Maria CELLAMARE. Dynamique et diversité du pico-, nano- et microphytoplancton des lacs Léman, d Annecy et du Bourget

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1 Maria CELLAMARE Mémoire de Master «Mention Sciences de l Univers, Environnement, Ecologie» «Spécialité Océanographie et Environnements Marins» Année 2 Dynamique et diversité du pico-, nano- et microphytoplancton des lacs Léman, d Annecy et du Bourget Stage effectué sous la responsabilité scientifique de : Stéphan JACQUET Equipe de Microbiologie Aquatique/UMR CARRTEL INRA - Station d Hydrobiologie Lacustre 75, avenue de Corzent BP Thonon-les-Bains cx France Institut National de la Recherche Agronomique

2 REMERCIEMENTS J aimerai tout d abord remercier mon maître de stage, le Dr. Stéphan Jacquet. Ce fut un honneur de travailler à ses côtés et de pouvoir échanger des idées ayant attrait au projet avec beaucoup de liberté. Je le remercie également pour sa disponibilité, sa motivation, son aide et ses corrections qui sont toujours empreintes de justesse. J ai eu grand plaisir aussi à partager quelques moments avec sa famille, Carol et Mattéo. Je tiens à remercier Monsieur Druart qui m a partagé ses connaissances sur la taxonomie du phytoplancton lacustre avec beaucoup de sympathie et de bonne humeur. A Anne Rolland pour ses précieux conseils, sa entière disposition et sa gentillesse. Merci également à toute l équipe de l INRA pour son accueil, Françoise Bouvet, Eric Delalex, Orlane Anneville, Agnès Bouchez, Brigitte Le Berre, Lulu, Jean Guillard et Jean- Marcel Dorioz. Je remercie l équipe des techniciens chargés des prélèvements qui oeuvrent même contre vents et marées et jusque dans le froid polaire : Pascal Perney, Pascal Chifflet et Jean- Christophe Hustache «Juan Cristobal» Merci à Jean Pierre et Manu pour ses magnifiques barbecues et à mes compagnons de la MJC avec qui j ai partagé tous mes déjeuners. Je remercie aussi Madame Menthon qui a préparé tous les milieux de culture et qui était toujours pleine d attention et de sympathie vis-à-vis de moi. Merci à Alain Nierga pour l excellente planification et coordination du Master, il a rendu beaucoup moins ardue toute la partie administrative. Merci aussi à Sébastien Personnic pour ses subtils conseils, son enthousiasme, son dynamisme et sa bonne humeur. Aux bons amis Anne, Caroline, Virgile, Pierre-Yves, Amandine, Rémy et Sophie pour tous les excellents et inoubliables moments qui nous avons passés ensemble dans la magnifique ville de Thonon-les-Bains et son lac magique. Merci enfin à tous les stagiaires et thésards pour leur amitié, soutien et leur précieuse aide dans la réalisation de ce travail, en spécial à Aurélie, Berengère, Aude, Romain, Jérôme et Ursula. Une pensée particulière pour mes collègues du master avec qui j ai noué des liens d amitié authentiques : Margaux, Fanny, Emilie T.K., Pauline, Emilie D., Clara, Ana, Mustapha, Morgane, Jihane. A mes professeurs de français de l école PERL : Myriam, Pierre, Fabrice, Dominique, Claire grâce à qui j ai pu apprendre le français et réaliser ce Master. Un grand merci à Danielle et Michel, Laurence et Oliver 1, Oliver 2, Max et Adeline A Juan Rojas pour son soutien, ses excellents conseils et son amitié A ma famille, Et très spécialement à Stéphane Muchas gracias a todos!

3 SOMMAIRE INTRODUCTION.. 1 MATERIELS ET METHODES Contexte Site d étude et échantillonnage Le lac Léman Le Lac du Bourget Le lac d Annecy Méthodes et instruments utilisés La cytométrie en flux (CMF) Isolement et mise en culture des populations triées par cytométrie La microscopie à épifluorescence Le microscope inversé..11 RESULTATS Microscopie Inversée Abondance du nano- et du microphytoplancton Richesse Spécifique Composition taxonomique du nano- et du microphytoplancton Lac Léman Lac du Bourget Lac d Annecy Diversité Spécifique Equitabilité Microscopie à Épifluorescence Proportion des picocyanobactéries riches en phycoérythrine Abondance des picocyanobactéries Proportion des formes picocyanobactériennes unicellulaires et coloniales Lac Léman Lac du Bourget Lac d Annecy Cytométrie en Flux...21

4 6.1. Abondances du picocyanobactéries, des différents eucaryotes sans phycoérythrine (PE) et des grosses cellules riches en phycoérythrine (cryptophycées et cyanobactéries filamenteuses) Lac Léman Lac du Bourget Lac d Annecy Proportion des trois principales classes de taille : pico- nano et microphytoplancton Lac Léman Lac du Bourget Lac d Annecy 24 DISCUSION.25 CONCLUSION 30 PERSPECTIVES.31 BIBLIOGRAPHIE...32 Annexe 1 RESUME

5 LISTE DES FIGURES Figure 1. Groupes représentatifs du phytoplancton observés en microscopie à épifluorescence. A : formes unicellulaires et coloniales de picocyanobactéries (picophytoplancton), B : la cryptophycée Rhodomonas minuta (nanophytoplancton), C : la diatomée Asterionella formosa (microphytoplancton). Figure 2. Localisation des lacs Léman, d Annecy et du Bourget dans la région Rhône-Alpes. Figure 3. Carte bathymétrique simplifiée du Lac Léman et localisation de la station de prélèvement. Figure 4. Carte bathymétrique simplifiée du Lac du Bourget et localisation de la station de prélèvement. Figure 5. Carte bathymétrique simplifiée du Lac d Annecy et localisation de la station de prélèvement. Figure 6. Schéma de principe du fonctionnement de la cytométrie en flux et de la fonction tri. Figure 7. Photographie des flacons de culture Nunclon contenant les populations isolées avec la fonction tri du cytométre puis mises en culture. Figure 8. Photographie des flacons de culture contenant les différents groupes phytoplanctoniques triés par cytométrie en flux et placées sur une roue tournante pour obtenir un éclairement homogène. Figure 9. Abondance du nano- et microphytoplancton à 3 profondeurs dans les lacs Léman (A), du Bourget (B) et d Annecy (C) pendant la période février - avril Figure 10. Richesse spécifique du nano- et microphytoplancton à 3 profondeurs dans les lacs Léman (A), du Bourget (B) et d Annecy (C) pendant la période février - avril Figure 11. Proportion des espèces phytoplanctoniques prédominantes dans le lac Léman aux profondeurs de 2,5 (A), 10 (B) et 15 m (C) pendant la période février - avril Figure 12. Proportion des espèces phytoplanctoniques prédominantes dans le lac du Bourget aux profondeurs de 2 (A), 10 (B) et 15 m (C) pendant la période février - avril Figure 13. Proportion des espèces phytoplanctoniques prédominantes dans le lac d Annecy aux profondeurs de 3 (A), 10 (B) et 15 m (C) pendant la période février - avril Figure 14. Indice de diversité du nano- et microphytoplancton observé à 3 profondeurs dans les lacs Léman (A), du Bourget (B) et d Annecy (C) pendant la période février - avril Figure 15. Indice d Equitabilité du nano- et microphytoplancton observé à 3 profondeurs dans les lacs Léman (A), du Bourget (B) et d Annecy (C) pendant la période février - avril Figure 16. Abondance des picocyanobactéries déterminée par microscopie à épifluorescence à 3 profondeurs dans les lacs Léman (A), du Bourget (B) et d Annecy (C) pendant la période février - avril Figure 17. Proportion des formes picocyanobactériennes unicellulaires et coloniales observée dans le lac Léman aux profondeurs de 2,5 (A), 10 (B) et 15 m (C) pendant la période février - avril 2005.

6 Figure 18. Proportion des formes picocyanobactériennes unicellulaires et coloniales observée dans le lac du Bourget aux profondeurs de 2 (A), 10 (B) et 15 m (C) pendant la période février - avril Figure 19. Proportion des formes picocyanobactériennes unicellulaires et coloniales observée dans le lac d Annecy aux profondeurs de 3 (A), 10 (B) et 15 m (C) pendant la période février - avril Figure 20. Abondance des picocyanobactéries (A), des cellules eucaryotes sans phycoérythrine (B) et des cellules riches en phycoérythrine (cyanobactéries filamenteuses et cryptophycées) (C) déterminée par cytométrie en flux à 8 profondeurs dans le lac Léman pendant la période février - avril Figure 21. Abondance des picocyanobactéries (A), des cellules eucaryotes sans phycoérythrine (B) et des cellules riches en phycoérythrine (cyanobactéries filamenteuses et cryptophycées) (C) déterminée par cytométrie en flux à 7 profondeurs dans le lac du Bourget pendant la période février -avril Figure 22. Abondance de picocyanobactéries (A), des cellules eucaryotes sans phycoérythrine (B) et des cellules riches en phycoérythrine (cyanobactéries filamenteuses et cryptophycées) (C) déterminée par cytométrie en flux à 7 profondeurs dans le lac d Annecy pendant la période février -avril Figure 23. Proportion des différentes classes de taille (pico-, nano et microphytoplanctonique) dans les lacs Léman à 2,5 (A), 10 (B) et 15 m (C), du Bourget à 2 (D), 10 (E) et 15 m (F) et d Annecy à 3 (G), 10 (H) et 15 m (I).

7 INTRODUCTION Le phytoplancton est constitué par des bactéries photosynthétiques (cyanobactéries) et des eucaryotes, qui vivent en suspension dans la zone euphotique des océans et des milieux dulçaquicoles. Ils constituent un maillon clef à la base des chaînes trophiques puisqu à travers le processus de photosynthèse, ils contribuent de manière significative à la biomasse et à la production primaire des écosystèmes (Stockner et Antia, 1986; Weisse, 1993; Ghosal et al ; Pick, 2000 ; Callieri et Stockner, 2002). Pour avoir une perception intégrale de la dynamique du phytoplancton dans la colonne d eau, l étude de ses principales composantes est essentielle. Le phytoplancton peut être divisé en trois principaux groupes selon la taille : le picophytoplancton, qui comprend les plus petites cellules autotrophes (cyanobactéries et microalgues appelées communément picoeucaryotes) dans la classe de taille µm (Weisse, 1988 ; Bell et Kalff, 2001 ; Callieri et Stockner, 2002), le nanophytoplancton (>2-20 µm) et le microphytoplancton (>20 µm µm) (Sieburth et al ; Mostajir et al ; Callieri et Stockner, 2002). Le picophytoplancton est un composant ubiquiste et souvent abondant des communautés pélagiques qui contribue significativement à la biomasse phytoplanctonique et à la productivité primaire des océans et lacs (Stockner et Antia, 1986 ; Weisse, 1988, 1993 ; McMurther et Pick, 1994 ; Lavallé et Pick, 2002). Ce compartiment biologique peut représenter entre 50 et 70 % de cette production dans des lacs de statut oligotrophe à mésotrophe (Weisse et Kenter, 1991 ; Schallenberg et Burns, 2001 ; Callieri et Stockner, 2002). Ce groupe de petites algues unicellulaires est considéré comme étant de grandes compétitrices vis-à-vis des ressources nutritives en faible concentration (ce qui est typiquement caractéristique des conditions [ultra]oligotrophiques). Cela s explique en raison de leur petite taille et plus spécifiquement du rapport surface/volume élevé qui confère à ces cellules d être avantagées vis-à-vis de la diffusion moléculaire des nutriments, comparativement aux plus grosses cellules phytoplanctoniques. Enfin, les plus petites cellules peuvent maintenir leur métabolisme avec une dépense minimale d énergie et cela garantit leur succès dans des conditions relativement pauvres en nutriments (Weisse, 1993 ; Callieri et Stockner, 2000 ; Lavallée et Pick, 2002). A la différence des grandes cyanobactéries

8 filamenteuses ou coloniales, le picoplancton autotrophe est une source essentielle de nourriture pour le microzooplancton. Son taux de croissance élevé similaire à celui des bactéries hétérotrophes, fait que ce groupe d autotrophes a une fonction importante au sein de la boucle microbienne (Azam et al ; Stockner et Antia, 1986 ; Weisse, 1988, 1993). Tout comme le picophytoplancton, le nanophytoplancton est plutôt caractéristique des systèmes oligotrophes (Rott, 1984 ; Carrillo et al. 1995). Une augmentation de sa proportion a un effet souvent qualifié de «positif» dans le fonctionnement de l écosystème. Du à sa petite taille, ce groupe d autotrophes est également caractérisé par un métabolisme élevé (ici encore, le rapport surface/volume élevé favorisant l échange entre les cellules et l environnement nutritif), un taux de multiplication important et un taux de sédimentation lent qui facilite sa consommation par le zooplancton filtreur, qui s accommode parfaitement de cette gamme de taille. Toutes ces caractéristiques permettent un recyclage rapide et efficace de la matière organique dans la zone euphotique (Mostajir et al ; Domaizon et al. 2003a). A la différence des classes de taille inférieure, le microphytoplancton est prédominant dans des milieux caractérisés par des concentrations en nutriments plus élevées. Cela s explique en partie parce que les grandes espèces du phytoplancton ont un désavantage compétitif vis-à-vis des plus petites formes dans des conditions d oligotrophie (Tada et al. 2003). La contribution de l ensemble de ces trois grands groupes à la production et à la biomasse phytoplanctonique totale a été soulignée pour quelques grands lacs de statuts trophiques différents (Ruggiu et al ; Szelag-Wasielewska, 1997, 1998 ; Vöros et al.1998) afin d apprécier leur rôle écologique dans les hydrosystèmes d eau douce. Dans le cas particulier du picophytoplancton, sa distribution, dynamique et diversité ont été décrites dans plusieurs lacs et réservoirs d Europe (Weisse, 1988 ; Pick, 1991 ; Weisse et Schweizer, 1991 ; Weisse et Kenter, 1991 ; Szelag-Wasielewska, 1997 ; Vörös et al., 1998 ; Chang, 1998 ; Gaedke et Weisse, 1998 ; Krienitz et al., 1999, 2000 ; Callieri et al ; Weisse et Mindl, 2002 ; Drakare et al., 2003 ; Jasser et Arvola, 2003). Pour le nano- et le microphytoplancton plusieurs études ont aussi décrit sa dynamique, diversité et succession dans certains grands lacs (Vinçon-Leite et al.1995, 2002; Tassin and Vinçon-Leite, 1998 ; Anneville et al a,b ; Domaizon et al. 2003b; Anneville et al ; Druart et al. 2004).

9 Néanmoins, la dynamique et la diversité de l ensemble de ces trois compartiments autotrophes sont très peu connues dans les lacs français, et ceci est particulièrement vrai pour les plus grandes réserves naturelles d eau douce que sont le Léman, le lac du Bourget et le lac d Annecy. Ces trois lacs présentent des conditions trophiques différentes, le lac d Annecy étant considéré comme oligotrophe et les 2 autres mésotrophes selon les critères de l Organisation pour la Coopération et le Développement Economique (OCDE, 1982). Malgré toutes les études qui ont été réalisées sur le plancton dans les lacs Léman (Gawler et al ; Angeli et al ; Pinel-Alloul et al ; Anneville et Pelletier, 2000 ; Anneville et Leboulanger, 2001 ; Anneville et al. 2002a,b ; Anneville et al ; Druart et al ), du Bourget (Vinçon-Leite et al. 1995, 2002 ; Dorigo et al ; Jacquet et al. 2005a,b) et d Annecy (Masson et al ; Domaizon et al. 2003a), il n existe à ce jour aucune référence sur la composition intégrale du pico-, nano- et microphytoplancton ainsi que sur leur proportion relative entre les trois écosystèmes lacustres. Plus globalement, les lacs périalpins pré-cités de la région Rhône-alpes n ont encore été que très peu étudiés du point de vue de l écologie microbienne (Leboulanger et al ; Domaizon et al. 2003a ; Dorigo et al ; Jacquet et al. 2005a,b ; Comte et al. 2005). Leur protection et leur restauration constituent un enjeu fort en terme d environnement, de ressource en eau et d aménagement du territoire. Il apparaît très important aujourd hui de s intéresser à l écologie des plus petites formes planctoniques de ces écosystèmes en voie de restauration (c est à dire caractérisés par un retour a l oligotrophie) car l abondance du picoplancton est supposée diminuer avec l élévation de l état trophique des lacs comme une réponse négative a l enrichissement en nutriments (Stockner et Antia, 1986 ; Weisse, 1993 ; Callieri et Stockner, 2000 ; Bell et Kalff, 2001 ; Schallenberg et Burns, 2001 ; Lavallée et Pick, 2002 ; Drakare et al ; Hirose et al. 2003). De cette manière le picoplancton pourrait être un excellent bioindicateur potentiel des changements à moyen terme dans la concentration des nutriments au sein de ces hydrosystèmes. Dans le cas du nano- et du microphytoplancton, leur utilisation comme bioindicateurs de l état trophique des hydrosystèmes est bien connue (Reynolds, 1998 ; Büsing, 1998 ; Calijuri et al. 2002). L environnement aquatique est sujet à une variabilité temporelle importante, avec la réorganisation fréquente de l abondance relative et de la composition des espèces phytoplanctoniques comme le résultat des interactions entre les différents paramètres

10 physiques, chimiques et biologiques (Calijuri et al. 2002). Mais, l identification des facteurs explicatifs de la dominance de certains taxa est souvant difficile puisque il y a plusieurs éléments qui interagissent (Reynolds, 1998 ; Anneville et al. 2004). Cependant, des associations de conditions environnementales ont été établies avec l augmentation ou la diminution d un taxon ou de groupes de taxa phytoplanctoniques (Lehman et al. 2004), permettant de définir précisément l état trophique du système (Reynolds, 1998 ; Rojo, 1998 ; Trifonova, 1998). L objectif de ce travail à été de suivre la dynamique temporelle et la diversité du pico-, nano-, et microphytoplancton des lacs Léman, du Bourget et d Annecy avec l utilisation des plusieurs techniques : la cytométrie en flux, la microscopie à épifluorescence et la microscopie inversée. Les objectifs intermédiaires ont consisté à : a) Comparer la dynamique et la diversité inter-lacs des populations phytoplanctoniques des trois principales classes de taille pour mettre en évidence l existence ou pas d un lien entre organismes, structure de communautés et état trophique ; b) Déterminer les abondances du picophytoplancton, des cyanobactéries filamenteuses et des formes eucaryotes par cytométrie en flux ; c) Identifier la plupart des populations inconnues de prime abord en cytométrie en flux, après leur tri et mise en culture ; d) Comparer les abondances des picocyanobactéries par deux techniques différentes : la cytométrie en flux et la microscopie à épifluorescence ; e) Déterminer avec la microscopie à épifluorescence, la proportion des formes picocyanobactériennes unicellulaires et coloniales ainsi que la proportion des picocyanobactéries riches en phycoérythrine et celles riches en phycocyanine ; f) Déterminer l abondance et la composition du nano- et du microphytoplancton en microscopie inversée pour estimer la contribution relative de ces compartiments à l ensemble du phytoplancton lacustre.

11 MATERIELS ET METHODES 1. Contexte Au cours de ce travail, plusieurs méthodes ont été appliquées pour étudier la dynamique et la diversité des différents groupes de taille du phytoplancton (pico-, nano- et microphytoplancton) (Figure 1) de trois lacs caractérisés par des niveaux trophiques distincts. L utilisation de la cytométrie en flux a permis de déterminer l abondance des picocyanobacteries et d isoler grâce à sa fonction de tri des groupes «inconnus» appartenants au pico-, nano- et microphytoplancton pour leur identification ultérieure après mise en culture. La microscopie à épifluorescence nous a permis d estimer l abondance des picocyanobacteries riches en phycoérythrine et phycocyanine ainsi que la proportion des cellules individuelles ou coloniales. La microscopie inversée nous a permis de déterminer la composition taxonomique des plus grandes formes (nano et microphytoplancton) et de vérifier l identité des populations triées. L emploi et la complémentarité de ces techniques ont aussi permis pour la première fois d avoir pour les lacs Léman, d Annecy et du Bourget une représentation intégrale de la structure et de la dynamique phytoplanctonique entre février et avril 2005 inclus. Des échantillons ont aussi été prélevés en mai et juin mais ils ne sont pas inclus dans ce mémoire. 2. Site d étude et échantillonnage Les prélèvements ont été effectués à raison d une à deux fois par mois pour les trois plus grands lacs naturels français (Figure 2) : le lac Léman (Haute Savoie), le lac du Bourget (Savoie) et le lac d Annecy (Haute Savoie). Les échantillons ont été prélevés avec une bouteille Niskin de 2,5 litres de capacité aux stations de référence qui correspondent à la zone de profondeur maximale pour chaque lac Le lac Léman Le lac Léman (Figure 3) est localisé entre la France et la Suisse (46 27 N, 6 32 E ; altitude 372 m) et constitue une frontière naturelle entre les deux pays. Ce lac d origine glaciaire a une longueur de 72 km, une largeur maximale de 14 km, une surface de 582 km 2 (348 km 2 appartiennent a la Suisse et 234 km 2 a la France) et un volume de 89 km 3, faisant de lui la plus grande réserve d eau douce naturelle d Europe Occidentale. Le Léman est un lac méromictique avec un temps de résidence de l eau d environ 11 ans. Sa profondeur maximale

12 est de 309 m et sa profondeur moyenne est de 152 m (Anneville et Leboulanger, 2001). Ce lac est une importante attraction pour le tourisme, la navigation et la pêche professionnelle et de loisir. Il constitue la principale source d eau de la ville de Genève. A partir de 1960, le lac Léman est passé d un état oligotrophique à un état mesotrophique en raison de l'expansion des activités humaines dans son bassin versant. En 1970, l importance économique du lac a rendu nécessaire de réduire la charge externe en phosphore (P) et entre 1979 et 1998, une diminution de la concentration en P au milieu du lac a été observée (89,5 à 39,6 µg l -1 ) grâce au développement d un programme de contrôle qui est toujours en action sous l égide de la Commission Internationale pour la Protection des Eaux du Léman contre la Pollution (CIPEL) (Anneville et al. 2002a). Dans cette étude, les prélèvements ont été effectués à la station SHL2 (Station d Hydrobiologie Lacustre Point 2) aux profondeurs suivantes : 2,5, 7,5, 10, 15, 20, 25, 30 et 50 m Le Lac du Bourget Le lac du Bourget (Figure 4) est un réservoir d origine glaciaire localisé dans une aire tectoniquement active, dans le basin tertiaire du mollasse sur la périphérie des massifs subalpins et les montagnes de Jura ( N, E ; altitude 231 m). Ce lac a une longueur de 18 km et une largueur maximale de 3,5 km, une surface de 44,62 km 2 et un volume de 3,5 km 3. Il est le plus grand lac naturel entièrement français avec une profondeur maximale de 145 m et une profondeur moyenne de 80 m (Chapron et al. 2002). Les principales entrées d'eau du lac proviennent de deux rivières, la Leysse (au sud) et le Sierroz (à l est) et la sortie se fait par le canal de Savière (au nord), lequel débouche dans le Rhône. Ce lac représente une source d eau potable essentielle pour les villes d Aix, Tresserve et Haute Combe et une attraction touristique importante. Le Bourget est un lac meromictique et le temps de résidence de l eau est d environ 8-10 ans (Vinçon-Leite et al. 1995). Dû à la présence de deux villes importantes en périphérie du lac (Chambéry dans le sud et Aix-les- Bains à l est), le lac du Bourget a subi une eutrophisation de ses eaux des A partir de 1970 un programme de restauration de la qualité de l eau à été mis en route, avec une attention particulière portée au développement et à l amélioration du fonctionnement des stations d épuration. Au cours des vingt dernières années une réduction importante de la concentration en phosphore inorganique a été observée (120 à 26 µg l -1 ). Depuis 1996 et malgré les efforts pour continuer à diminuer la concentration des éléments nutritifs comme le phosphate et les composantes nitrogènes, une prolifération de la cyanobactérie filamenteuse

13 toxique Planktothrix rubescens a été détectée de manière soutenue en été et en automne. Cet événement a interféré dans l utilisation du lac de Bourget comme source d eau potable ainsi que pour le développement des activités comme la pêche (Jacquet et al. 2005a). Pour cette étude, les prélèvements ont été réalisés à la station de référence (point B) aux profondeurs suivantes : 2, 6, 10, 15, 20, 30 et 50 m Le lac d Annecy Le lac d Annecy (Figure 5) est un lac subalpin d origine glaciaire localisé à une altitude de 446 m au nord des Alpes Françaises (45 50 N, 6 40 E). Il est considéré comme le deuxième lac naturel le plus grand de France après le lac du Bourget avec 13,7 km de longueur et 3,1 km de largueur maximale. Ce lac monomictique a une profondeur maximale de 65 m et une surface de 24,5 Km 2. Il est divisé en deux basins (appelés petit lac et grand lac) de profondeur moyenne similaire (41,5 m). Ce lac est considéré comme le plus «propre» de France et est catalogué comme oligotrophique avec une concentration en phosphore inférieure à 10 µg l -1 (David et al ; Masson et al. 2001). En effet, des 1961, le lac d Annecy a été protégé des apports des eaux résiduelles par un égout collecteur périphérique recueillant les réseaux secondaires. Entre 1964 et 1980, le lac a été suivi en continu par le Syndicat Intercommunal du Lac d Annecy (SILA). Depuis 1987, c est la Station d Hydrobiologie Lacustre de l INRA (Thonon-les-Bains), en association avec le SILA, qui est l organisme chargé de ce suivi. Ce lac est caractérisé par une importante production de salmonidés (Masson et al. 2001) et de plusieurs autres espèces de poissons à intérêt économique fort (Domaizon et al. 2003a). Dans cette étude les échantillons ont été prélevés au centre du grand lac aux profondeurs suivantes : 3, 10 15, 20, 25, 30 et 45 m. 3. Méthodes et instruments utilisés 3.1. La cytométrie en flux (CMF) Le cytométre en flux est un appareil qui permet de mesurer de façon simultanée les différentes propriétés de chaque cellule ou particule en suspension dans un liquide. Il permet de déterminer l abondance et de discriminer les populations phytoplanctoniques sur la base de critères comme la taille, le volume, la forme, l indice de réfraction et la fluorescence naturelle de populations homogènes (Hofstraat et al ; Veldhuis et Kraay, 2000).

14 Selon le diagramme détaillé dans la figure 6, les cellules en suspension dans l échantillon à analyser (A) sont soumises à une surpression (B) qui les injecte au centre d une veine liquide (C) ou liquide de gaine (dans ce cas de l eau milliq). Les cellules transportées s alignent les unes derrière les autres et passent une par une à une vitesse de plus de 30 km/h devant le faisceau laser (D) qui induit une excitation de certains composants de la cellule. Les cellules émettent alors des signaux optiques (E) qui sont déviés et sélectionnés par des miroirs dichroïques (F) et des filtres spécifiques (G). Ces signaux sont dus à la fluorescence naturelle des pigments photosynthétiques (chlorophylle, phycoérythrine) et sont alors récoltés par des détecteurs photosensibles (photodiodes ou photomultiplicateurs) (H). Les résultats de l analyse apparaissent sous forme d histogramme monoparamétrique (I) ou sous forme de cytogramme biparamétrique (J) (Métézeau et Delamare, 1988 ; Veldhuis et Kraay, 2000 ; Marie et al. 2000). Pour cette analyse, nous avons utilisé un cytométre en flux de type FACSCalibur (Becton Dickinson). Les analyses ont été faites le même jour ou 12 à 24 heures suivant le prélèvement après conservation des échantillons à 4 C. La méthode utilisée pour la préparation des échantillons était celle préconisée par Marie et al. (2000), en ajoutant 1 µl d une solution de billes préalablement dilués (2 µl de la solution stock dans 2 ml d eau milliq) dans 2 ml d échantillon. Deux configurations ou «set up» ont été utilisées, pour les petites formes (picocyanobactéries): FSC (E01) ; SSC (400) ; FL1 (500) ; FL2 (500) ; FL3 (500) et FL4 (500) avec un temps d acquisition de 3 minutes. Pour les formes plus grosses et moins concentrées (cyanobactéries filamenteuses et formes eucaryotiques): FSC (E00) ; SSC (300) ; FL1 (350) ; FL2 (300) ; FL3 (300) et FL4 (300) avec un temps d acquisition de 6 minutes. Le débit moyen utilisé pour les analyses était de µl/min et il était vérifié et recalculé chaque semaine). Les fichiers «listmodes» obtenus pour chaque acquisition ont été analysés avec le logiciel CYTOWIN (Vaulot, 1989) Isolement et mise en culture des populations triées par cytométrie Le tri est une application du cytométre en flux qui permet de définir des populations cellulaires et de les séparer physiquement de l ensemble de la communauté, de façon à obtenir des groupes plus homogènes quant aux propriétés étudiées. De cette manière, toute cellule dont les caractéristiques étudiées sont comprises dans les paramètres établis sera considérée comme appartenant à la population à isoler. Cette analyse permet l isolement des cellules,

15 généralement sans les endommager, rendant ainsi possible la mise en culture des populations sélectionnées (Métézeau et Delamare, 1988). Le principe de la fonction tri du FACSCalibur a été schématisé dans la figure 6. En supposant que l on veuille isoler les cellules présentes dans le groupe localisé sur la partie supérieure droite du cytogramme FL3/FSC, il faut définir une fenêtre (R1) autour de la population désirée (L). Le système FACSCalibur utilise un dispositif mécanique appelé «catcher tube» (M) qui est localisé près de la chambre d analyse dans le liquide de gaine et qui se déplace dans et hors du fluide contenant les cellules de l échantillon que l on veut collecter. Le rendement du tri est d environ 300 cellules par seconde. Quand les cellules passent devant le faisceau laser (D), le système électronique considère les caractéristiques de la population définie dans la fenêtre et reconnaît quelle est la cellule qui satisfait les conditions de R1 (c'est-à-dire qui exhibe les valeurs de FL3 et FSC établis dans cette fenêtre). La «cellule cible» est alors capturée en accord avec les paramètres présélectionnés et est identifiée comme appartenant à R1. Les cellules qui ne sont pas sélectionnées par le «catcher tube» sont rejettées à la poubelle (K) (Métézeau et Delamare, 1988 ; Métézeau et al ; Reckermann, 2000). Pour cette analyse, la fonction tri du cytométre a été utilisée pour caractériser l ensemble des populations détectées par cytométrie dans les trois lacs étudiées. Dans ce but, le liquide de gaine (l eau milliq) a été remplacé par un mélange de 9 milieux différents disponibles à la station (MWC, L-C, BB, BG-11, ASM1, DV, JAWORSKI, Z+Si+Vitamines, Z). Les échantillons ont été conservés au froid (4 C) et analysés dans les 24 heures suivant le prélèvement. Chaque population d intérêt observée dans les configurations (set up) établies a été triée. Puis, chaque population a été placée dans un flacon de culture Nunclon de 250 ml de capacité (Figure 7), puis mise en chambre de culture dans des conditions homogènes de température (18 C) et de lumière (50-55 µe m -2 s -1 ) grâce à l utilisation d un système ingénieux de route tournante (Figure 8). Le milieu nutritif était renouvelé régulièrement La microscopie à épifluorescence

16 La microscopie à épifluorescence permet d étudier certaines caractéristiques du picophytoplancton ainsi que de mesurer son abondance et sa biomasse dans les eaux marines et douces, grâce à l autofluorescence naturelle des pigments photosynthétiques comme les chlorophylles (chlorophylle a et la divinyl-chlorophyll a) et les phycobilines (phycoérythrine et phycocyanine). Différents groupes picophytoplanctoniques ayant une composition distincte de photopigments peuvent ainsi être identifiés en changeant la longueur d onde d excitation de l appareil (Maclsaac et Stockner, 1993). Dans cette étude, la microscopie à épifluorescence a été utilisée pour l identification et le comptage des picocyanobacteries riches en phycoérythrine (PE) et phycocyanine (PC), ainsi que pour discriminer les formes unicellulaires des formes coloniales. Les picocyanobactéries riches en phycoérythrine fluorescent jaune-orange (émission à nm) sous excitation de lumière bleue ( nm), alors que les picocyanobacteries riches en phycocyanine apparaissent rouge sous excitation de lumière bleue (Crosbie et al. 2003). L observation et le comptage des cellules de picocyanobacteries a été réalisé à l aide d un microscope à épifluorescence (Leitz Wetzlar, Dialux 20) muni d un filtre A sous excitation de lumière bleue (BP , FT510, LP515) et avec un objectif à immersion X100. Le protocole pour la préparation, l observation et le comptage des picocyanobacteries a été réalisé selon la méthodologie de Wetzel et Likens (2000). 15 ml d échantillon ont été utilisés et fixés avec 80 µl de formaldéhyde à 37 % (concentration finale 0,2 %). Chaque échantillon a été filtré avec une pompe à vide sous faible pression. La filtration a consisté à pré-mouiller le support du filtre avec de l eau milliq et à placer un filtre de polycarbonate noir de 0,22 µm de porosité et 25 mm de diamètre avec la face brillante vers le haut. Après la filtration, le filtre à été maintenu dans l air avec une pince pendant 1 minute et a ensuite été placé sur une goutte d huile à immersion sur une lame. Après que le filtre ait adhéré, une autre goutte d huile à été rajouté par-dessus et le tout a été recouvert avec une lamelle (24 x 36 mm). Les lames ont été observées le plus tôt possible et conservées à -22 C. Pour le comptage, au moins 20 champs carrés (100 µm de coté) ont été parcourus où un minimum de 100 cellules de picocyanobactéries a été dénombré pour chaque échantillon. Les formes coloniales (>1 cellule) ont été comptées séparément des formes unicellulaires.

17 Pour le calcul du nombre de cellules par ml (N), la formule suivante a été utilisée : N= (C x A e ) / (n x v x A s ) Où C: nombre d organismes comptés A e : aire filtrée (mm 2 ) obtenue à partir du diamètre du dispositif de filtration (15 mm) n : nombre de champs compté v : volume d échantillon filtré (15 ml) A s : aire d un champ compté (mm 2 ) En plus du comptage, des déterminations des abondances du nombre des cellules par colonie ont été réalisées, afin d estimer les proportions des cellules appartenants à une colonie et celles individuelles. Les profondeurs considérées ont été celles caractéristiques de l épi- et du métalimnion de chacun des lacs, soit pour le lac d Annecy 3, 10 et 15 m, pour le lac Léman 2,5, 10 et 15 m et pour le lac du Bourget 2, 10 et 15 m 3.4. Le microscope inversé L analyse en microscopie inversée a permis de définir la distribution en taille des plus grands groupes phytoplanctoniques ainsi que de caractériser la composition taxonomique et la richesse des espèces où nombre de taxon (S) présents dans les échantillons. La détermination de la composition et de l abondance du nano- et du microphytoplancton a été faite selon la méthode d Utermöhl (1958). Pour cette analyse, 25 ml de chaque échantillon ont été fixés avec 5 gouttes d une solution de lugol, mis à sédimenter dans une chambre de sédimentation pendant au moins 24 h et puis analysés sous microscope. Les profondeurs considérées ont été les mêmes que celles pour l analyse au microscope à épifluorescence. L identification taxonomique a été faite jusqu'à l espèce quand cela était possible selon les critères de Margalef (1955); Yacubson (1969); Bicudo et Bicudo (1970); Yacubson (1974); Bürgi (1979); Tchobanoglous et Schroeder (1980); Yacubson (1980); Parra et al. (1982); Caljon (1983); Alvarez-Cobelas et Gallardo (1988); Gonzalez de Infante et Riehl (1992). Les comptages ont été réalisés en considérant pour chaque organisme, qu il soit sous forme unicellulaire, colonial ou filamenteux, le nombre réel de cellules par individu.

18 Pour évaluer la structure de la communauté phytoplanctonique pour chaque lac, les indices écologiques suivants ont été utilisés (Margalef, 1980) : a) Indice de diversité de Shannon-Wiener (H') : H' = -Σ p i x log 2 p i H' = -Σ(n i /N).x log 2 (n i /N) Où p i : est la proportion de l'espèce i dans l'échantillon total de la population N = nombre total d'individus de toutes les espèces dans l'échantillon n i = nombre d'individus d'une espèce dans l'échantillon H' varie de 0 (seulement une espèce) jusqu'à log 2 S (quand toutes les espèces ont une abondance similaire). Une valeur élevée de H' caractérise un système stable et balancé. Des valeurs basses de H' sont obtenues quand l abondance relative d un taxon n est pas balancé et peu de taxa dominent le reste des espèces (Domaizon et al. 2003b). b) Indice d équitabilité (E): représente la relation entre la diversité observée et la diversité théorique maximale E = H' / log 2 S Où H' = Indice de diversité de Shannon-Wiener S = nombre total d espèces L équitabilité varie entre 0 et 1. Quand une espèce est dominante, la valeur de E est proche de 0. Quand tous les taxa sont représentés de manière égale, E est proche de 1 (Domaizon et al. 2003b).

19 RESULTATS Dans cette section, le choix a été fait de présenter les résultats à partir de chacune des techniques utilisées. 4. Microscopie Inversée 41 échantillons provenant des lacs Léman, d Annecy et du Bourget à trois profondeurs différentes localisées dans l épilimnion et le métalimnion ont été analysés Abondance du nano- et du microphytoplancton Les valeurs d abondance du phytoplancton obtenues dans le lac Léman (Figure 9A) ont oscillé entre 708 et cell.ml -1 avec une valeur moyenne de 4909 cell.ml -1. La valeur maximale a été observée à 2,5 m de profondeur le 26 avril alors que la valeur minimale a été observée à 15 m le 08 mars. Pour le lac du Bourget, l abondance du phytoplancton (Figure 9B) variait entre 238 et cell.ml -1, avec une valeur moyenne de 2518 cell.ml -1 soit donc une abondance deux fois moindre que celle enregistrée pour le Léman. La valeur maximale a été observée à 2 m de profondeur le 05 avril alors que la valeur minimale a été observée à 10 m le 08 février. Dans le lac d Annecy les abondances du phytoplancton (Figure 9C) ont oscillé entre 492 et 5995 cell.ml -1 avec une valeur moyenne de 2333 cell.ml -1, presque comparable à celle du Bourget. La valeur maximale a été observée à 3 m de profondeur le 25 avril pendant que la valeur minimale a été observée à 3 m le 08 février Richesse Spécifique Dans le lac Léman (Figure 10A) ont été identifiés entre 25 taxa le 04 avril à 15 m de profondeur et 38 taxa dans le même prélèvement à 2,5 m. En moyenne et sur la période étudiée, 29 taxa ont été observés dans ce lac. Pour le lac du Bourget (Figure 10B), la richesse minimale était de 20 taxa le 08 février à 10 m alors que la valeur maximale à été de 42 taxa trouvés à 2 m de profondeur le 05 avril. La valeur moyenne était de 32 taxa. Pour le lac d Annecy (Figure 10C), la valeur minimale de richesse spécifique a été de 21 taxa à 3 m de

20 profondeur le 08 février alors que la valeur maximale était de 39 taxa le 15 mars à 10 m de profondeur. La valeur moyenne était de 30 taxa Composition taxonomique du nano- et du microphytoplancton (Annexe 1) Lac Léman Dans le lac Léman ont été identifiés : 15 genres et 13 espèces de diatomées ; 2 genres et 1 espèce de cryptophycées ; 5 genres et 2 espèces de chrysophycées ; 9 genres et 6 espèces de cyanophycées ; 3 genres d euglenophycées ; 16 genres et 8 espèces de chlorophycées ; 3 genres et 2 espèces de dinoflagellés, 4 genres et 2 espèces de conjuguées. Selon la figure 11, la composition des espèces phytoplanctoniques du Léman a expérimenté une succession marquée. A la profondeur de 2,5 m (Figure 11A), la cyanobactérie Pseudoanabaena limnetica, la conjuguée Mougeotia gracillima et la chlorophycée Chlorella vulgaris étaient prédominantes le 07 février et le 08 mars. Puis, la diatomée Stephanodiscus minutulus devient l espèce dominante dans les prélèvements du 21 mars au 04 avril, représentant 45,2 et 66 % de l abondance totale, respectivement. Dans l échantillon du 21 mars, la cyanobactérie Planktothrix rubescens était aussi importante bien que dans une proportion inférieure (13,3 %). Le 26 avril, il y avait prédominance de la cryptophycée Rhodomonas minuta (48,4 %) ainsi que la réapparition d P. limnetica (20 %), C. vulgaris (14,5 %) et S. minutulus (10,2 %). A 10 m de profondeur (Figure 11B), il y avait une différence considérable dans la proportion de la composition spécifique par rapport a la profondeur de 2 m. P. limnetica dominait pendant toute la période d étude avec une valeur minimale de représentativité de 27 % le 21 mars et une valeur maximale de 59 % le 04 avril. Les autres espèces prédominantes pour les prélèvements du 07 février et du 08 mars, étaient M. gracillima (19,2 et 12,2 %, respectivement) et Planktothrix rubescens (25 et 10,4 %, respectivement). Le 21 mars, prédominait S. minutulus (18,9 %), la cyanobactérie coloniale Aphanocapsa sp (16,6 %) et la diatomée Asterionella formosa (6,6 %). Les diatomées S. minutulus et A. formosa contribuaient à l abondance totale du 04 avril à raison de 18,3 et 7,3 % du total, respectivement. Dans le prélèvement du 26 avril S. minutulus (28,8 %) et C. vulgaris (19,8 %) prédominaient.

21 A 15 m de profondeur (Figure 11C) des différences évidentes étaient encore enregistrées par rapport aux profondeurs précédentes. En raison de la perte de l échantillon du 08 février, les résultats n ont été considérés qu à partir du 08 mars où l on remarquait la prédominance de M. gracillima (32,4 %), P. limnetica (31 %), S. minutulus (20,9 %) et C. vulgaris (9,4 %). Dans le prélèvement du 21 mars on constate que les espèces les plus représentatives étaient P. limnetica (22,8 %), M. gracillima (17,5 %), la diatomée Aulacoseira islandica (17,4 %), S. minutulus (14,3 %) et Aphanocapsa sp (10,4 %). Pour le 04 avril on observait une prépondérance de P. limnetica (65,2 %), ainsi que de S. minutulus (14,2 %) et A. formosa (6 %). Pour le prélèvement du 26 avril, P. limnetica (53 %), S. minutulus (18,6 %) et C. vulgaris (11,6 %) étaient les espèces principales Lac du Bourget Dans le lac du Bourget ont été identifiés : 17 genres et 15 espèces de diatomées ; 2 genres et 1 espèce de cryptophycées ; 5 genres et 4 espèces de chrysophycées ; 10 genres et 6 espèces de cyanobactéries ; 1 genre d euglenophycées ; 14 genres et 8 espèces de chlorophycées ; 3 genres et 2 espèces de dinoflagellés, 3 genres et 1 espèce de conjuguées ; 2 genres et 2 espèces de xanthophycées. Selon la figure 12A, on constate qu à 2 m de profondeur, Planktothrix rubescens prédominait dans les prélèvements du 08 février (52,8 %), du 2 mars (51,8 %), du 15 mars (29,9 %) et du 20 avril (37,2 %). Le 08 février prédominait aussi Pseudoanabaena limnetica (31,6 %). Le 02 mars, les autres espèces importantes étaient Chlorella vulgaris (9,4 %) et Stephanodiscus minutulus (8,4 %). Pour le 15 mars, c était S. minutulus (31,7 %), ainsi que les cryptophycées Rhodomonas minuta (9,2 %) et Cryptomonas sp (8,7 %). Dans le prélèvement du 05 avril la diatomée S. minutulus prédominait avec une représentativité de 45,8 % ainsi que Asterionella formosa (13,3 %), la chrysophycée Erkenia subaequiciliata (10,2 %) et Rhodomonas minuta (7,5 %). Dans l échantillon du 20 avril prédominaient aussi C. vulgaris (25,5 %), E. subaequiciliata (13 %) et la diatomée Diatoma tenuis (8,8 %). A 10 m (Figure 12B), la prédominance de Planktothrix rubescens était encore plus évidente qu à 2 m, principalement dans le prélèvement du 08 février où elle représentait 79,5 % de l abondance totale. Le même jour, S. minutulus, la seconde espèce la plus importante, ne représentait que 6,4 % de l abondance totale. Dans le prélèvement du 02 mars prédominaient

22 C. vulgaris (34,3 %), P. rubescens (31,9 %), S. minutulus (9 %) et R. minuta (7,5 %). Le 15 mars, on constatait à nouveau la prédominance de P. rubescens (33,8 %) et une augmentation de l abondance de S. minutulus (31,2 %), ainsi que la parution d Aulacoseira islandica (13 %) et la présence constante de C. vulgaris (9,8 %). Le 05 avril on observait une proportion équitable entre les différentes espèces, représentées par P. rubescens (20,3 %), S. minutulus (15,1 %), A. formosa (15 %), C. vulgaris (12,3 %), Aphanocapsa sp (10,7 %), R. minuta (8,4 %) et E. subaequiciliata (5,7 %). Pour le prélèvement du 20 avril C. vulgaris (42,1 %), Diatoma tenuis (22,3 %), E. subaequiciliata (11,3 %) et P. rubescens (5,6 %) étaient majoritaires. A 15 m de profondeur (Figure 12C), on observait le 08 février, une prédominance de la cyanobactérie coloniale Aphanocapsa sp (66,1 %) et de P. rubescens (18,6 %). Le 02 mars, Aphanocapsa sp (59,5 %), C. vulgaris (12,1 %) et Fragilaria crotonensis (8,7) étaient les espèces les plus abondantes. Le 15 mars, il y avait une augmentation importante de la proportion de P. rubescens (73,8 %) et de S. minutulus (13,6 %). Le 05 avril la structure communautaire avait le même profil qu a 10 m, bien que P. rubescens était absent mais avec la prédominance de C. vulgaris (22,5 %), S. minutulus (21,9 %), E. subaequiciliata (16,2 %), A. formosa (12,3 %), Cryptomonas sp (9,2 %) et Rhodomonas minuta (9 %). Le 20 avril, les espèces prédominantes étaient P. rubescens (36,4 %), C. vulgaris (16,5 %), D. tenuis (14 %), E. subaequiciliata (8,5 %) et A. formosa (5,9 %) Lac d Annecy Dans le lac d Annecy ont été identifiées : 14 genres et 10 espèces de diatomées ; 2 genres et 1 espèce de cryptophycées ; 4 genres et 4 espèces de chrysophycées ; 13 genres et 6 espèces de cyanobactéries ; 1 genre et 1 espèce d euglenophycées ; 11 genres et 7 espèces de chlorophycées ; 2 genres et 3 espèces de dinoflagellés, 2 genres et 1 espèce de conjuguées ; 1 genre et 1 espèce de xanthophycée. La composition spécifique du phytoplancton dans le lac d Annecy (Figure 13A) était représentée à 3 m de profondeur par la diatomée Fragilaria crotonensis et la cyanobactérie coloniale Aphanocapsa sp, lesquelles prédominaient pendant toute la période d étude. Le 08 février F. crotonensis (58,1 %), Rhodomonas minuta (12,4 %) et Cryptomonas sp (9,3 %) prédominaient. Le 15 mars, les espèces les plus abondantes étaient Aphanocapsa sp (35 %),

23 F. crotonensis (26,4 %), Stephanodiscus minutulus (13,4 %) et Erkenia subaequiciliata (6,4 %). Le 12 avril, il s agissait de Aphanocapsa sp (35 %), F. crotonensis (34,6 %), ainsi que des chrysophycées Dinobryonsociale (7,2 %) et D. divergens (5,1 %). Dans le prélèvement du 20 avril on observe que les espèces les plus représentatives étaient Aphanocapsa sp (38,5 %), F. crotonensis (20,6 %), D. sociale (19,2 %), D. bavaricum (7,2 %) et D. divergens (6,6 %). A 10 m (Figure 13B), on observait une composition similaire du phytoplancton que celle à 2 m, avec cependant une dominance supérieure d Aphanocapsa sp. Dans le prélèvement du 08 février, Aphanocapsa sp (60,7 %) et F. crotonensis (21,2 %) dominaient. Pour le 15 mars prévalaient Aphanocapsa sp (53,1 %), F. crotonensis (16,7 %) et S. minutulus (10,3 %). Le 12 avril on observait la prédominance de Aphanocapsa sp (58 %) et F. crotonensis (27,9 %). Pour le prélèvement du 25 avril les espèces les plus représentatives étaient D. sociale (35,1 %), F. crotonensis (27,7 %), Aphanocapsa sp (20,3 %) et D. bavaricum (7,2 %). A 15 m (Figure 13C), les espèces les plus représentatives le 08 février étaient Aphanocapsa sp (76,5 %), Rhodomonas minuta (6,7 %) et S. minutulus (5,1 %). Dans le prélèvement du 15 mars, il s agissait de F. crotonensis (39 %), Aphanocapsa sp (34,2 %) et S. minutulus (8,2 %). Pour le prélèvement du 12 avril, F. crotonensis (39,1 %) et Aphanocapsa sp (38,6 %) étaient les plus représentatives. Le 25 avril, une représentativité plus équitable des espèces prédominantes était observée pour les trois profondeurs analysées Diversité Spécifique La valeur maximale de l indice de diversité dans le lac Léman (Figure 14A) était de 3 bits.ind -1 le 21 mars aux profondeurs de 10 et 15 m et la valeur minimale était de 1,5 bits.ind -1 le 8 février à 15 m. En considérant les trois profondeurs pendant tout la durée du prélèvement, la valeur moyenne de l indice de diversité était de 2,41 bits.ind -1 et on observait une tendance légère à la décroissance de cette indice dans les dernières prélèvements. Pour le lac du Bourget (Figure 14B), la valeur maximale de l indice de diversité était de 3,3 bits.ind -1 a 10 m de profondeur le 05 avril alors que la valeur minimale était de 1,3 bits.ind -1 le 08 février à 10 m. La valeur moyenne de diversité obtenue dans ce lac aux trois

24 profondeurs pendant toute la durée du prélèvement était de 2,37 bits.ind -1 et on observait une tendance nette à l augmentation de cet indice vers les dernières prélèvements. Dans le lac d Annecy (Figure 14C) la valeur maximale de l indice de diversité était de 2,9 bits.ind -1 à 15 m le 25 avril alors que la valeur minimale était de 1,5 bits.ind -1, aussi à 15 m le 08 février. La valeur moyenne de diversité était de 2,23 bits.ind -1 aux trois profondeurs pendant toute la durée du prélèvement, avec les valeurs les plus faibles de cet indice par rapport aux lacs Léman et du Bourget Equitabilité La valeur maximale de l indice d équitabilité (Figure 15A) dans le lac Léman était de 0,63 le 21 mars à la profondeur de 15 m et la valeur minimale a était de 0,41 le 04 avril à 15 m. En considérant les trois profondeurs pendant toute la durée de l étude, la valeur moyenne d équitabilité était de 0,5. Pour le lac du Bourget la valeur maximale de l indice d équitabilité (Figure 15B) était de 0,67 a 10 m de profondeur le 05 avril alors que la valeur minimale était de 0,30 le 08 février à 10 m. La valeur moyenne d équitabilité obtenue dans ce lac aux trois profondeurs pour toute la durée de l étude était de 0,48. Dans le lac d Annecy (Figure 15C) la valeur maximale de l indice d équitabilité était de 0,56 à 15 m le 25 avril alors que la valeur minimale était de 0,32, comme à 15 m le 08 février. La valeur moyenne de diversité était de 0,46 aux trois profondeurs pour toute la durée de l étude. 5. Microscopie à Epifluorescence Afin d estimer l abondance des picocyanobactéries ainsi que la proportion des cellules riches en phycoérythrine et celles riches en phycocyanine, 42 lames contenant des échantillons des lacs Léman, d Annecy et du Bourget à trois profondeurs différentes ont été analysées au microscope à épifluorescence.

25 5.1. Proportion des picocyanobactéries riches en phycoérythrine Aucune cellule riche en phycocyanine n a été trouvée au cours de cette étude quelque soit le lac ou la profondeur considérés Abondance des picocyanobactéries Les valeurs d abondance des picocyanobactéries obtenues dans le lac Léman (Figure 16A) ont oscillé entre 12 et 247 cell.ml -1, avec une valeur moyenne entre 2,5 et 15 m de 81 cell.ml -1. La valeur maximale a été observée à 10 m de profondeur le 07 février alors que la valeur minimale a été observée à 2,5 m le 08 mars. Dans le lac du Bourget (Figure 16B), l abondance minimale des picocyanobactéries était de 3 cell.ml -1 à 10 m de profondeur le 02 mars et la valeur maximale à été de 276 cell.ml - 1 le 05 avril à 2 m. L abondance moyenne pour les trois profondeurs à été de 49 cell.ml -1. C est dans le lac d Annecy (Figure 16C), que les abondances en picocyanobactéries ont été les plus élevées, variant entre 482 cell.ml -1 observées à 10 m le 25 avril et 1831 cell.ml -1 observées le 15 mars à 3 m de profondeur. La valeur moyenne pour les trois profondeurs a été de 962 cell.ml Proportion des formes picocyanobactériennes unicellulaires et coloniales Lac Léman La figure 17A nous révèle que la proportion la plus élevée de picocyanobactéries coloniales (78 %) à 2,5 m de profondeur a été trouvée le 07 février. Cependant, il faut considérer que dans un total de 167 cell.ml -1, il y avait seulement 5 colonies, dont 4 constituées par seulement 2 individus et 1 colonie constituée par 91 individus. Pour le reste de l étude il y avait prédominance de cellules individuelles qui représentaient entre 78 et 100 % de l abondance totale. A 10 m (Figure 17B) on observait aussi une prédominance des cellules coloniales (85 %) le 07 février, avec des colonies constituées par un maximum de 94 individus, alors que par la suite, la proportion de cellules individuelles oscillait entre 70 et 98% de l ensemble. La

26 proportion la plus élevée de cellules individuelles a été obtenue le 26 avril. A 15 m (Figure 17C), on observe que la proportion la plus élevée de picocyanobactéries coloniales a été observée le 08 mars (50 %) mais avec seulement 22 cell.ml -1. La proportion la plus élevée de cellules individuelles a été trouvée le 26 avril (98%) Lac du Bourget A 2 m (Figure 18A), on observait une prédominance des cellules individuelles pendant toute la période d étude, avec des proportions variant entre 58 % le 05 avril et 100 % le 08 février. Les cellules coloniales représentaient des proportions inférieures (27-42 %). A 10 m (Figure 18B), la proportion des cellules individuelles était supérieure à celle des formes coloniales, qui variait entre 55 % et 100 % de l abondance totale des picocyanobactéries. Seulement le 20 avril, on observait une prédominance de cellules coloniales (69 %). A la profondeur de 15 m (Figure 18C), il y avait une remarquable prépondérance des cellules individuelles avec des proportions qui oscillaient entre 75 et 100 % pendant toute la période d étude Lac d Annecy Comparativement aux 2 autres lacs, le lac d Annecy était caractérisé par la prédominance de cellules coloniales aux trois profondeurs analysées. A 3 m (Figure 19A) on observait une proportion maximale de 93 % d individus appartenant à une colonie le 25 avril (avec des colonies constituées par un maximum de 897 individus), et une proportion minimale de 45 % le 15 mars (maximum de 110 individus par colonie). Par ailleurs, les cellules individuelles étaient bien représentées le 15 mars et le 12 avril avec des pourcentages de 55 et 52 %. A 10 m de profondeur (Figure 19B), la proportion la plus élevée de cellules coloniales (73 %) a été enregistrée le 08 février (avec un maximum de 110 individus par colonie). Alors que la proportion minimale a été observée le 12 avril (33 %) avec un maximum de 82 individus par colonie. A 15 m (Figure 19C) on observait une proportion maximale des cellules coloniales le 15 mars (avec 105 individus par colonie) et une valeur minimale le 12 avril (68 et 23 %, respectivement), avec un valeur maximale de 48 individus par colonie.

27 Par rapport aux lacs Léman et Bourget, les abondances de picocyanobactéries dans le lac d Annecy sont significativement plus élevées pendant toute la période d étude. En conséquence, les proportions des cellules coloniales et individuelles sont plus représentatives. 6. Cytométrie en Flux 6.1. Abondances du picocyanobactéries, des différents eucaryotes sans phycoérythrine (PE) et des grosses cellules riches en phycoérythrine (cryptophycées et cyanobactéries filamenteuses). Dans cette analyse 103 échantillons étaient analysés pour les trois lacs à plusieurs profondeurs : 8 au Léman, 7 au Bourget et 7 à Annecy Lac Léman Dans la figure 20A on observait l existence de deux pics d abondance des picocyanobacteries. Le premier pic était observé le 04 avril à 2,5 m avec cell.ml -1, alors que le deuxième pic était observé le 26 avril à la même profondeur que le premier, avec une abondance de 8107 cell.ml -1. Une certaine homogénéité des abondances des picocyanobacteries était observée entre le 07 février et le 21 mars dans toute la colonne d eau. Puis, entre le 04 et 26 avril une diminution des abondances était enregistrée avec la profondeur. Pour les eucaryotes sans PE (Figure 20B), on observait un pic très élevé le 04 avril avec une abondance de cell.ml -1, probablement représenté par la diatomée Stephanodiscus minutulus qui était l eucaryote le plus abondante pour cet date (Figure 11A). On observait aussi qu entre le 21 mars et le 26 avril, les abondances de ces eucaryotes étaient plus élevées en surface et que celles-ci diminuaient avec la profondeur. Entre le 07 février et le 08 mars, on observait une homogénéité dans les abondances de ces eucaryotes par rapport à la profondeur comme dans le cas des picocyanobactéries. Pour les groupes riches en phycoérythrine (cyanobactéries filamenteuses et cryptophycées), on observait une dynamique similaire a celle des picocyanobactéries et des eucaryotes (Figure 20C). On remarquait une homogénéité des faibles abondances dans l ensemble de la colonne d eau du 07 février au 21 mars, ainsi qu un léger pic a 2,5 m le 04 avril avec 4229 cell.ml -1 et un pic très élevé le 26 avril avec cell.ml -1 aussi a 2,5 m. Il

28 s agissait fort probablement de la cryptophycée Rhodomonas minuta et de la cyanobactérie filamenteuse Pseudoanabaena limnetica (Figure 11A) Lac du Bourget L abondance la plus élevée enregistrée pour les picocyanobactéries était de 7057 cell.ml -1, à 2 m de profondeur le 05 avril (Figure 21A). Les abondances les plus élevées étaient trouvées dans les deux prélèvements du mois d avril, alors que les plus faibles étaient observées entre le 08 février et le 15 mars avec une légère tendance à l augmentation entre ces 2 dates. Les abondances des eucaryotes sans PE étaient élevées dans le lac du Bourget (Figure 21B), particulièrement le 05 avril à 2 m de profondeur, avec un pic d abondance à cell.ml -1 ). Il était lié probablement à la prédominance observée le même jour de la diatomée Stephanodiscus minutulus (Figure 12A). En général, on observait que par rapport aux prélèvements du 05 et du 20 avril, les abondances entre le 08 février et le 15 mars étaient faibles. Dans la figure 21C, on observait que l abondance la plus élevée trouvée pour les cellules riches en phycoérythrine était le 05 avril à 2 m, avec une concentration de 3867 cell.ml -1 et une diminution progressive de la concentration des cellules avec la profondeur. Dans ce prélèvement, étaient présentes, la cryptophycée Rhodomonas minuta et la cyanobactérie filamenteuse Planktothrix rubescens (Figure 12A), organismes très riches en phycoérythrine. Pour les prélèvements entre le 08 février et le 15 mars, ainsi que le 20 avril, les abondances étaient très homogènes dans toute la colonne d eau Lac d Annecy C est dans le lac d Annecy, que les abondances de picocyanobacteries les plus élevées ont été enregistrées pendant toute la période d étude (Figure 22A), particulièrement le 12 avril aux profondeurs de 3 et 10 m (avec et cell.ml -1, respectivement). A la différence des lacs Léman et du Bourget, les abondances des picocyanobacteries étaient aussi très homogènes entre 3 et 50 m.

29 Pour les eucaryotes sans PE (Figure 22B), les abondances les plus élevées étaient observées le 12 et le 25 avril à 3 m (6133 et 6397 cell.ml -1 respectivement), et les espèces majoritaires étaient alors la diatomée Fragilaria crotonensis et 3 espèces de la chrysophycée Dinobryon(Figure 13A). Les abondances les plus faibles pour ce groupe (428 cell.ml -1 ) étaient trouvées le 08 février à 50 m de profondeur. Pour les grosses cellules riches en phycoérythrine (Figure 22C), les abondances étaient très faibles pendant toute la période d étude, avec un maximum de 445 cell.ml -1 le 15 mars à 50 m et une minimum de 112 cell.ml -1 le 25 avril à 30 m. 7. Proportion des trois principales classes de taille : pico- nano et microphytoplancton Pour cette analyse, ont été considérés les valeurs d abondance du picophytoplancton obtenues avec la cytométrie en flux et celles du nano- et du microphytoplancton obtenues avec la microscopie inversée. Chaque colonie ou filament de cyanobactérie a été considéré comme un individu (et non sous la forme du nombre de cellules total) afin de raisonner à partir de la proportion de chacune des espèces en lien avec le statut trophique de l écosystème Lac Léman Dans la figure 23A, on remarque qu a 2,5 m il y avait une prédominance du picophytoplancton dans le prélèvement du 07 février (72,1 %), du 08 mars et du 04 avril. Cependant, le nanophytoplancton était le deuxième groupe prédominant avec des proportions maximales entre le 21 mars et le 26 avril (avec 60,5 % et 56,7 %, respectivement). Ces proportions élevées du nanophytoplancton étaient dues principalement à la présence de Stephanodiscus minutulus, Rhodomonas minuta et Chlorella vulgaris. A 10 m on observait une prédominance du picophytoplancton pendant toute la période d étude (Figure 23B), avec une proportion maximale le 07 février (72,5 %). Par contre, le 04 avril il y avait une répartition équitable entre les trois groupes de taille. On observait également à 15 m, la prédominance du picophytoplancton pendant toute la période d étude avec des proportions comprises entre 53,1 % le 21 mars et 63,6 % le 26 avril (Figure 23C).

30 7.2. Lac du Bourget A 2 m on observait une prédominance du microphytoplancton le 08 février (Figure 23D), mais dans le mois de mars, le picophytoplancton devienne le groupe le plus prédominant avec des proportions qui oscillaient entre 50 et 72,9 %. En avril, on remarquait une augmentation dans la proportion du nanophytoplancton partagée avec une importante représentation du picophytoplancton. A 10 m, il y avait une dominance du picophytoplancton (54,15 et 85,5 %) pendant toute la période d étude (Figure 23E), sauf le 02 mars où la prédominance de nanophytoplancton était évidente (59,6 %) et constitué par Chlorella vulgaris, Stephanodiscus minutulus, Rhodomonas minuta et Erkenia subaequiciliata. A 15 m (Figure 23F), il y avait une proportion plus élevée du picophytoplancton pendant toute la période d étude (37,7 et 74,7 %). Mais, il y a aussi une prédominance importante du microphytoplancton entre le 08 février et le 02 mars (30,5 et 30,3 %, respectivement), ainsi que des proportions équitables des trois groupes le 02 mars Lac d Annecy A 3 m (Figure 23G), on observait une prédominance du picophytoplancton avec une proportion maximale de 98,3 % le 15 mars et une valeur minimale de 84,62 % le 25 avril, du à une augmentation des abondances des espèces de plus grande taille appartenant au microphytoplancton (15,1 %): Asterionella formosa et Dinobryon sociale, D. bavaricum et D. divergens. A 10 m de profondeur (Figure 23H) on remarquait une prépondérance du picophytoplancton pendant toute la période d étude avec une proportion maximale de 97,4 % le 12 avril et un minimum de 87 % le 25 avril, du également à une augmentation de la proportion du microphytoplancton 12,6 %, représenté par les mêmes espèces citée plus haut. A 15 m (Figure 23I) on observait la prédominance du picophytoplancton avec une proportion maximale de 97,6 % le 12 avril et un minimum de 95,4 % le 25 avril (Figure 13C).

31 Il était originellement prévu de comparer dans le détail les données de la microscopie a épifluorescence et celles données par la cytométrie en flux. Il était aussi prévu de s intéresser finement à l ensemble des résultats très originaux portant sur le tri et l identification des populations mises en culture. Pour des questions de temps et d espace dans le mémoire et parce que tous ces résultats n ont pas encore été analyses et/ou exploites, ces éléments de l étude ne sont donc pas développés ici. Ces résultats seront en partie exposés lors de la soutenance orale du 27 juin à Paris.

32 DISCUSION A partir des résultats obtenus et malgré la période extrêmement courte de cette étude (3 mois), il a été possible de montrer que la dynamique phytoplanctonique des lacs Léman, du Bourget et d Annecy était totalement distincte, fortement dépendante de la variation saisonnière, et fortement tributaire de la profondeur dans chaque lac. Des comportements similaires entre le lac Léman et le lac du Bourget ont été observés quant au profil vertical des picocyanobactéries, des cyanobactéries filamenteuses et des formes eucaryotiques avec toutefois une composition des espèces phytoplanctoniques typique et indépendante pour chaque hydrosystème, caractérisé par une dominance constante d une ou plusieurs espèces. La différence de structure et de la dynamique phytoplanctonique entre ces deux derniers lacs et le lac d Annecy était particulièrement marquée. Cette étude nous a permis de mieux comprendre l état trophique de ces écosystèmes, du moins entre la fin de la saison hivernale et le milieu du printemps, une période clef dans le fonctionnement lacustre. Phytoplancton et état trophique des lacs Léman, du Bourget et d Annecy Dans le lac Léman, la présence au début de l année (saison hivernale) de Mougeotia gracillima, espèce caractéristique des milieux mésotrophes, trouve son explication dans sa forte compétitivité pour le phosphore, sa résistance au broutage et à la sédimentation. Il est possible que sa disparition en avril puisse être liée à la diminution de la disponibilité de certains nutriments, comme par exemple le nitrate (Salmaso, 2000), associée à une compétitivité moindre vis-à-vis des plus petites formes phytoplanctoniques. En effet, des espèces de petite taille comme Chlorella vulgaris, Stephanodiscus minutulus et Rhodomonas minuta ont expérimenté une augmentation importante de leur abondance entre les mois de mars et avril, en coïncidence avec la période de transition hiver-printemps. Cette tendance à l agrégation d espèces caractéristiques des milieux meso-eutrophes (avec Chlorella vulgaris, Stephanodiscus minutulus, Rhodomonas minuta) et eutrophes (Pseudoanabaena limnetica), était donc marqué dans le lac Léman en accord avec la littérature (Reynolds, 1998). A la même période, dans le lac du Bourget, les espèces les plus représentatives étaient également caractéristiques des milieux meso-eutrophes (avec Asterionella formosa, Stephanodiscus minutulus, Erkenia subaequiciliata, Chlorella vulgaris, Diatoma tenuis) et eutrophes (Planktothrix rubescens, Pseudoanabaena limnetica) (Reynolds, 1998). Dans le lac d Annecy, une espèce prédominante était Fragilaria crotonensis, diatomée caractéristique de milieux oligo-mesotrophes (Dasy et al. 1998) et des périodes de mélange (brassage) de la

33 colonne d eau (Büsing, 1998). Il semble ici que sa prédominance était plutôt due à la transparence de l eau et a la faible profondeur de ce lac. Au mois d avril apparaissait la chrysophycée Dynobrion, une espèce mixotrophe typique des systèmes oligotrophes (Domaizon et al. 2003b) et donc adaptée aux faibles concentrations en nutriments (Anneville et al. 2002b). L autre espèce prédominante pendant toute la période d étude était Aphanocapsa sp, une cyanobactérie coloniale cosmopolite, largement distribuée dans les lacs des régions tempérées d Europe de statut trophique comparable au lac d Annecy (Komarek et Anagnostidis, 1999). Une première conclusion à ce travail est donc qu il est apparu clairement que ces trois mois d analyses suffisaient à révéler pour les lacs Léman et du Bourget un état trophique encore riche en dépit des efforts de restauration consentis pour ces deux lacs qui ont vu baisser les concentrations en phosphore pendant ces 20 dernières années de µg/l à environ 30 µg/l (Anneville et al ; Jacquet et al. 2005a). De la même manière, les espèces majoritaires observées sur le lac d Annecy confortaient son statut oligotrophe en accord avec les paramètres classiques comme la concentration en phosphore (<10 µg/l). Les valeurs de diversité, d équitabilité et de richesse ont montré une variation au cours du temps et entre les écosystèmes étudiés. A Annecy ont été obtenues les valeurs de diversité et de richesse les plus faibles. Dans les trois lacs l équitabilité était très faible du a la dominance des certains espèces. Selon les théories reliant la diversité à la productivité ou aux perturbations qui caractérisent les écosystèmes, il est attendu que la plus grande diversité soit relié à un état productif ou perturbé intermédiaire (Polishchuk, 1999). Il n est donc pas étonnant de prime abord que le lac d Annecy soit caractérisé par une diversité relativement faible comparativement aux deux autres écosystèmes, et cette faible diversité pourrait être reliée à la pauvreté en nutriments de cet écosystème. Comparaison des abondances de picocyanobactéries déterminées par cytométrie en flux et par microscopie à épifluorescence En comparant les abondances des picocyanobactéries estimées par cytométrie en flux et par microscopie à épifluorescence, même si aucune analyse statistique n a été utilisée pour confronter les résultats obtenues avec les deux méthodes, il est apparu très clairement que les valeurs obtenues par cytométrie en flux étaient plus fiables et plus représentatives des abondances réellement présentes dans le milieu aquatique. Les biais liés à la microscopie sont

34 multiples, mais le principal est qu il aurait fallut filtrer des quantités d eau supérieures pour obtenir des valeurs d abondances plus représentatives (Duhamel, 2004). Dès lors, les proportions des cellules individuelles et coloniales obtenues par microscopie à épifluorescence n étaient probablement pas très représentatives si l on considère les valeurs des abondances presque négligeables de picocyanobactéries observées dans les lacs Léman et Bourget. Pourtant, la présence de certaines colonies constituées par un nombre important d individus fait que la proportion de cellules appartenant à une colonie peut paraître dominante dans ces deux lacs. La microscopie à épifluorescence a permis néanmoins d observer de manière claire des différences importantes entre les lacs quant à la présence des cellules coloniales ou individuelles. Pour le lac d Annecy, les formes coloniales étaient beaucoup plus représentatives. Cette différence entre ces écosystèmes pourrait être interprétée comme un signe de bon état trophique du lac d Annecy, puisque il a été suggéré que la dynamique saisonnière des formes coloniales dans les lacs oligotrophes puisse être directement mise en rapport avec des faibles concentrations en nutriments (Stockner et Shortreed, 1994). Si l on considère les études récentes qui font référence aux faibles concentrations de phosphore dans le lac d Annecy (David et al ; Masson et al. 2001), les résultats obtenus ici confirment, encore une fois, du point de vue biologique le caractère oligotrophe de cet écosystème. Pour les lacs Léman et du Bourget, les abondances picocyanobactériennes individuelles aux trois profondeurs étaient généralement inférieures à celles trouvées dans le lac d Annecy. Si l on pose comme hypothèse que les picocyanobactéries sont généralement plus abondantes dans les systèmes pauvres en nutriments et qu elles répondent négativement a l augmentation de la concentration en éléments nutritifs, en particulier le phosphore (Schallenberg et Burns, 2001), il nous est encore possible de caractériser ces écosystèmes à partir de cette communauté. Les concentrations enregistrées pour les lacs Léman et du Bourget étaient quand même importantes si bien que l on peut suggérer que ces lacs, caractérisés pendant longtemps comme mésotrophes, connaissent une amélioration de la qualité de leurs eaux. Dynamique des populations picocyanobactériennes, des différents eucaryotes sans phycoérythrine (PE) et des grosses cellules riches en phycoérythrine (cryptophycées et cyanobactéries filamenteuses). Dans les lacs Léman et du Bourget, les dynamiques des différents groupes phytoplanctoniques étudiés étaient relativement similaires, plus particulièrement dans le cas des picocyanobactéries et des eucaryotes sans PE, avec un pic d abondance bien marqué pour

35 le premier prélèvement d avril et un pic successif, mais plus faible pour le deuxième prélèvement d avril. Dans le lac d Annecy, il y avait aussi une augmentation des abondances du phytoplancton en avril, particulièrement des picocyanobactéries. Ces augmentations des abondances en avril coïncident avec l influence classique printanière dans les milieux marins et lacustres (Weisse, 1993 ; Pick, 2000 ; Callieri et Stockner, 2002). Typiquement, l augmentation de la température de la couche de surface de la colonne d eau favorise la croissance du phytoplancton, en accélérant son activité métabolique, causant le «bloom printanier». A cela s ajoute la lumière dont la quantité est supérieure par rapport aux mois précédents et la présence encore suffisante des nutriments dans les couches de surface. En général, la communauté phytoplanctonique du lac d Annecy était très homogène le long de la colonne d eau, en raison probable d une transparence élevée et de la faible profondeur de ce lac (65 m). Pour les lacs Léman et du Bourget, les concentrations phytoplanctoniques étaient plus élevées dans la zone de surface, puis elles diminuaient au delà de 20 mètres. Il est probable que la raison à cela soit liée à un échange vertical limité de la colonne d eau entre la surface et les eaux plus profondes mais aussi à une moindre transparence de l eau dans ces deux lacs, comparativement à Annecy. Si l on compare les abondances des trois groupes analysés en cytométrie en flux dans les lacs Léman, d Annecy et du Bourget, il est clair que c est dans le lac d Annecy où prédominaient les picocyanobactéries et inversement, que les cyanobactéries filamenteuses et les eucaryotes avec ou sans PE étaient moins abondants. Au contraire, pour le lac Léman, le groupe prédominant était représenté par les eucaryotes sans PE, puis par les eucaryotes et les cyanobactéries filamenteuses riches en PE. Dans le lac du Bourget, il y avait une représentation très importante des eucaryotes, particulièrement au mois d avril, suivi par les picocyanobactéries, puis enfin les cyanobactéries filamenteuses et les eucaryotes riches en phycoérythrine. On voit donc bien ici que ces données corroborent en partie celles obtenues avec la microscopie pour statuer l état trophique de ces écosystèmes, mais que des variantes existent notamment sur le caractère similaire des lacs Léman et du Bourget, eu regard de certains groupes. Pico-, nano- et microphytoplancton Dans le lac d Annecy, il est évident que le picophytoplancton représentait la classe de taille prédominante entre février et avril, un résultat attendu pour les lacs oligotrophes (Vöros

36 et al. 1998). La dominance d une classe de taille pour les deux autres lacs était plus difficile à mettre en évidence de part les différences significatives observées en fonction du temps et de la profondeur. De plus, ces deux écosystèmes montraient également de ce point de vue là des différences marquées. Partant du principe que ces écosystèmes étaient caractérisés par des concentrations en nutriments équivalents (données non montrées), il est suggéré que d autres facteurs environnementaux puissent être à l origine des différences de dominance dans les classes de taille. Typiquement, il a été démontré récemment que la stabilité thermique est très différente entre le lac Léman et du Bourget (Jacquet et al. 2005a). Il faudra plus de données et plus de temps pour prétendre donner une explication rationnelle à la structuration observée.

37 CONCLUSION! La composition des espèces phytoplanctoniques pour le lac Léman et du Bourget est typique de systèmes mésotrophiques, en accord avec le critère de l OCDE (1982) basé sur la concentration en P et ce pour seulement trois mois de données.! La présence des abondances élevées ainsi que des agrégations de picocyanobactéries dans le lac d Annecy pendant toute la période d étude a permis de confirmer l oligotrophie de ce lac. Ce résultat laisse à penser que l identification et le suivi de ces colonies pourrait être un bon indicateur de pollution dans les milieux lacustres.! Les abondances élevées du phytoplancton en avril dans les trois lacs étudiés sont une conséquence de la variation saisonnière classique enregistrée par les milieux lacustres en zone tempérée, à savoir le réchauffement des eaux superficielles, la plus grande disponibilité de la lumière, et la présence toujours suffisante des nutriments.! La cytométrie en flux a permis de confirmer qu il existe une différence dans le profil de chaque lac étudié quant aux principaux groupes du phytoplancton : picocyanobactéries, des eucaryotes sans phycoérythrine et des grosses cellules riches en phycoérythrine (cryptophycées et cyanobactéries filamenteuses). Typiquement, des abondances élevées dans la zone comprise entre 10 et 15 m ont été enregistrées dans les lac Léman et du Bourget alors que dans le lac d Annecy, il y avait une distribution homogène du phytoplancton dans toute la colonne d eau. Les données de cytométrie en flux ont aussi permis de révéler des différences notables entre lac Léman et du Bourget.! La complémentarité des méthodes utilisées a permis d obtenir, au moins pendant le période d étude, une représentation intégrale de la structure et de la dynamique phytoplanctonique dans les lacs Léman, d Annecy et du Bourget. La cytométrie en flux nous a permis déterminer les abondances réelles ainsi que la variation temporelle du picophytoplancton, des cyanobactéries filamenteuses et des eucaryotes discriminables en cytométrie. Avec la microscopie inversée, nous avons pu identifier taxonomiquement les espèces représentatives de chacun des groupes isolés avec la fonction tri du cytomètre, ainsi que la composition de tous les groupes qui n ont pas

38 été observés en cytométrie (typiquement les formes rares). Avec la microscopie à épifluorescence, même si les valeurs d abondance obtenues ne semblaient pas représentatives, nous avons pu déterminer que dans le lac d Annecy la proportion des colonies picocyanobactériennes est importante, par opposition avec les lacs Léman et du Bourget, où prédominent les cellules individuelles. PERSPECTIVES! Identifier toutes les espèces isolées avec la fonction tri du cytomètre en flux qui ont été mises en culture entre février et juin, soit en tout plus de 50 isolements! Effectuer des bio-essais pour déterminer quels sont les mécanismes qui permettent aux picocyanobactéries de répondre rapidement aux variations environnementales et de former des colonies où agrégations.! Mettre en relation les paramètres physico-chimiques disponibles à la station, avec la présence et la dynamique des espèces phytoplanctoniques les plus représentatives de chaque lac afin de déterminer dans le détail le contrôle exercé par l environnement abiotique.! Faire un suivi sur une année ou deux entières comme cela a été fait ici afin de corroborer les relations structure-état trophique esquissées dans ce rapport

39 BIBLIOGRAPHIE Alvarez-Cobelas, M. et Gallardo, T Catálogo de las Algas Continentales Españolas V. Cyanophyceae Schaffner Acta Botánica Malacitana, Málaga (13), Anneville, O. et Pelletier, J. P Recovery of Lake Geneva from eutrophication : quantitative response of phytoplankton. Archiv fur Hydrobiologie 148 (4), Anneville, O., Souissi, S., Ibanez, F., Ginot, V., Druart, J. C., Angeli, N. 2002a. Temporal mapping of phytoplankton assemblages in Lake Geneva: Annual and interannual changes in their patterns of succession. Limnology and Oceanography 47(5), Anneville, O., Leboulanger, C Long-terms changes in the vertical distribution of phytoplankton biomass and primary production in Lake Geneva : a reponse to the oligotrophication. Alti Associazione Italiana Oceanologia Limnologia 14, Anneville, O., Ginot, V., Druart, J. C., Angeli, N. 2002b. Long-term study ( ) of seasonal changes in the phytoplankton in Lake Geneva: a multi-table approach. Journal of Plankton Research 24 (10), Anneville, O., Souissi, S., Gammeter, S., Straile, D Seasonal and inter-annual scales of variability in phytoplankton assemblages: comparison of phytoplankton dynamics in threeperi-alpine lakes over a period of 28 years. Freshwater Biology 49, Angeli, N., Pinel-Alloul, B., Balvay, G., and Ménard, I Diel patterns of feeding and vertical migration in daphnids and diaptomids during the clear water phase in Lake Geneva (France). Hydrobiologia 300/301, Azam, F., Fenchel, F., Field, J., Meyer-Reid, L., Thingstad, F The ecological role of water column microbes in the sea. Marine Ecology Progress Series 10, Bell, T. et Kalff, J The contribution of picophytoplankton in marine and freshwater systems of different trophic status and depth. Limnology and.oceanography 46(5), Bicudo, C. y Bicudo, C Algas de Aguas Continentais Brasileiras. Fundaçao brasileira para o desenvolvimento do ensino de ciencias, Sao Paolo, 228 p. Bürgi, H Limnologische Bildtafeln: Plankton. Eidgenössische Technische Hochschulen. Katalog Nr Büsing, N Seasonality of phytoplankton as an indicator of trophic status of the large perialpine Lago di Garda. Hydrobiologia 369/370, Caljon, A Brackrish-water Phytoplankton of the Flemish Lowland. Dr. W. Junk Publisher, The Hague, The Netherlands, 272 p. Calijuri, M., Dos Santos, A., Jati, S Temporal changes in the phytoplankton community structure in a tropical and eutrophic reservoir (Barra Bonita, S.P., Brazil). Journal of Plankton Research 24(7), Callieri, C., Karjalainen, S. M., Passoni, S Grazing by ciliates and heterotrophic nanoflagellates on picocyanobacteria in Lago Maggiore, Italy. Journal of Plankton Research 24(8), Callieri, C., Stockner J Picocyanobacteria success in oligotrophic lakes: fact or fiction. Journal of Limnology 59, Callieri, C., Stockner J Freshwater autotrophic picoplankton: a review. Journal of. Limnology 61(1), Carrillo, P., Reche, I., Sánchez-Castillo, P., Cruz-Pizarro, L Direct and indirect effects of grazing on the phytoplankton seasonal succession in an oligotrophic lake. Journal of Plankton Research 17,

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44 Dynamique et diversité du pico-, nano- et microphytoplancton des lacs Léman, d Annecy et du Bourget Mots clefs : phytoplancton, classe de taille, microscopie, cytométrie en flux, lac, état trophique RESUME Trois classes de taille du phytoplancton : le pico- (0,2-2 µm), nano- (>2-20 µm) et microphytoplancton (>20 µm µm) ont été étudiées dans les lacs Léman, du Bourget et d Annecy de février à avril 2005 inclus. La dynamique et la diversité à l intérieur de chacune de ces classes a été étudiée au moyen de plusieurs techniques : la microscopie inversée pour déterminer l abondance et la composition taxonomique du nano- et du microphytoplancton, la microscopie à épifluorescence pour déterminer la proportion des formes picocyanobactériennes unicellulaires et coloniales, et la cytométrie en flux pour déterminer les abondances du picophytoplancton, des cyanobactéries filamenteuses et des eucaryotes. Cette dernière méthode a également servi à identifier des populations inconnues de prime abord en cytométrie, après leur tri et mises en culture. Les prélèvements ont été faits une à deux fois par mois entre la fin de l hiver (février) et le milieu du printemps (avril). Des valeurs d abondance importantes des trois groupes de taille ont été trouvées en avril, coïncidant avec le début de la saison printanière. La composition phytoplanctonique variait entre les lacs mais aussi entre les profondeurs d un même lac. La prédominance d espèces mésotrophes a été enregistrée dans le lac Léman (Pseudoanabaena limnetica, Mougeotia gracillima) et le lac du Bourget (Planktothrix rubescens, Asterionella formosa) et des espèces oligotrophes dans le lac d Annecy (Fragilaria crotonensis, Dinobryon sociale). Les abondances supérieures de picocyanobactéries enregistrées dans le lac d Annecy ainsi que des proportions élevées de formes coloniales ont également permis de confirmer le «bon état» trophique de ce lac. Comparativement, les abondances élevées de nombreux eucaryotes et des cyanobactéries filamenteuses dans les lacs Léman et du Bourget indiquaient la présence de concentrations élevées en nutriments. C est la complémentarité des techniques utilisées au cours de cette étude qui a permis d avoir, pour la première fois, une représentation intégrale de la structure et de la dynamique phytoplanctonique dans les lacs Léman, d Annecy et du Bourget, les plus grands lacs naturels de France.

45 Dynamics and diversity of pico-, nano- et microphytoplanktonic populations of Lakes Annecy, Bourget and Geneva ABSTRACT For three months, between February and April 2005, the three main classes of phytoplankton (i.e. the pico- [0,2-2 µm], the nano- [2-20 µm] and the microphytoplankton [20 µm µm] have been studied in the 3 largest natural French lakes (Annecy, Bourget and Geneva). Both population dynamics and diversity were analysed using 3 different and complementary methods: flow cytometry (FCM), epifluorescence microscopy (EFM) and inverted microscopy (IM). IM was useful to determine the taxonomic identification and obtain abundance for each nano- or microphytoplanktonic species. EFM allowed to discriminate PCand PE-rich picocyanobacteria and to determine the proportion of colonial vs. unicellular picocyanobacteria. At last, precise counts were obtained for both picocyanobacteria, some filamentous cyanobacteria and relatively small eukaryotes using FCM. The sorting function of FCM was used to sort any time it was possible each population in order to maintain it in culture using a battery of different culture media with the final goal to identify each FCM population. Samples were obtained once or twice a month between the end of winter (February) and the middle of spring (April). High values of abundances for the three size classes were recorded in April, concomitantly with the spring season (i.e. higher light availability, increase of temperature, still enough nutrients). The phytoplanktonic composition varied considerably between each sample depth for each lake and also between lakes. Typical mesotrophic species were predominant in Lake Geneva (Pseudoanabaena limnetica, Mougeotia gracillima) and Lake Bourget (Planktothrix rubescens, Asterionella formosa) whereas oligotrophic forms dominated in Lake Annecy (Fragilaria crotonensis, Dinobryon sociale). High values for picocyanobacterial abundance in Lake Annecy as well as a relatively high proportion of colonial forms also suggested a better trophic state for this ecosystem. By contrast, high values for filamentous cyanobacteria and eukaryotes in Lakes Bourget and Geneva supported higher nutrient concentrations for these ecosystems. For the very first time, using a combination of different techniques, we could obtain an integral view of the whole phytoplanktonic structure and dynamics for the three main natural French reservoirs in the Alps. Key index words: flow cytometry, lake, microscopy, phytoplankton, size class, trophic state

46 Maria CELLAMARE Master 2 «Mention Sciences de l Univers, Environnement, Ecologie» «Spécialité Océanographie et Environnements Marins» Dynamique et diversité du pico-, nano- et microphytoplancton des lacs Léman, d Annecy et du Bourget Mots clefs : phytoplancton, classe de taille, microscopie, cytométrie en flux, lac, état trophique RESUME Trois classes de taille du phytoplancton : le pico- (0,2-2 µm), le nano- (>2-20 µm) et le microphytoplancton (>20 µm µm) ont été étudiées dans les lacs Léman, du Bourget et d Annecy de février à avril 2005 inclus. La dynamique et la diversité à l intérieur de chacune de ces classes ont été étudiées au moyen de plusieurs techniques : la microscopie inversée pour déterminer l abondance et la composition taxonomique du nano- et du microphytoplancton, la microscopie à épifluorescence pour déterminer la proportion des formes picocyanobactériennes unicellulaires et coloniales et la cytométrie en flux pour déterminer les abondances du picophytoplancton, des cyanobactéries filamenteuses et des eucaryotes. Cette dernière méthode a également servi à identifier des populations inconnues de prime abord en cytométrie, après leur tri et mises en culture. Les prélèvements ont été faits une à deux fois par mois entre la fin de l hiver (février) et le milieu du printemps (avril). Des valeurs d abondance importantes des trois groupes de taille ont été trouvées en avril, coïncidant avec le début de la saison printanière. La composition phytoplanctonique variait entre les lacs mais aussi entre les profondeurs d un même lac. La prédominance d espèces mésotrophes a été enregistrée dans le lac Léman (Pseudoanabaena limnetica, Mougeotia gracillima) et le lac du Bourget (Planktothrix rubescens, Asterionella formosa) et des espèces oligotrophes dans le lac d Annecy (Fragilaria crotonensis, Dinobryon sociale). Les abondances supérieures de picocyanobactéries enregistrées dans le lac d Annecy ainsi que des proportions élevées de formes coloniales ont également permis de confirmer le «bon état» trophique de ce lac. Comparativement, les abondances élevées de nombreux eucaryotes et des cyanobactéries filamenteuses dans les lacs Léman et du Bourget indiquaient la présence de concentrations élevées en nutriments. C est la complémentarité des techniques utilisées au cours de cette étude qui a permis d avoir, pour la première fois, une représentation intégrale de la structure et de la dynamique phytoplanctonique dans les lacs Léman, d Annecy et du Bourget, les plus grands lacs naturels de France. Stage effectué sous la responsabilité scientifique de : Stéphan JACQUET Equipe de Microbiologie Aquatique/UMR CARRTEL INRA - Station d Hydrobiologie Lacustre 75, avenue de Corzent BP Thonon-les-Bains cx France

47 A 10 µm B 10 µm C 10 µm Figure 1. Groupes représentatifs du phytoplancton observés avec le microscope à épifluorescence. A : formes unicellulaires et coloniales de picocyanobactéries (picophytoplancton), B : la cryptophycée Rhodomonas minuta (nanophytoplancton), C : la diatomée Asterionella formosa (microphytoplancton).

48 Figure 2. Localisation des lacs Léman, d Annecy et du Bourget dans la région Rhône-Alpes (Source : SHL INRA).

49 Figure 3. Carte bathymétrique simplifiée du Lac Léman et localisation de la station de prélèvement (SHL2) (d après Anneville et al. 2002b). Figure 4. Carte bathymétrique simplifiée du Lac du Bourget et localisation de la station de prélèvement (point B) (d après Arnaud et al. in press). Figure 5. Carte bathymétrique simplifiée du Lac d Annecy et localisation de la station de prélèvement (point rouge) (Source : SHL INRA).

50 Figure 6. Schéma du principe de la cytométrie en flux et de la fonction tri (modifié d après Métézeau et Delamare, 1988 ; Reckermann, 2000).

51 Figure 7. Flacons de culture Nunclon contenant les populations isolées avec la fonction tri du cytométre puis mises en culture (Photographie : S. Jacquet). Figure 8. Flacons de culture contenant les différents groupes phytoplanctoniques triés par cytométrie en flux et placées sur une roue tournante pour obtenir un éclairement homogène (Photographie : S. Jacquet).

52 Figure 9. Abondance du nano- et microphytoplancton à 3 profondeurs dans les lacs Léman (A), du Bourget (B) et d Annecy (C) pendant la période février - avril Pour faciliter la lecture, l échelle des ordonnées est différente suivant le lac étudié. Figure 10. Richesse spécifique du nano- et microphytoplancton à 3 profondeurs dans les lacs Léman (A), du Bourget (B) et d Annecy (C) pendant la période février - avril 2005.

53 Figure 11. Proportion des espèces phytoplanctoniques prédominantes dans le lac Léman aux profondeurs de 2,5 (A), 10 (B) et 15 m (C) pendant la période février - avril 2005.

54 Pseudoanabaena limnetica Figure 12. Proportion des espèces phytoplanctoniques prédominantes dans le lac du Bourget aux profondeurs de 2 (A), 10 (B) et 15 m (C) pendant la période février - avril 2005.

55 Figure 13. Proportion des espèces phytoplanctoniques prédominantes dans le lac d Annecy aux profondeurs de 3 (A), 10 (B) et 15 m (C) pendant la période février - avril 2005.