la molécule elle-même (voire seuls actifs, cas du cycloguanil). Tableau 1

5 METHODE DE DETECTION ET DE DOSAGE DESS ANTIMALARIQUES DANS LES LIQUIDES BIOLOGIQUES 13 Tableau 1 Molécule Dosage Concentrations plasmatiques habituelles Colonne Phase mobile Détection Temps de Limite de Phase inverse rétention détection nm Echelle (AUFS) Chloroquine C18 10 µ Ac. Heptane DMQ = 4,56 min CQ = 10 ng/ml En prophylaxie : MM = 515,9 (300 x 3,9 mm) Sulfonique +/- 0,20 DMQ = 5 ngh/ml 100 mg/jour µ Bondapak 0,005 M CQ = 5 min CQ = 405 ng/ml Waters /Acétonitrile 344 0,005 +/- 0,20 (en moyenne) (66 : 34, v/v) DMQ = 246 ng/ml (en moyenne) Débit : 1 ml/mn Quinine, HCl 0,02 Q = 5,66 min 50 ng/ml Thérapeutique : MM = 396,9 +/- 0,25 3 à 10 µg/ml C8 5µ Eau/méthanol/ Thérapeutique : (250 x 4,6 mm) acétonitrile 500 mg en 1 prise sphérisorb (10:12:78 v/v) 1/2-vie plasmatique Halofantrine contenant 1 % 254 0,005 Hal : 3,94 min 10 ng/ml = 61 h environ MM = 536,5 triéthylamine +/- 0,28 20 ng/ml en moy. tamponnée à ph = 6/H3PO4 Débit 1 ml/mn C18 10 µ Ac. octane Prophylaxie (300 x 3,9 mm) sulfonique Méfloquine µ Bondapak 0,005 M MMQ = 4,30 min 250 mg/semaine MM = 414,8 Waters /méthanol 222 0,01 +/- 0,22 50 ng/ml (30:70, v/v) MQ = 11,67 min 600/1200 ng/ml Débit : 1 ml/mn +/- 0,28 Phényl 5 µ Méthanol/eau Prophylaxie (150 x 4,6 mm) (29:71, v/v) PG = 5,54 min PG = 4 ng/ml Proguanil contenant +/- 0, mg en 1 prise M= 261,5 Sphérisorb 5 mm d'ac ,002 CG = 8,10 min CG = 10 ng/ml moy. : 152 ng/ml +/- 0,37 de Proguanil et Cycloguanil Débit : 60 ng/ml de MM = 251,5 1,5 ml/min Cycloguanil DMQ : Monodéséthylchloroquine, CQ : Chloroquine, Q : Quinine, MMQ : métabolite de la Méfloquine, MQ : Méfloqune, Hal : Halofantrine, PG : Proguanil, CG : Cycloguanil 1 - ABDOULAYE Idrissou. Techniques de recherches et de dosage e la chloroquine dans les urines (mémoire Pharmacie tropicale I.M.T.S.S.A.). 2 - BERGQVIST Y et coll. Determination of chloroquine and its metabolites in urine : a field method based on ion-pair extraction. Bulletin of World Health Organization 63 (5) CHARMOT G. Antimalariques. Sem Hop Paris n BROWN N.D. POON B.T. CHULAY J.D. - Determination of chloroquine and its metabolites in human plasma by ion-pair high performance liquid chromatography.. J. of chrom. 229 (1982) EDSTEIN M. STACE J. SHANN F. - Quantification of quinine in human serum by high performence liquid chromatography. J. of chrom. 278 (1983) BIBLIOGRAPHIE 6 - BERGQVIST Y. HELLGREN U. CHURCHILL F.C. - HPLC assay for the simultaneous monitoring of mefloquine and its acid metabolite in biological samples using protein precipitation an ion-pair extraction. J. of chrom 432 (1988) GAVIENOWSKI M. BENET L.Z and al. - Ion-paired liquid chromatographic method for the analysis of blood and plasma for the antimalarial drug halofrantine and its putative mono-debutylated metabolite. J. of chrom 430 (1988) SCOTT H.V and al. - A sensitive bioassay for serum cycloguanil using P. falciparum in vitro. International Journal of Parasitology. Vol. 18 n 5 (1988) 9 - KEUNDJIAN A. et BERNARD P. - Travaux Scientifiques des chercheurs du S.S.A n 10. Détremination de la choroquine et de son dérivé déséthylé dans le sang total et les urines par HPLC.