Chromatographie. 1 Généralités. Cours TB Chromatographie 1

Transcription

1 1 Généralités Cours TB Chromatographie 1

2 Introduction - ensemble de méthodes de séparation des constituants d un mélange - très employées (LA méthode de séparation actuelle) parce que : - séparation possible de n importe quel constituant - mise en œuvre possible à l échelle analytique, préparative et industrielle - seront envisagés * des généralités : définitions de la chromatographie et classification des méthodes chromatographiques * le principe des méthodes * les méthodologies et applications Chromatographie 2

3 1 Généralités 1 1 Définition de la chromatographie : principes généraux Définition Caractères généraux Différents types de chromatographies Classification selon l état des phases Classification selon le principe des interactions entre soluté et phase stationnaire Classification selon le mode d immobilisation de la phase stationnaire Classification selon les modalités de migration de la phase mobile Chromatographie (1/2) Étude théorique et modélisation Modélisation intuitive Volumes de rétention Efficacité de la colonne et résolution 1 4 Divers temps d une chromatographie sur colonne 1 5 Divers temps d une chromatographie sur colonne 2 Principe et utilisation des méthodes de chromatographie 2 1 Chromatographie d adsorption 2 2 Chromatographie de partage 2 3 Chromatographie par échange d ions 2 4 Chromatographie par gel filtration 2 5 Chromatographie par interactions biospécifiques 2 6 Chromatographie par interactions hydrophobes 2 7 Chromatographie par chélation (IMAC = Immobilised metal affinity chromatography») Chromatographie 3

4 (2/2) 3 Méthodologie et applications 3 1 Méthodologies Chromatographie sur colonne A - Chromatographie en phase liquide B - Chromatographie en phase gazeuse Chromatographie de surface A Méthodologie générale B Différence 3 2 Applications Séparation des acides aminés Séparation de médicaments par HPLC Séparation des protéines par FPLC Autres applications Chromatographie 4

5 1 1 Définition de la chromatographie : principes généraux Définition Chromatographie 1 Généralités Chromatographie : ensemble de méthodes qui assurent la séparation des constituants d un mélange en utilisant deux phases non miscibles : les divers constituants sont entraînés d'une manière différentielle par une phase mobile le long d'une phase stationnaire. Commentaires : «phase» : toute partie homogène d un système. trois états physiques d une phase : liquide, gazeux et solide Chromatographie 5

6 1 Généralités 1 1 Définition de la chromatographie : principes généraux Caractères généraux - la séparation de solutés se réalise entre deux phases : * une phase stationnaire, par définition immobile ; choisie pour sa grande affinité pour les divers solutés ; affinité quels mécanismes? cependant, affinité pas trop importante : les solutés doivent pouvoir être détachés * une phase mobile qui entraîne les divers solutés - en fait, les solutés se partagent entre la phase stationnaire et la phase mobile ; chromatographie = phénomène de partage généralisé Chromatographie 6

7 Phase stationnaire Phase mobile Phase stationnaire Phase mobile Cmo Cst Cst Cmo K = > 1 Schématisation Chromatographie 7

8 1 Généralités 1 1 Définition de la chromatographie : principes généraux Caractères généraux - la séparation est liée à la vitesse propre d entraînement du soluté par la phase mobile : * les substances qui migrent le plus sont celles qui ont le plus d affinité pour la phase mobile, * les substances qui migrent le moins, celles qui ont le moins d affinité. - les solutés restent ou non dans la phase stationnaire * initialement, du point de vue historique, les solutés restaient dans la phase stationnaire ; ils étaient colorés et pouvaient être visualisés * vers la seconde guerre mondiale (Tiselius), on a pu commencer à pouvoir mettre en évidence des solutés incolores par colorimétrie (utilisation de la ninhydrine) : il était possible de laisser sortir les solutés de la colonne (chromatographie d élution) Chromatographie 8

9 1 Généralités 1 1 Définition de la chromatographie : principes généraux Caractères généraux - la mise en oeuvre est possible : à l échelle laboratoire à l échelle préparative * à l échelle industrielle Chromatographie 9

10 1 Généralités Différents types de chromatographies Classification selon l état des phases Classification selon le principe des interactions entre soluté et phase stationnaire Classification selon le mode d immobilisation de la phase stationnaire Classification selon les modalités de migration de la phase mobile Chromatographie 10

11 1 Généralités Différents types de chromatographies Classification selon l état des phases Phase mobile Phase station. chromatographie liquide - liquide chromatographie liquide - solide CPL chr. phase liquide chromatographie gaz - liquide. Chromatographiegazsolide CPG chr. phase Chromatographie 11 gazeusedgazeuse

12 1 Généralités Différents types de chromatographies Classification selon le principe des interactions entre soluté et phase stationnaire - ADS0RPTION : liaisons de faible énergie (liaisons polaires,...) assurant la fixation des solutés à la phase stationnaire - PARTAGE : solubilisation des solutés dans une phase stationnaire liquide ; ils sont amenés à se partager entre la phase stationnaire et la phase mobile dans laquelle ils sont moins solubles; - ECHANGE D'IONS : liaisons ioniques entre charges électriques portées par les solutés et par la phase stationnaire (opposées) - GEL FILTRATION : pas de liaisons : diffusion / exclusion de solutés dans la phase stationnaire poreuse (chromatographie d'exclusion DIFFUSION) - INTERACTIONS BIOSPECIFIQUES : interactions biospécifiques (enzyme - substrat, antigène anticorps,...) entre les solutés et la phase stationnaire porteuse d un ligand (appliquées aux protéines). - INTERACTIONS HYDROPHOBES : liaisons hydrophobes entre la phase stationnaire et les solutés (nécessite de la présence de parties hydrophobes dans la structure du soluté) (s'applique aux protéines) - CHELATION : liaisons datives entre un métal divalent fixé sur un support (phase stationnaire) et les solutés porteurs de doublets libres (cas classique : His des protéines) Chromatographie 12

13 1 Généralités Différents types de chromatographies Classification selon le mode d immobilisation de la phase stationnaire La phase stationnaire immobilisée de 2 manières différentes : - soit étendue sur une surface plane : chromatographie de surface * la chromatographie sur papier * la chromatographie sur couche mince - soit à l'intérieur d'une colonne : chromatographie sur colonne. phase stationnaire en suspension dans un solvant (tampon) maintenue dans une colonne introduction en tête de colonne de l'échantillon à analyser (au moyen d'un injecteur) détection des solutés (grâce à un détecteur) collection de fractions (collecteur de fractions) Chromatographie 13

14 1 2 - Différents types de chromatographies Classification selon les modalités de migration de la phase mobile Chromatographie 1 Généralités A - Chromatographie par élution Sortie des solutés de la phase stationnaire : c'est le cas de la chromatographie sur colonne. ELUANTS : solvants (tampons ) (le plus souvent mélange) qui réalisent la rupture différentielle des interactions entre phase stationnaire et solutés élution en faisant varier la composition du solvant (tampon) utilisé : force ionique, polarité par exemple soit d'une manière brusque (gradient discontinu) soit d'une manière continue (gradient continu). caractérisation des solutés dans l'éluat. B - Chromatographie par déplacement Maintien des solutés dans la phase stationnaire : ils se déplacent dans la phase stationnaire c'est le cas des chromatographies de surface (papier et couche mince) où on révèle les solutés encore présents dans la phase stationnaire Chromatographie 14

15 1 Généralités Étude théorique et modélisation Modélisations Le pic de chromatographie idéal Efficacité de la colonne et résolution Chromatographie 15

16 1 Généralités Étude théorique et modélisation Modélisations A Modélisation intuitive - série de barques sans moteur sur une rivière. - courant est supposé constant, c est à dire qu il est identique que l on soit au bord de la rive ou au milieu. - les barques transportent des passagers d une ligne marquée «départ» à une ligne marquée «arrivée». - les barques, au gré des passagers, sont susceptibles de s arrêter sur la berge durant des temps variables Chromatographie 16

17 Au temps 0,.. Elles Chromatographie 1 Généralités Étude théorique et modélisation Modélisations A Modélisation intuitive Au temps zéro 1 Modèle de barques sur une rivière : les barques attachées sur la ligne de départ Départ libérées en même temps, au temps zéro Arrivée Courant Chromatographie 17

18 1 Généralités Étude théorique et modélisation Modélisations A Modélisation intuitive Départ Arrivée - avancée, dans le courant, à la même vitesse - différence de durée du trajet entre les lignes de départ et celle d arrivée, liée aux arrêts plus ou moins longs. Départ Arrivée Chromatographie 18

19 1 Généralités Étude théorique et modélisation Modélisations A Modélisation intuitive Départ Arrivée - temps passé à naviguer t O identique pour toutes les barques - temps départ - arrivée t R différents du fait de la durée des arrêts effectués t R.. t R = t O + t' R t R : temps mis par les barques pour atteindre l'arrivée t O : temps passé à naviguer t R : temps des arrêts sur la rive Chromatographie 19

20 1 Généralités Étude théorique et modélisation Modélisations A Modélisation intuitive 2 Retour à la chromatographie barques = les différents solutés ; berge = la phase stationnaire ; la rivière = la phase mobile. t R = t o + t R (1) t R : temps correspondant à la sortie du soluté de la colonne : temps de rétention dans la colonne t o : temps passé dans la phase mobile = temps mort t R : temps passé dans la phase stationnaire. De même aucun soluté ne peut sortir avant le temps t o, temps qui correspond au transport dans la phase mobile. t R est le temps de rétention réduit du temps mort, c est à dire t R - t o Chromatographie 20

21 1 Généralités Étude théorique et modélisation Modélisations B Analogie chromatographie / distillation Chromatographie de partage : Martin et Synge 1941 Liquide appauvri en soluté volatil Vapeur enrichie en soluté volatil À chaque niveau, partage du soluté - entre la phase liquide et la phase gazeuse (distillation) - entre la phase stationnaire et la phase mobile Chromatographie 21 Colonne à plateau Colonne de chromatographie

22 1 Généralités Étude théorique et modélisation Liquide appauvri en soluté volatil Modélisations B Analogie chromatographie / distillation Chromatographie de partage : Martin et Synge 1941 Vapeur enrichie en soluté volatil Plateaux théoriques Plus une colonne comporte de plateaux (théoriques), meilleure sera la séparation Ou encore, plus la hauteur d un plateau sera faible, meilleure sera la séparation Colonne à plateau Chromatographie 22

23 Chromatographie 23

24 1 Généralités Étude théorique et modélisation Modélisations B Analogie chromatographie / distillation Remarque : représentation schématique d une chromatographie C 0 t R Chromatographie 24 t R

25 1 Généralités Étude théorique et modélisation Le pic de chromatographie idéal Chromatographie 25

26 1 Généralités Étude théorique et modélisation Efficacité de la colonne et résolution séparation caractérisée par le nombre effectif de plateaux théoriques N eff. Plus ce nombre est élevé, meilleure est la séparation. On démontre que : L ou A Efficacité de la colonne t R 2 N eff = = σ 2 H H = L / N avec L, longueur de la colonne (en cm) H, hauteur équivalente d un plateau théorique (en cm) (HEPT) σ t2, variance du pic (en unités de temps) Chromatographie ,2 1 0,6 0,5 t R ϖ 1/2 ϖ Pic gaussien σ σ σ = ϖ1/2 / (8 Ln 2 ) 1/2 t R

27 1 Généralités Étude théorique et modélisation Efficacité de la colonne et résolution A Efficacité de la colonne N eff peut également être calculé à partir de t R et de ω, ce dernier paramètre étant déterminé depuis l intersection des tangentes au point d inflexion avec la ligne de base. N eff = 16 t R2 / ω 2 Ainsi, pour une valeur de H de 12,5 µm et une longueur de 25 cm, on arrive à plateaux théoriques effectifs. Souvent il est plus facile de mesurer la largeur du pic à mi hauteur ω 1/2 : Comme σ = ω 1/2 / (8 ln 2) 1/2 L t 2 R N eff = = 5, H ω 2 1/ Chromatographie ,2 1 0,6 0,5 t R ϖ 1/2 ϖ Pic gaussien σ σ σ = ϖ1/2 / (8 Ln 2) 1/2 t R

28 1 Généralités Étude théorique et modélisation Efficacité de la colonne et résolution A Efficacité de la colonne Calculer de H à partir de l équation de Van Deemter (CPG initialement). H = A + B / u + C. U 8. k. e 2 H = 2. d P. λ + 2. τ. D M / u u 2. (1 + k ) 2. D S Η : hauteur d un plateau théorique λ : régularité du remplissage d p : diamètre des particules τ : facteur de tortuosité D M : : diffusivité de l échantillon dans la phase mobile D S : : diffusivité de l échantillon dans la phase stationnaire k : facteur de capacité e : épaisseur de la phase stationnaire (grains) u : vitesse linéaire de déplacement de la phase mobile Chromatographie 28

29 1 Généralités Étude théorique et modélisation Efficacité de la colonne et résolution Calculer de H à partir de l équation de Van Deemter (CPG initialement). H = A + B / u + C. u 8. k. e 2 H = 2. d P. λ + 2. τ. D M / u u Hauteur d un plateau théorique A Efficacité de la colonne 2. (1 + k ) 2. D S Α : diffusion de Eddy : facteur correspondant aux chicanes, aux chemins différents entre les molécules : diffusion turbulente B : facteur correspondant à la diffusion normale du liquide pendant l analyse : diffusion longitudinale C : facteur correspondant à la diffusion dans la phase stationnaire : résistance au transfert de masse Chromatographie 29

30 1 Généralités Étude théorique et modélisation Efficacité de la colonne et résolution Calculer de H à partir de l équation de Van Deemter (CPG initialement). H = A + B / u + C. u Α : facteur correspondant aux chicanes, aux chemins différents entre les molécules : diffusion turbulente A Efficacité de la colonne B : facteur correspondant à la diffusion normale du liquide pendant l analyse : diffusion longitudinale C : facteur correspondant à la diffusion dans la phase stationnaire : résistance au transfert de masse Chromatographie 30

31 1 Généralités Étude théorique et modélisation Efficacité de la colonne et résolution Calculer de H à partir de l équation de Van Deemter (CPG initialement). H = A + B / u + C. u Hauteur d un plateau théorique A Efficacité de la colonne B/u Η C.u Conclusions : - existence d un débit optimum pour obtenir une hauteur minimale d un plateau théorique (nombre maximal de plateaux théoriques) - pour éviter la diffusion (élargissement des pics), il faut grains de faible diamètre (mais pertes de charge) - importance du remplissage de la colonne Chromatographie 31 u A

32 1 Généralités Étude théorique et modélisation Efficacité de la colonne et résolution B Résolution La résolution est, pour une colonne, la capacité de séparation de deux solutés. V R1 - V R2 Rs = ω 1 + ω 2 ϖ1 V R1 ϖ2 V R2 V R Chromatographie 32

33 1 Généralités 1 4 Divers temps d une chromatographie sur colonne - Mise en contact des solutés avec la phase stationnaire (solutés susceptibles d être fixés et solutés non susceptibles d être fixés) : charge de la colonne - passage d une phase mobile 1 : sortie de la colonne (élution) des solutés non susceptibles d être fixés et obtention de l éluat 1 (filtrat) - passage d une phase mobile 2 : éluant vrai qui rompt les liaisons entre soluté et phase stationnaire (élution vraie) et obtention de l éluat 2. V R Chromatographie 33

34 Chromatographie 34

35 1 Généralités 1 5 Divers types de mise en œuvre d une chromatographie en phase liquide - basse pression - moyenne / haute pression ; actuellement chromatographie haute performance (CLHP ou HPLC) V R Chromatographie 35

36 2 Principes des méthodes de chromatographie Cours TB Chromatographie 36

37 2 Principe des méthodes de chromatographie 2 1 Chromatographie d adsorption 2 2 Chromatographie de partage 2 3 Chromatographie par échange d ions 2 4 Chromatographie par gel filtration 2 5 Chromatographie par interactions biospécifiques 2 6 Chromatographie par interactions hydrophobes 2 7 Chromatographie par chélation 3 Méthodologie et applications 3 1 Méthodologies Chromatographie sur colonne A - Chromatographie en phase liquide B - Chromatographie en phase gazeuse Chromatographie de surface A Méthodologie générale B Différence 3 2 Applications Séparation des acides aminés Séparation de médicaments par HPLC Séparation des protéines par FPLC Autres applications Chromatographie 37

38 2 Principe et utilisation des méthodes de chromatographie 2 1 Chromatographie d adsorption Principe : interaction Phase stationnaire Phase mobile Conditions de fixation et d élution Utilisation 2 2 Chromatographie de partage 2 3 Chromatographie par échange d ions 2 4 Chromatographie par gel filtration 2 5 Chromatographie par interactions biospécifiques 2 6 Chromatographie par interactions hydrophobes 2 7 Chromatographie par chélation (IMAC = Immobilised metal affinity chromatography») Chromatographie 38

39 2 Principe des méthodes de chromatographie 2 1 Chromatographie d adsorption Principe Fixation, en général, par des liaisons liées à la polarité Ο δ δ+ Η Η δ Ο Support solide δ+ Support solide Adsorption Désorption = remplacement par une autre molécule Chromatographie 39

40 2 Principe des méthodes de chromatographie 2 1 Chromatographie d adsorption Phase stationnaire, Solide insoluble, finement divisé, "actif " (capable de fixer des solutés) - polaire : gel de silice (Kieselguhr), alumine : ces supports sont à «activer». - non polaire : carbone actif - sels de calcium : phosphate tricalcique, hydroxyapatite pour les protéines Phase mobile Liquide (CPL) ou gazeuse (CPG) Réalise la rupture des liaisons soluté - phase stationnaire (phénomène de désorption) Chromatographie 40

41 2 Principe des méthodes de chromatographie 2 1 Chromatographie d adsorption Conditions de fixation et d élution - Cas des liaisons polaires : par ordre d'adsorption croissante, esters, cétones et aldéhydes, alcools et les amines, acides et les bases Utilisation de gradients de solvants organiques polaires - Cas des protéines : gradient croissant de tampon phosphate Chromatographie 41

42 2 Principe des méthodes de chromatographie 2 1 Chromatographie d adsorption Utilisation - utilisée pour la séparation des molécules organiques de masse moléculaire inférieure à 1000 g.mol -1 dans le domaine pharmaceutique et alimentaire : * fixation des colorants des vins et jus de fruits qui pourraient gêner telle ou telle méthode analytique. (phase liquide, échelle analytique) * fixation de substances pyrogènes existant dans une solution destinée à l usageparentéral. (phaseliquide, échelle industrielle) * séparation des acides gras (méthylés) (phase gazeuse, échelle analytique). -gel d'hydroxyapatite et le phosphate tricalcique utilisés pour la séparation des protéines ; techniques concurencées par la chromatographie d interactions hydrophobes -- mise en œuvre en basse presioon, CLHP, et chromatographie de surface Chromatographie 42

43 2 Principe des méthodes de chromatographie 2 1 Chromatographie d adsorption Type d'interaction Fixation de solutés sur un support solide par ADSORPTION - Liaisons polaires (le plus souvent) - Liaisons non polaires (cas du carbone actif) Phase stationnaire Phase mobile Conditions d'élution Mise en œuvre et Applications Solide insoluble, finement divisé, "actif " capable de fixer des solutés) - polaire : gel de silice (Kieselguhr), alumine Ces supports sont à activer - non polaire : carbone actif - sels de calcium : phosphate tricalcique, hydroxyapatite pour les protéines Liquide (CPL) ou gazeuse (CPG) Réalise la rupture des liaisons soluté - phase stationnaire (phénomène de désorption) - Cas des liaisons polaires : par ordre d'adsorption croissante, on a les esters, puis les cétones et aldéhydes, puis les alcools et les amines et enfin les acides et les bases Utilisation de gradients de solvants organiques polaires - Cas des protéines : gradient croissant de tampon phosphate - Sur colonne (CPL, CPG) - Sur couche mince (CCM) - Molécules organiques (M < 1000 g.mol -1 ) comme métabolites, médicaments - Séparation d'hydrocarbures sur carbone actif - Protéines : recherche (ancien) Chromatographie 43

44 2 Principe des méthodes de chromatographie 2 2 Chromatographie de partage Principe Supports Conditions de fixation et d élution Utilisation Chromatographie 44

45 2 Principe des méthodes de chromatographie 2 2 Chromatographie de partage Principe Sol Sol Support solide Phase stationnaire Phase mobile phases normales Solubilisation dans une phase liquide polaire (adsorbée sur un support solide) phases inverses Solubilisation dans une phase liquide apolaire adsorbée sur un support ou fixation sur des radicaux hydrophobes fixés sur un support solide Chromatographie 45

46 2 Principe des méthodes de chromatographie 2 2 Chromatographie de partage φ n o r m a l e s Solubilisation dans une phase liquide (adsorbée sur un support solide) Liquide polaire : eau, par exemple Solvants organiques peu polaires Gradient de polarité croissante - Sur colonne (CPL, CPG) - Sur couche mince (CCM) - Petites molécules polaires comme les acides aminés φ i n v e r s e s Solubilisation dans une phase liquide adsorbée sur un support ou radicaux hydrophobes fixés sur un support solide - Liquide apolaire plus ou moins visqueux - Chaînes hydrocarbonées en C 8, C16, C18, phényl, fixées sur de billes de silice, agarose, résine ou verre Solvants organiques plus polaires que la phase stationnaire Gradient de polarité décroissante - Sur colonne (CPL, CLHP) - Petites molécules apolaires, comme des dérivés d'acides aminés Chromatographie 46

47 2 Principe des méthodes de chromatographie 2 2 Chromatographie de partage Supports - terme "support" à préciser : matériau inerte qui sert de fixateur (inerte) à la phase stationnaire liquide. Il permet à cette phase stationnaire d être en un état physique liquide. = support à bien distinguer ici de la phase stationnaire. - supports = solides finement divisés qui présentent une très grande surface, ceci afin de retenir dans un petit volume une grande quantité de phase liquide ; rétention énergique de phase stationnaire, sans interaction avec les solutés ; les propriétés d adsorption doivent être totalement masquées Chromatographie 47

48 2 Principe des méthodes de chromatographie 2 2 Chromatographie de partage Supports - utilisation possible de la plupart des phases stationnaires de la chromatographie d adsorption sous forme poreuse ou pelliculaire. gel de silice très souvent employé car peut retenir jusqu à 70 % de son poids d eau ; grande capacité et bonne rétention des solvants mais garde certaines propriétés d adsorption.. Terre de diatomées, autre support siliceux, naturel (squelette siliceux d infusoires ou Kieselguhr ou célite) ; peut retenir de grandes quantités de solvant, même polaires Chromatographie 48

49 2 Principe des méthodes de chromatographie 2 2 Chromatographie de partage Supports - billes de verres ; billes de silice ; peuvent faire l objet de greffage de groupements fonctionnels facilitant la fixation de la phase stationnaire : réalisation d une «silanation», c est à dire traitement par des dérivés permettant la fixation de groupements hydrophobes (C6, C8, C16 et C18) = utilisation en phases inverses. - sont également utilisables, la poudre de cellulose et un certain nombre de polymères synthétiques dérivés du vinylbenzène Chromatographie 49

50 2 Principe des méthodes de chromatographie 2 2 Chromatographie de partage Les phases stationnaires et mobiles A - Les phases stationnaires 1 - Chromatographie en phases normales -phase stationnaire liquide (assez) polaire : classiquement (Martin et Synge) des solutions aqueuses alcalines, acides ou tamponnées, de méthanol ou d éthanol - simplement eau, - aussi de substances visqueuses : étheroxydes rendus très polaires par la présence de groupements hydroxyles ou nitrile : éthers, glycols, polyéthylène glycols, ββ oxydipropionitrile Chromatographie 50

51 2 Principe des méthodes de chromatographie 2 2 Chromatographie de partage Les phases stationnaires et mobiles A - Les phases stationnaires 2 - Chromatographie en phases inverses - phase stationnaire peu polaire ou apolaire -chromatographie en phase gazeuse : polyesters de glycols, de polyethers de glycols, de silicones, de carbures saturés ; - chromatographie en phase liquide : chaînes alkyles en C 8 et C 18 greffées sur de la silice - d une manière générale, phases stationnaires préparées par imprégnation (par exemple, en présence de solvant volatil) ou par greffage (utilisation des dérivés halogénés du silane) Chromatographie 51

52 2 Principe des méthodes de chromatographie 2 2 Chromatographie de partage Les phases stationnaires et mobiles B - Les phases mobiles - choix et conditions d emploi d une phase mobile : mêmes considérations générales que celles de la chromatographie d adsorption. : - pouvoir solvant et inertie chimique vis à vis des solutés - compatibilité avec les systèmes de détection - inertie chimique et insolubilité vis à vis dela phasestationnaire - Attention : une non miscibilité rigoureuse difficile à obtenir : saturation des phases les unes dans les autres par des contacts préalables : mélange des solvants dans une ampoule à décanter et séparation ultérieure.ou, en CLHP, passage du solvant dans une précolonne, avant le système d injection, chargée de phase stationnaire Chromatographie 52

53 2 Principe des méthodes de chromatographie 2 2 Chromatographie de partage Les phases stationnaires et mobiles B - Les phases mobiles -En chromatographie de partage phases normales, phase stationnaire = eau et phase mobile = butanol, d alcool benzylique, de chloroforme ou de toluène. En CLHP, on utilise les pentane, cyclohexane, hexane (purs ou additionnés de chloroforme), dichlorométhane, tétrahydrofurane, chloroforme, dioxanne, éther butylique, nitrométhane, hexane méthanol. - En chromatographie en phases inversées, phase mobile (plus) polaire = eau, méthanol (CH 3 -OH), acétonitrile (CH 3 -CN) ou mélange de ces solvants Chromatographie 53

54 2 Principe des méthodes de chromatographie 2 2 Chromatographie de partage Utilisation - utilisée sur colonne, sur papier, sur couche mince et en phase gazeuse. - sert à la séparation de molécules organiques de masse moléculaire inférieure à 1000 g.mol -1 - séparation d antibiotiques, des substances anticancéreuses, des métabolites, de substances prohibées (drogues, substances «dopantes»,.. ) - Phases normales (composés polaires)ou phases inverses (composés plus hydrophobes) - Remarque : une variante, la chromatographie par (de) paires d ions (voir plus loin) R 1 R R 3 R 4 Échantillon moins Complexe hydrophobe hydrophobe Chromatographie 54 R 1 R 2 + R 3 R 4

55 2 Principe des méthodes de chromatographie 2 3 Chromatographie par échange d ions Principe Supports Conditions de fixation et d élutions Utilisation Chromatographie 55

56 2 Principe des méthodes de chromatographie 2 3 Chromatographie par échange d ions Principe - solutés liés à la phase stationnaire par des liaisons ioniques phase stationnaire = macromolécules échangeuses d'ions, solide -phase mobile = tampon de ph et de force ionique définis : fait cesser les interactions entre solutés et phase stationnaire Chromatographie 56

57 2 Principe des méthodes de chromatographie 2 3 Chromatographie par échange d ions Principe Mélange à séparer Support (Su) Groupement charge ici positiveπορτευρ δε Λιβ ρατιον δε λα πηασε σολιδε (δ σορπτιον) Extraction - purification des enzymes

58 2 Principe des méthodes de chromatographie 2 3 Chromatographie par échange d ions Principe Μ λανγε σ παρερ αυ χονταχτ δε λα πηασε στατιονναιρε Φιξατιον δε λα προτ ινε ( αδσορπτιον ) αυ σενσ λαργε Extraction - purification des enzymes Λιβ ρατιον δε λα πηασε σολιδε (δ σορπτιον) par augmentation du ph 58

59 2 Principe des méthodes de chromatographie 2 3 Chromatographie par échange d ions La phase stationnaire : les échangeurs d ions A - Les groupements fonctionnels : les 2 types d'échangeurs Selon le type de charge de l ion échangé, et la charge de l échangeur, on distingue : - échangeurs d anions - échangeurs de cations. 1 - les échangeurs d'anions, échangeurs sous forme cationique Su-A + Ye - + Xs - <====> Su-A + Xe - + Ys - support chargé + soluté soluté fixé Ye - = contre ion Chromatographie 59

60 2 Principe des méthodes de chromatographie 2 3 Chromatographie par échange d ions La phase stationnaire : les échangeurs d ions A - Les groupements fonctionnels : les 2 types d'échangeurs 1 - les échangeurs d'anions, échangeurs sous forme cationique Exemples de groupements fonctionnels porteurs de charge positive : en général d amines I, II, III, IV groupements les plus classiques pour les protéines : groupements DEAE et TEAE. - CH 2 - CH 3 DEAE, Su O- CH 2 - CH 2 - N - CH 2 - CH 3 (échangeur faible, non ionisé à certains ph, ph acides) - CH 2 - CH 3 pk A = 9,5 - CH 2 - CH 3 Su O- CH 2 - CH 2 - N + H+ <=====> S O- CH 2 - CH 2 - N + - H - CH 2 - CH 3 - CH 2 - CH 3 - CH 2 - CH 3 TEAE, Su O- CH 2 - CH 2 - N + - CH 2 - CH 3 - CH 2 - CH 3 (échangeur fort, ionisé à tous les ph) Chromatographie 60

61 2 Principe des méthodes de chromatographie 2 3 Chromatographie par échange d ions La phase stationnaire : les échangeurs d ions A - Les groupements fonctionnels : les 2 types d'échangeurs 2 - Les échangeurs de cations, sous forme anionique Su-A - Ye + + Xs + <==========> Su-A - Xe + + Ys + support chargé - soluté soluté fixé Ye + = contre ion Chromatographie 61

62 2 Principe des méthodes de chromatographie 2 3 Chromatographie par échange d ions ECH ANG E D'IO NS Fixation de solutés par des liaisons ioniques entre charges opposées (faiblement énergétique) Billes de composés organiques naturels (dextrane, cellulose, ), synthétiques (polyacrylamide, résines, ) ou minéraux (verre, silice, ) avec greffage de groupements ionisés ou ionisables échangeant des anions ou des cations - Anions : DEAE, AE, - Cations : CM, SP, Liquide : tampons (Tris, phosphate, citrate, ) de ph et de µ donnés variant lors de l'élution Gradient de ph (discontinu) et / ou de force ionique croissante (discontinu ou continu) - Sur colonne (CPL, CLHP) - Séparation d'ions (acides aminés, ) et de macroions (protéines, acides nucléiques, ) Chromatographie 62

63 2 Principe des méthodes de chromatographie 2 3 Chromatographie par échange d ions La phase stationnaire : les échangeurs d ions A - Les groupements fonctionnels : les 2 types d'échangeurs 2 - les échangeurs de cations, sous forme anionique Exemples de groupements fonctionnels : -SO 3 -, - COO -, SP, CM SP : sulfopropyle Su - CH 2 - CH 2 - CH 2 -SO 3 - CM carboxyméthyle Su - CH 2 COO- Remarque : certains échangeurs avec les 2 types.(en particulier pour la désionisation de l eau) Chromatographie 63

64 2 Principe des méthodes de chromatographie 2 3 Chromatographie par échange d ions La phase stationnaire : les échangeurs d ions B - Les supports 1 - Supports organiques a - Polymères synthétiques b - Polymères naturels α - Dérivés du dextrane ß - Dérivés de la cellulose γ - Dérivés de l agarose δ - Dérivés mixtes 2 - Supports minéraux Document Chromatographie 64

65 2 Principe des méthodes de chromatographie 2 3 Chromatographie par échange d ions Conditions de fixation et d élutions A - Fixation - choix de la nature (forme anionique ou cationique) de l échangeur utilisé - ph tel que les solutés se fixent - fixation en présence d un tampon de faible force ionique B - Elution - modification des interactions électrostatiques entre soluté et phase stationnaire : changement de ph et/ou de force ionique. - en discontinu ou en continu Chromatographie 65

66 2 Principe des méthodes de chromatographie 2 3 Chromatographie par échange d ions Utilisation - utilisée pour la séparation de toutes substances porteuses de charges électriques (acides aminé, protéines, ) - particulièrement important pour les protéines (supports hydrophiles) Chromatographie 66

67 Extraction - purification des enzymes

68 Charge + des protéines (cations) : séparation sur échangeur - (sur échangeur de cations) CM Charge - des protéines (anions) : séparation sur échangeur + (sur échangeur d anions) DEAE Extraction - purification des enzymes

69 2 Principe des méthodes de chromatographie 2 4 Chromatographie par gel filtration Principe Supports Conditions de fixation et d élutions Utilisation Chromatographie 69

70 2 Principe des méthodes de chromatographie 2 4 Chromatographie par gel filtration - également appelée chromatographie de perméation de gel, chromatographie d'exclusion - diffusion - origine : mise sur le marché d'un gel hydrophile de dextrane artificiellement réticulé, le SEPHADEX TR, suite aux travaux en 1959 par PORATH et FLORKIN Chromatographie 70

71 2 Principe des méthodes de chromatographie 2 4 Chromatographie par gel filtration Type d'interaction Phase stationnaire Phase mobile Conditions d'élution Mise en œuvre et Applications GEL FILT RAT ION ABSENCE d'interactions au sens strict Diffusion plus ou moins grande dans un support poreux : les molécules les plus grosses sont éluées les premières Liquide contenu dans les billes poreuses dont la matière constitue le support Les supports sont des composés organiques naturels (dextrane, agarose, ), synthétiques (polyacrylamide, résines, ) ou des composés minéraux (verre ou silice) Liquide : tampons (Tris, phosphate, citrate, ) de ph et µ donnés Simple percolation de la colonne par un tampon adéquat, sans modification au cours de l'élution (élution isocratique) - Sur colonne (CPL, CLHP) - Séparation de macromolécules (ADN, protéines, ) selon leur taille - Détermination de M par la représentation : K av = - log M + b Chromatographie 71

72 2 Principe des méthodes de chromatographie 2 4 Chromatographie par gel filtration Principe - pas de liaison entre soluté et phase stationnaire = pas, ici, de "rétention«- comportement différent des molécules du fait de leur diffusion ou non à l intérieur d une matrice poreuse = tamisage moléculaire inverse dans un gel = sortie en premier des grosses molécules, exclues des billes d'un gel, ; en dernier, les petites qui ont diffusé = SEPARATION du fait de cette diffusion plus ou moins grande Remarques :. - séparation selon la taille des molécules d un type de forme déterminé (en général forme globulaire) - possibilité de déterminer les masses moléculaires Chromatographie 72

73 Chromatographie 73

74 v e v o v t Chromatographie 74

75 2 Principe des méthodes de chromatographie 2 4 Chromatographie par gel filtration Principe A - La phase stationnaire - constituée de grains de gel pourvus de pores de diamètres variables, ceci dans une gamme permettant la diffusion des solutés de masses moléculaires déterminées. - pores de plus faible diamètre (diamètre minimal) - pores de plus grand diamètre (diamètre maximal) - ensemble de pores de diamètres intermédiaires - un support de gel filtration ne permet la séparation que dans une gamme déterminée de masses moléculaires Chromatographie 75

76 2 Principe des méthodes de chromatographie 2 4 Chromatographie par gel filtration Principe B -La phase mobile : - ne fait pas cesser des interactions entre solutés et phase stationnaire qui n existent pas - rôle : simplement à assurer le déplacement linéaire des solutés. -simple liquide qui passe à travers la phase stationnaire = liquide qui permet de garder les molécules dans leur état natif, c est à dire d un simple tampon dans le cas des protéines Copie Chromatographie 76

77 2 Principe des méthodes de chromatographie 2 4 Chromatographie par gel filtration Supports - par définition, poreux - conditionnés sous forme de billes, pour faciliter le passage de la phase mobile, c est à dire diminuer les pertes de charge et éviter le colmatage - peuvent être organiques, minéraux ou mixtes. Documents Chromatographie 77

78 2 Principe des méthodes de chromatographie 2 4 Chromatographie par gel filtration Conditions de séparation A - Description schématique du phénomène Supposons le gel immobilisé dans une colonne. Le comportement des solutés se divise en 3 classes de comportements : 1 - Les grosses molécules 2 - Les petites molécules 3 - Les molécules de taille intermédiaire Conclusion : Il y a pour chaque gel un domaine de masse moléculaire : - en dessous duquel il n'y a aucune séparation - au dessus duquel il n'y a aucune séparation - la séparation ne se réalise que dans un domaine de masse moléculaire spécifique du gel considéré (en fait, il correspond au diamètre maximum (moyen) et minimum (moyen) des pores) Chromatographie 80

79 Mélange initial CONSTITUANTS NON SEPARES CONSTITUANTS NON SEPARES 1 - Les grosses molécules 2 - Les petites molécules 3 - Les molécules de taille intermédiaire Conclusion : Seule séparation Chromatographie 81

80 2 Principe des méthodes de chromatographie 2 4 Chromatographie par gel filtration Conditions de fixation et d élution B - Quantification ; détermination des masses moléculaires 1 - Les divers volumes a Description : définition des divers volumes α - Vo : volume mort Aucune substance ne peut sortir avant ce volume : Vo, volume mort de la colonne Il correspond au volume de phase mobile entre les grains du gel ß - Vt : volume total de la colonne Vt = volume du soluté correspondant à la percolation totale de la colonne (extérieur et intérieur des billes) γ - Ve : volume d'élution ; valeur intermédiaire entre vo et vt Chromatographie 82

81 2 Principe des méthodes de chromatographie 2 4 Chromatographie par gel filtration Conditions de fixation et d élution B - Quantification ; détermination des masses moléculaires 1 - Les divers volumes b Interprétation de ces divers volumes Vo : volume entre les grains Ve : volume d'élution de la substance étudiée V T : volume total, c est à dire somme des volume mort Vo, volume des grains Vg, volume et volume de liquide dans les grains Vs. REMARQUES : - Vo et VT se retrouvent dans tous les types de chromatographie (cf caractères généraux) - Vo et VT sont caractéristiques d une colonne remplie d une phase stationnaire donnée, percolée avec une phase mobile à un débit donné ; il y a changement de ces divers volumes caractéristiques d'une colonne selon les conditions : débit de phase mobile, pression, phase mobile, température d où nécessité de l utilisation d un paramètre caractérisant la diffusion d un soluté indépendamment de ces conditions ce sera K D Chromatographie 83

82 Approche de la valeur de V s à partir de l expression du volume total de la colonne V t = V o + V s + V g V s V g Vo Chromatographie 84

83 CONSTITUANTS NON SEPARES CONSTITUANTS NON SEPARES v e v o v t 1 - Les grosses molécules 2 - Les petites molécules 3 - Les molécules de taille intermédiaire Conclusion : Séparation Chromatographie 85

84 2 Principe des méthodes de chromatographie 2 4 Chromatographie par gel filtration Conditions de fixation et d élution B - Quantification ; détermination des masses moléculaires 2 - Le coefficient de diffusion K D, le coefficient de diffusion accessible : K av a - Le coefficient de diffusion K D α - Définition du coefficient de diffusion K D coefficient de diffusion K D d un soluté : rapport du volume de soluté supérieur à V o (soit V e - V o ) sur le volume contenu dans les grains V s. V e - V o K D = V s Chromatographie 86

85 2 Principe des méthodes de chromatographie 2 4 Chromatographie par gel filtration Conditions de fixation et d élution B - Quantification ; détermination des masses moléculaires a - Le coefficient de diffusion K D ß - Propriétés du coefficient de diffusion On démontre que K D = ß - α. log MM, d où K D 1 0 Log MM Chromatographie 87

86 K D 1 Mais ceci concerne K D et log MM, avec 0 Log MM V e - V o K D = V s Or, pour déterminer K D, il faut connaître V s. ce qui n est pas le cas.. d où une approche de la valeur de V s, par exemple, à partir de l expression du volume total de la colonne Chromatographie 88

87 2 Principe des méthodes de chromatographie 2 4 Chromatographie par gel filtration Conditions de fixation et d élution B - Quantification ; détermination des masses moléculaires b - Le coefficient de diffusion accessible K AV V t = V o + V s + V g d où V s = V t - V o - V g Or V g est négligeable. On peut donc admettre que V s = V t - V o détermination du coefficient de diffusion; alors appelé coefficient de diffusion accessible... Kav (available = accessible) V e - V o K av = V t - V o Chromatographie 89

88 v o v e v t Log kda v Copie Chromatographie 90 K av

89 Courbes théoriques Courbes expérimentales K AV log MM 1 0 log MM 0 1 K AV et Log MM = - c. V e + d Chromatographie 91

90 2 Principe des méthodes de chromatographie 2 4 Chromatographie par gel filtration Conditions de fixation et d élution B - Quantification ; détermination des masses moléculaires c - Détermination de masse moléculaire par chromatographie de gel filtration diverses opérations à réaliser : - Détermination de V o et V t avec des substances appropriées - Passage de substances étalons (dans de domaine de séparation) ; réalisation des calculs de K av ; construction de la courbe - passage de la substance à analyser ; calcul de K av et report sur la courbe Chromatographie 92

91 Détermination de masse moléculaire par chromatographie de gel filtration 1/2 1 - Détermination de v o et v t avec des substances appropriées 2 - Passage de substances étalons (dans le domaine de séparation) ; réalisation des calculs de K av ; construction de la courbe K av Calcul des K av Copie Chromatographie 93 Log kda

92 Détermination de masse moléculaire par chromatographie de gel filtration 2 / Passage de la substance à analyser ; calcul de K av et report sur la courbe K av Calcul du K av K av Log kda Log kda X Copie Chromatographie 94

93 Expérience de dessalage Extraction - purification des enzymes

94 Extraction - purification des enzymes

95 Extraction - purification des enzymes

96 2 Principe des méthodes de chromatographie 2 4 Chromatographie par gel filtration Utilisation - initialement développée pour la séparation des protéines séparation détermination de la masse moléculaire, en concurrence avec l'électrophorèse en gel de polyacrylamide en milieu dénaturant - dessalage des solutions protéiques - concentration des solutions protéiques (en batch) Chromatographie 98

97 2 Principe des méthodes de chromatographie 2 5 Chromatographie par interactions biospécifiques (chromatographie d affinité) Principe A - Généralités - condition sine qua non : soluté à séparer (protéine) capable de se fixer réversiblement à un ligand spécifique qui est attaché à une matrice insoluble. M + L <===== M L Macro- Ligand Complexe molécule attaché à la matrice - nécessite une connaissance préliminaire détaillée de la structure et de la spécificité biologique du composé à purifier Chromatographie 99

98 2 Principe des méthodes de chromatographie 2 5 Chromatographie par interactions biospécifiques (chromatographie d affinité) Principe A - Généralités K A n (P) ( RL)/(L) M + L <===== M L (M L) K A = (M). (L) - valeurs de K A comprises ici entre 10 5 et 10 8 M -1 - détermination de K A la méthodologie de Scatchard - ( RL)/(L) = K A n (P) - K A (RL) n (P) (RL) Chromatographie 100

99 Mélange à séparer au contact de la phase stationnaire Fixation spécifique de la protéine («adsorption») au sens large Libération de la phase solide (désorption) 101

100 2 Principe des méthodes de chromatographie 2 5 Chromatographie par interactions biospécifiques (chromatographie d affinité) Type d'interaction Phase stationnaire Phase mobile Conditions d'élution Mise en œuvre et Applications - Fixation des solutés par des interactions spécifiques avec un ligand fixé par covalence sur un support solide - Interactions protéine - ligand caractérisée par la constante de dissociation "K D" - Billes de composés organiques naturels (dextrane, cellulose, ), synthétiques (polyacrylamide, résines, ) ou minéraux (verre, silice, ) avec greffage d'un ligand par covalence - Exemples de ligands (classiquement de petites molécules) : 2',5'-ADP, 5'-AMP, arginine, bleu Cibacron, calmoduline, polyu, protéine A, protéine G, Liquide : tampons (Tris, phosphate, citrate, ) de ph et µ donnés. Variation au cours de l'élution et / ou tampon contenant une substance à plus forte affinité pour le ligand - Gradient de ph (discontinu) et / ou de force ionique croissante (discontinu ou continu) - Gradient de ligand de meilleure affinité - Sur colonne (CPL, CLHP) - Exemples d'application : interaction enzyme - substrat, antigène - anticorps, hormone - récepteur, Très efficace lors de la purification des enzymes Chromatographie 102

101 2 Principe des méthodes de chromatographie 2 5 Chromatographie par interactions biospécifiques Principe B La phase stationnaire - Support (solide) sur lequel est fixé un ligand par une liaison solide, une liaison covalente C La phase mobile - Tampon faisant diminuer les interactions entre solutés et phase stationnaire (ligand) ou contenant un ligand ayant davantage d affinité pour le soluté macromoléculaire Chromatographie 103

102 2 Principe des méthodes de chromatographie 2 5 Chromatographie par interactions biospécifiques La phase stationnaire A Le support * propriétés de la matrice idéale pour la chromatographie d interactions biospécifiques : - posséder les groupements chimiques permettant la fixation covalente du ligand et être stable dans les conditions de cette fixation - interagir faiblement avec les autres macromolécules pour minimiser les adsorptions non spécifiques - posséder de bonnes propriétés de flux. * En pratique, particules sphériques, uniformes, et rigides : - les dextranes réticulés (SEPHACRYL S) - l'agarose (SEPHAROSE, BIO - GEL A) - les gels de polyacrylamide (BIO - GELS P) - le polystyrène(bio - BEADS S) - la cellulose - le verre poreux et la silice Chromatographie 104

103 2 Principe des méthodes de chromatographie 2 5 Chromatographie par interactions biospécifiques Les supports B Le ligand 1 - Généralités : choix du ligand - nature chimique du ligand déterminée par la connaissance préliminaire de la spécificité biologique du composé à purifier. - fréquemment possible de sélectionner un ligand qui montre une spécificité absolue - D'un autre coté, possible de sélectionner un ligand qui présente une sélectivité de groupe : il fixe des composés qui possèdent une spécificité chimique déterminée : Exemple : AMP 5' qui peut fixer réversiblement beaucoup de deshydrogénases à NAD + car l'amp 5' est analogue, du point de vue structure, à une partie de la structure du NAD Chromatographie 105

104 Chromatographie 106

105 Copie Chromatographie 107

106 Copie Chromatographie 108

107 2 Principe des méthodes de chromatographie 2 5 Chromatographie par interactions biospécifiques Les supports B Le ligand 2 - Fixation du ligand au support pour constituer la phase stationnaire a - Groupement fonctionnel permettant la fixation b - Utilisation d'un bras («arm» - «spacer») c - Réactions de fixation Chromatographie 109

108 2 Principe des méthodes de chromatographie 2 5 Chromatographie par interactions biospécifiques Les supports B Le ligand 2 - Fixation du ligand au support pour constituer la phase stationnaire Groupement fonctionnel permettant la fixation - ligand avec groupement chimique adéquat pour permettre sa fixation à la matrice (support) : groupements fonctionnels comme : - NH 2, - COOH, - SH et OH - support avec groupements fonctionnels compatibles = activation (voir synthèse peptidique et immobilisation des enzymes). Copie Chromatographie 110

109 2 Principe des méthodes de chromatographie 2 5 Chromatographie par interactions biospécifiques Conditions de fixation et d élution A Fixation des solutés Conditions favorisant les interactions : - ph, - force ionique assez forte pour minimiser l'adsorption non spécifique des polyélectrolytes et des groupements chargés sur le ligand - présence de cofacteurs comme des ions métalliques nécessaires à l'interaction entre le ligand et les macromolécules. Pour que la fixation soit complète, ces conditions doivent être optimisées. Copie Chromatographie 119