Analyse d échantillons alimentaires pour la présence d organismes génétiquement modifiés

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1 Analyse d échantillons alimentaires pour la présence d organismes génétiquement modifiés Module 9 Détection qualitative du maïs MON810, du maïs Bt- 176 et du soja Roundup Ready par PCR M. Querci, M. Maretti, M. Mazzara WORLD HEALTH ORGANIZATION REGIONAL OFFICE FOR EUROPE ORGANISATION MONDIALE DE LA SANTE BUREAU REGIONAL DE L EUROPE WELTGESUNDHEITSORGANISATION REGIONALBÜRO FÜR EUROPA ВСЕМИРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ ЗДРАВООХРАНЕНИЯ ЕВРОПЕЙСКОЕ РЕГИОНАЛЬНОЕ БЮРО

2 Détection qualitative du maïs MON810, du maïs Bt-176 et du soja Roundup Ready par PCR 2 Table des matières Module 9 Détection qualitative du maïs MON810, du maïs Bt-176 et du soja Roundup Ready par PCR EXPERIMENTATION 3 INTRODUCTION 3 PCR SPECIFIQUE AUX PLANTES : LECTINE DE SOJA 6 PCR SPECIFIQUE AUX PLANTES : ZEIN DU MAÏS 10 METHODE DE CRIBLAGE POUR LA DETECTION DE PLANTES GENETIQUEMENT MODIFIEES 13 DETECTION DU PROMOTEUR 35S 13 DETECTION DU TERMINATEUR NOS 16 DETECTION SPECIFIQUE DU MAÏS MON810, DU MAÏS BT-176 ET DU SOJA ROUNDUP READY PAR PCR NICHEE 19 DETECTION DU MAÏS MON DETECTION DU MAÏS BT DETECTION DU SOJA ROUNDUP READY 27

3 Détection qualitative du maïs MON810, du maïs Bt-176 et du soja Roundup Ready par PCR 3 Expérimentation Introduction Les protocoles suivants sont des méthodes basées sur la technique PCR permettant le criblage des OGM (à l aide du promoteur 35S et du terminateur nos) ainsi que la détection d OGM spécifiques (soja Roundup Ready, maïs MON810 et maïs Bt-176) dans les matières premières et transformées, en les comparant avec des échantillons correspondants qui ne sont pas génétiquement modifiés (soja et maïs). Les méthodes suivantes permettent uniquement d obtenir un résultat qualitatif indiquant la présence ou l absence de la séquence cible dans l échantillon. Equipement Micropipettes Thermocycleur Microcentrifugeuse Agitateur vortex Portoir pour tubes de réaction Tubes de réaction PCR de 0,2 ml Tubes microcentrifuges de 1,5 ml Chambre stérile séparée avec capot UV REMARQUE L ensemble de l équipement doit être exempt d ADN et, dans la mesure du possible, stérilisé avant toute utilisation. Afin d éviter toute contamination, il convient d utiliser des pipettes dont les extrémités comportent des filtres de protection contre la formation éventuelle d aérosols. Réactifs datp CAS dctp CAS dgtp CAS dttp CAS Tampon PCR 10x (généralement livré par le même fournisseur que l ADN polymérase Taq)

4 Détection qualitative du maïs MON810, du maïs Bt-176 et du soja Roundup Ready par PCR 4 25 mm de MgCl 2 ADN polymérase Taq Oligonucléotides amont et aval Huile minérale (requise en cas d utilisation d un thermocycleur sans couvercle chaud) Eau exempte de nucléase Solution mère de 4 mm de dntp Les dntp peuvent être fournis en solutions pré-mélangées, contenant des concentrations équivalentes de datp, de dctp, de dgtp et de dttp, ou séparés en solutions concentrées individuelles. Si les solutions individuelles sont utilisées, chaque dntp doit être dissous dans de l eau déionisée stérile afin d obtenir une solution mère finale de 4 mm de dntp. Diviser en parties aliquotes et conserver à -20 C. Les dntp restent stables pendant plusieurs mois. Solution d amorce de 20 µm Les oligonucléotides d amorce sont généralement fournis sous forme lyophilisée et doivent être dilués jusqu à une concentration finale de 20 µm. Préparer une solution d amorce de 20 µm en tenant compte des consignes du fournisseur. - 1 µm = 1 pmol/µl so 20 µm = 20 pmol/µl - Xnmol d amorce + 10X µl d eau stérile = 100 pmol/µl = 100 µm - Incuber pendant 5 mn à 65 C, remuer et incuber pendant encore 3 mn à 65 C - Dilution 1:5 Préparer 1 tube microcentrifuge avec 400 µl d eau stérile et ajouter 100 µl de la solution d amorce (100 µm) Concentration finale : 20 µm Diviser en petites parties aliquotes et conserver à -20 C. Les parties aliquotes conservées à -20 C restent stables pendant au moins 6 mois ; les amorces lyophilisées restent stables à -20 C pendant trois ans maximum.

5 Détection qualitative du maïs MON810, du maïs Bt-176 et du soja Roundup Ready par PCR 5 Tampon PCR 10x En général, le tampon PCR 10x, contenant 500 mm de KCl, 100 mm de Tris-HCl (ph 9,0 à 25 C) et 1% de Triton X-100 est fourni avec l ADN polymérase Taq et est prêt à être utilisé. Le tampon doit être mélangé et centrifugé rapidement avant chaque utilisation. Les parties aliquotes sont stockées à -20 C et restent stables pendant plusieurs mois. Solution de 25 mm de MgCl 2 Une solution de MgCl 2 de «classe PCR» est généralement fournie avec l ADN polymérase Taq et est prête à être utilisée. La solution doit être mélangée (vortex) avant chaque utilisation et centrifugée rapidement (destruction du gradient de concentration pouvant se former en cas de conservation prolongée). Conserver à -20 C. Parties aliquotes d eau exempte de nucléase Les parties aliquotes d eau déionisée stérile exempte de nucléase sont préparées pour le et la dilution de l ADN. Il convient d utiliser une nouvelle partie aliquote pour chaque série d analyses.

6 Détection qualitative du maïs MON810, du maïs Bt-176 et du soja Roundup Ready par PCR 6 PCR spécifique aux plantes : lectine de soja L identification de l ADN du soja s effectue en ciblant le gène lectine. La PCR avec les amorces GMO3/GMO4 permet de déterminer si l échantillon contient ou non de l ADN de soja amplifiable. Caractéristiques des amorces GMO3 et GMO4 GMO3 GCCCTCTACTCCACCCCCATCC Longueur 22 Poids moléculaire (g/mol) 6471,6 Point de fusion * (G/C) 65,1 GMO4 GCCCATCTGCAAGCCTTTTTGTG Longueur 23 Poids moléculaire (g/mol) 6981,1 Point de fusion * (G/C) 59,6 *sur la base d un [Na + ] de 50 mm Contrôles Il est impératif d effectuer des essais pour chaque analyse PCR. Les contrôles négatifs permettent de vérifier si les réactifs PCR sont contaminés par de l ADN. Les contrôles positifs avec des échantillons caractérisés sont également essentiels pour déterminer l efficacité et la spécificité de la PCR. Les contrôles suivants doivent être effectués dans le cadre de l analyse réalisée avec la PCR : Contrôle positif : ADN pur, isolé du soja classique Contrôle négatif : ADN pur, isolé des autres variétés, exempt du gène lectine Absence de matrice : contrôle négatif du, où l ADN est remplacé par de l eau

7 Détection qualitative du maïs MON810, du maïs Bt-176 et du soja Roundup Ready par PCR 7 Préparation du Les réactifs requis pour une série de 10 échantillons (y compris les contrôles positifs/négatifs/absence de matrice) sont mélangés conformément aux instructions du Tableau 1. La procédure suivante s applique à un échantillon contenant 48 µl de GMO3/GMO4 et 2 µl d une solution d ADN. Toutes les solutions sont conservées dans la glace durant la préparation du. Tableau 1. GMO3/GMO4 Concentration finale pour un échantillon pour 10 échantillons Eau déionisée stérile 32,75 µl 327,5 µl Tampon PCR 10x 1x 5 µl 50 µl 25 mm de MgCl 2 2,5 mm 5 µl 50 µl 4 mm de dntp 0,2 mm 2,5 µl 25 µl 20 µm d oligonucléotides GMO3 0,5 µm 1,25 µl 12,5 µl 20 µm d oligonucléotides GMO4 0,5 µm 1,25 µl 12,5 µl ADN polymérase Taq 0,025 U/µl 0,25 µl 2,5 µl TOTAL 48 µl 480 µl Préparer un tube microcentrifuge de 1,5 ml Ajouter les réactifs suivant les consignes énoncées dans le Tableau 1 Mélanger doucement le GMO3/GMO4 en pipetant et centrifuger brièvement Diviser le en parties aliquotes de 48 µl dans des tubes de réaction PCR de 0,2 ml Ajouter 2 µl de la solution d ADN aux parties aliquotes précédentes Mélanger doucement et centrifuger brièvement Placer les tubes de réaction PCR dans le thermocycleur

8 Détection qualitative du maïs MON810, du maïs Bt-176 et du soja Roundup Ready par PCR 8 Programme PCR* (GMO3/GMO4) Température Durée Dénaturation initiale 95 C 3 mn Dénaturation 95 C 30 s Hybridation 63 C 30 s Extension 72 C 30 s Nombre de cycles 40 Extension finale 72 C 3 mn 4 C Suite à l amplification, les échantillons sont centrifugés brièvement et placés dans la glace. * Note : Durant la formation, les thermocycleurs Perkin Elmer Gene Amp PCR system 9600, ABI 9700 seront utilisés. L utilisation d autres modèles ou marques de thermocycleurs permettra d obtenir les mêmes résultats, à condition que les programmes PCR soient adaptés et testés en conséquence 1. Analyse des produits de PCR Après amplification de la séquence cible, les produits de la PCR sont analysés par électrophorèse sur gel d agarose en présence de bromure d éthidium. 8 µl d une PCR sont mélangés avec 2 µl de tampon de charge ; les échantillons sont ensuite chargés sur le gel d agarose (1,5%). La migration s effectue à 100 V pendant une durée d 1 heure. Des étalons de masse moléculaire (15 µl d échelle 100 pb) migrent dans les puits adjacents du gel afin de déterminer avec précision la taille des amplicons. Après l opération, une transillumination avec lumière UV permet de visualiser l ADN dans le gel. Le gel peut être pris en photo afin de fournir un enregistrement permanent du résultat de l essai. 1 Le CCR et l OMS n approuvent aucun équipement utilisé dans le cadre des formations ou mentionné dans ce manuel. Les analyses effectuées dans nos laboratoires doivent pouvoir être reproduites facilement à l aide d équipements différents, à condition de prendre en compte les caractéristiques divergentes du système utilisé.

9 Détection qualitative du maïs MON810, du maïs Bt-176 et du soja Roundup Ready par PCR 9 Interprétation des résultats La paire d amorces GMO3/GMO4 pour la détection du gène lectine naturel est utilisée en tant que contrôle du système ; la présence d une bande spécifique lectine à 118 pb confirme la qualité de l ADN extrait. Le contrôle positif amplifiera une bande à 118 pb. Le contrôle négatif et l absence de matrice ne devraient pas donner de bande visible. Si les contrôles positifs/négatifs ne donnent pas les résultats escomptés, l analyse PCR des échantillons sélectionnés n est pas valable. Si les contrôles donnent les résultats escomptés et si l échantillon n a pas de bande à 118 pb, cela signifie que cet échantillon ne contient pas d ADN de soja amplifiable. Il est à noter que ce protocole ainsi que d autres protocoles décrits dans ce module sont des méthodes qualitatives et ne permettent par conséquent d obtenir que des résultats qualitatifs (oui/non).

10 Détection qualitative du maïs MON810, du maïs Bt-176 et du soja Roundup Ready par PCR 10 PCR spécifique aux plantes : zein du maïs L identification de l ADN du maïs implique le ciblage du gène zein. La PCR avec les amorces ZEIN3/ZEIN4 détermine si l échantillon contient de l ADN de maïs présentant une qualité suffisante pour son amplification. Caractéristiques des amorces ZEIN3 et ZEIN4 ZEIN3 AGTGCGACCCATATTCCAG Longueur 19 Poids moléculaire (g/mol) 5772,3 Point de fusion * (G/C) 55,2 ZEIN4 GACATTGTGGCATCATCATTT Longueur 21 Poids moléculaire (g/mol) 6410,9 Point de fusion * (G/C) 51,7 *sur la base d un [Na+] de 50 mm Contrôles Contrôle positif : ADN pur, isolé du maïs classique Contrôle négatif : ADN pur, isolé des autres espèces, exempt de gène zein Absence de matrice : contrôle négatif du, où l ADN est remplacé par de l eau Préparation du Les réactifs nécessaires pour une série de 10 échantillons (y compris les contrôles positifs/négatifs/absence de matrice) sont mélangés conformément aux instructions du Tableau 2. La procédure suivante s applique à un échantillon contenant 48 µl de ZEIN3/ZEIN4 et 2 µl de solution d ADN. Toutes les solutions sont conservées dans la glace durant la préparation du.

11 Détection qualitative du maïs MON810, du maïs Bt-176 et du soja Roundup Ready par PCR 11 Tableau 2. ZEIN3/ZEIN4 Concentration finale pour un échantillon pour 10 échantillons Eau déionisée stérile 32,75 µl 327,5 µl Tampon PCR 10x 1x 5 µl 50 µl 25 mm de MgCl 2 2,5 mm 5 µl 50 µl 4 mm de dntp 0,2 mm 2,5 µl 25 µl 20 µm d oligonucléotides ZEIN3 0,5 µm 1,25 µl 12,5 µl 20 µm d oligonucléotides ZEIN4 0,5 µm 1,25 µl 12,5 µl ADN polymérase Taq 0,025 U/µl 0,25 µl 2,5 µl TOTAL 48 µl 480 µl Préparer un tube microcentrifuge de 1,5 ml Ajouter les réactifs dans l ordre indiqué au Tableau 2 Mélanger doucement le ZEIN3/ZEIN4 en pipetant et centrifuger brièvement Diviser le en parties aliquotes de 48 µl dans des tubes de réaction PCR de 0,2 ml Ajouter 2 µl de la solution d ADN aux parties aliquotes précédentes Mélanger doucement et centrifuger brièvement Placer les tubes de réaction PCR dans le thermocycleur Programme PCR (ZEIN3/ZEIN4) Température Durée Dénaturation initiale 95 C 3 mn Dénaturation 96 C 1 mn Hybridation 60 C 1 mn Nombre de cycles 40 Extension finale 72 C 3 mn 4 C Après l amplification, les échantillons sont centrifugés brièvement et placés dans la glace.

12 Détection qualitative du maïs MON810, du maïs Bt-176 et du soja Roundup Ready par PCR 12 Analyse des produits de la PCR Après amplification de l ADN, les produits de la PCR sont analysés par électrophorèse sur gel d agarose en présence de bromure d éthidium. 8 µl de la solution sont mélangés avec 2 µl de tampon de charge. Le mélange est ensuite chargé sur un gel d agarose (1,5%). La migration doit s effectuer à 100 V pendant une durée d 1 heure. Des étalons de masse moléculaire (15 µl d échelle 100 pb) migrent dans les puits adjacents du gel afin de déterminer avec précision la taille des amplicons. Après l opération, une transillumination avec lumière UV permet de visualiser l ADN dans le gel. Le gel peut être pris en photo afin de fournir un enregistrement permanent du résultat de l essai. Interprétation des résultats La paire d amorces ZEIN3/ZEIN4 est utilisée pour détecter le gène zein naturel du maïs en tant que contrôle de la qualité d amplification de l ADN extrait. Si la qualité d amplification de l ADN extrait est suffisante, une bande spécifique zein de 277 pb sera observée sur le gel. Le contrôle positif doit également s amplifier en présentant une taille de bande de 277 pb. Le contrôle négatif et l absence de matrice ne devraient pas donner de bande visible. Si les contrôles positifs/négatifs ne donnent pas les résultats escomptés, l analyse PCR des échantillons sélectionnés n est pas valable. Si les contrôles donnent les résultats escomptés et si l échantillon n a pas de bande à 277 pb, cela signifie que cet échantillon ne contient pas d ADN de maïs amplifiable.

13 Détection qualitative du maïs MON810, du maïs Bt-176 et du soja Roundup Ready par PCR 13 Méthode de criblage pour la détection de plantes génétiquement modifiées Les gènes sont régulés par des promoteurs et des terminateurs. Les séquences les plus répandues pour la régulation d un transgène sont le promoteur 35S (dérivé du CaMV) et le terminateur nos (dérivé du Agrobacterium tumefaciens). L identification de l une de ces séquences régulatrices dans un échantillon contenant du soja et/ou du maïs dont le cas est à l étude indique la présence d OGM. Dans le cas du soja Roundup Ready, l identification du promoteur 35S et du terminateur nos est possible, alors que seul le promoteur 35S est présent dans les lignées de maïs Bt- 176 et MON810. Détection du promoteur 35S Caractéristiques des amorces p35s-cf3 et p35s-cr4 p35s-cf3 CCACGTCTTCAAAGCAAGTGG Longueur 21 Poids moléculaire (g/mol) 6414,5 Point de fusion * (G/C) 57,4 p35s-cr4 TCCTCTCCAAATGAAATGAACTTCC Longueur 25 Poids moléculaire (g/mol) 7544,2 Point de fusion * (G/C) 56,3 *sur la base d un [Na+] de 50 mm Contrôles Contrôle positif : ADN de la matière de référence (maïs 0,5% GM) Contrôle négatif : ADN de la matière de référence (maïs 0% GM) Absence de matrice : contrôle négatif du, où l ADN est remplacé par de l eau

14 Détection qualitative du maïs MON810, du maïs Bt-176 et du soja Roundup Ready par PCR 14 Préparation du Les réactifs nécessaires pour une série de 10 échantillons (y compris les contrôles positifs/négatifs/absence de matrice) sont mélangés conformément aux instructions du Tableau 3. La procédure suivante s applique à un échantillon contenant 48 µl de p35scf3/p35s-cr4 et 2 µl de solution d ADN. Toutes les solutions sont conservées dans la glace durant la préparation du. Tableau 3. p35s-cf3/p35s-cr4 Concentration finale pour un échantillon pour 10 échantillons Eau déionisée stérile 32,75 µl 327,5 µl Tampon PCR 10x 1x 5 µl 50 µl 25 mm de MgCl 2 2,5 mm 5 µl 50 µl 4 mm de dntp 0,2 mm 2,5 µl 25 µl 20 µm d oligonucléotides p35s-cf3 0,5 µm 1,25 µl 12,5 µl 20 µm d oligonucléotides p35s-cr4 0,5 µm 1,25 µl 12,5 µl ADN polymérase Taq 0,025 U/µl 0,25 µl 2,5 µl TOTAL 48 µl 480 µl Préparer un tube microcentrifuge de 1,5 ml Ajouter les réactifs dans l ordre indiqué au Tableau 3 Mélanger doucement le p35s-cf3/p35s-cr4 en pipetant et centrifuger brièvement Diviser le en parties aliquotes de 48 µl dans des tubes de réaction PCR de 0,2 ml Ajouter 2 µl de la solution d ADN aux parties aliquotes précédentes Mélanger doucement et centrifuger brièvement Placer les tubes de réaction PCR dans le thermocycleur

15 Détection qualitative du maïs MON810, du maïs Bt-176 et du soja Roundup Ready par PCR 15 Programme PCR (p35s-cf3/p35s-cr4) Température Durée Dénaturation initiale 95 C 3 mn Dénaturation 95 C 25 s Hybridation 62 C 30 s Extension 72 C 45 s Nombre de cycles 50 Extension finale 72 C 7 mn 4 C Après l amplification, les échantillons sont centrifugés brièvement et placés dans la glace. Analyse des produits de la PCR Après l amplification, les produits de la PCR sont analysés par électrophorèse sur gel d agarose en présence de bromure d éthidium. 8 µl de la solution sont mélangés avec 2 µl de tampon de charge ; la solution est ensuite chargée sur le gel d agarose (2,5%). La migration doit s effectuer à 100 V pendant une durée d 1 heure. Des étalons de masse moléculaire (15 µl d échelle 100 pb) migrent dans les puits adjacents du gel afin de déterminer avec précision la taille des amplicons. Après l opération, une transillumination avec lumière UV permet de visualiser l ADN dans le gel. Le gel peut être pris en photo afin de fournir un enregistrement permanent du résultat de l essai. Interprétation des résultats La paire d amorces p35s-cf3/p35s-cr4 est utilisée pour détecter le promoteur CaMV 35S, produisant un fragment de 123 pb. Ce promoteur régule l expression génique d un grand nombre de plantes transgéniques comme le soja Roundup Ready soja et la lignée de maïs Bt-176. Le produit d amplification du contrôle positif présentera une bande à 123 pb. Le contrôle négatif et l absence de matrice ne devraient pas donner de bande visible. Si les contrôles positifs/négatifs ne donnent pas les résultats escomptés, l analyse PCR des échantillons sélectionnés n est pas valable. Si les contrôles donnent les résultats escomptés et si l échantillon donne une bande à 123 pb, cela signifie que cet échantillon contient de l ADN modifié.

16 Détection qualitative du maïs MON810, du maïs Bt-176 et du soja Roundup Ready par PCR 16 Détection du terminateur nos Caractéristiques des amorces HA-nos 118-f et HA-nos 118-r HA-nos 118-f GCATGACGTTATTTATGAGATGGG Longueur 24 Poids moléculaire (g/mol) 7462,8 Point de fusion * (G/C) 56,2 HA-nos 118-r GACACCGCGCGCGATAATTTATCC Longueur 24 Poids moléculaire (g/mol) 7296,9 Point de fusion * (G/C) 61,2 *sur la base d un [Na+] de 50 mm Contrôles Contrôle positif : ADN de la matière de référence (RRS 0,5% GM) Contrôle négatif : ADN de la matière de référence (soja 0% GM) Absence de matrice : contrôle négatif du, où l ADN est remplacé par de l eau Préparation du Les réactifs nécessaires pour une série de 10 échantillons (y compris les contrôles positifs/négatifs/absence de matrice) sont mélangés conformément aux instructions du Tableau 4. La procédure suivante s applique à un échantillon contenant 48 µl de HA-nos118- f/ha-nos118-r et 2 µl de solution d ADN. Toutes les solutions sont conservées dans la glace durant la préparation du.

17 Détection qualitative du maïs MON810, du maïs Bt-176 et du soja Roundup Ready par PCR 17 Tableau 4. HA-nos118-f/HA-nos118-r Concentration finale pour un échantillon pour 10 échantillons Eau déionisée stérile 32,75 µl 327,5 µl Tampon PCR 10x 1x 5 µl 50 µl 25 mm de MgCl 2 2,5 mm 5 µl 50 µl 4 mm de dntp 0,2 mm 2,5 µl 25 µl 20 µm d oligonucléotides HA-nos118-f 0,5 µm 1,25 µl 12,5 µl 20 µm d oligonucléotides HA-nos118-r 0,5 µm 1,25 µl 12,5 µl ADN polymérase Taq 0,025 U/µl 0,25 µl 2,5 µl TOTAL 48 µl 480 µl Préparer un tube microcentrifuge de 1,5 ml Ajouter les réactifs dans l ordre indiqué au Tableau 4 Mélanger doucement le HA-nos118-f/HA-nos118-r en pipetant et centrifuger brièvement Diviser le en parties aliquotes de 48 µl dans des tubes de réaction PCR de 0,2 ml Ajouter 2 µl de la solution d ADN aux parties aliquotes précédentes Mélanger doucement et centrifuger brièvement Placer les tubes de réaction PCR dans le thermocycleur Programme PCR (HA-nos118-f/HA-nos118-r) Température Durée Dénaturation initiale 95 C 3 mn Dénaturation 95 C 25 s Hybridation 62 C 30 s Extension 72 C 45 s Nombre de cycles 50 Extension finale 72 C 7 mn 4 C Après l amplification, les échantillons sont centrifugés brièvement et placés dans la glace.

18 Détection qualitative du maïs MON810, du maïs Bt-176 et du soja Roundup Ready par PCR 18 Analyse des produits de la PCR Après l amplification, les produits de la PCR sont analysés par électrophorèse sur gel d agarose en présence de bromure d éthidium. 8 µl de la solution sont mélangés avec 2 µl de tampon de charge ; la solution est ensuite chargée sur un gel d agarose (2,5%). La migration doit s effectuer à 100 V pendant une durée d 1 heure. Des étalons de masse moléculaire (15 µl d échelle 100 pb) migrent dans les puits adjacents du gel afin de déterminer avec précision la taille des amplicons. Après l opération, une transillumination avec lumière UV permet de visualiser l ADN dans le gel. Le gel peut être pris en photo afin de fournir un enregistrement permanent du résultat de l essai. Interprétation des résultats La paire d amorces HA-nos118-f/HA-nos118-r est utilisée pour détecter le terminateur nos, produisant un fragment de 118 pb. Ce terminateur est présent dans le soja Roundup Ready et d autres lignées de plantes transgéniques (par ex. la lignée de maïs Bt-11). Le contrôle positif s amplifiera en présentant une bande à 118 pb. Le contrôle négatif et l absence de matrice ne devraient pas donner de bande visible. Si les contrôles positifs/négatifs ne donnent pas les résultats escomptés, l analyse PCR des échantillons sélectionnés n est pas valable. Si les contrôles donnent les résultats escomptés et si l échantillon donne une bande à 118 pb, cela signifie que cet échantillon contient de l ADN modifié.

19 Détection qualitative du maïs MON810, du maïs Bt-176 et du soja Roundup Ready par PCR 19 Détection spécifique du maïs MON810, du maïs Bt-176 et du soja Roundup Ready par PCR nichée Détection du maïs MON810 Le système de détection est spécifique au maïs MON810. Les éléments cibles sont le promoteur CaMV 35S et la région exon1/intron1 hsp70, qui sont respectivement une séquence régulatrice constitutive et un gène de protéine de choc thermique pour un niveau de transcription accru. Caractéristiques des amorces mg1, mg2, mg3 et mg4 mg1 TATCTCCACTGACGTAAGGGATGAC Longueur 25 Poids moléculaire (g/mol) 7665,1 Point de fusion * (G/C) 59,6 mg2 TGCCCTATAACACCAACATGTGCTT Longueur 25 Poids moléculaire (g/mol) 7560,2 Point de fusion * (G/C) 57,9 mg3 ACTATCCTTCGCAAGACCCTTCCTC Longueur 25 Poids moléculaire (g/mol) 7472,2 Point de fusion * (G/C) 61,2 mg4 GCATTCAGAGAAACGTGGCAGTAAC Longueur 25 Poids moléculaire (g/mol) 7722,9 Point de fusion * (G/C) 59,6 *sur la base d un [Na+] de 50 mm

20 Détection qualitative du maïs MON810, du maïs Bt-176 et du soja Roundup Ready par PCR 20 Contrôles Contrôle positif : ADN de la matière de référence (MON810 0,1%) Contrôle négatif : ADN de la matière de référence (maïs 0% GM) Absence de matrice : contrôle négatif du, où l ADN est remplacé par de l eau Préparation du n 1 Les réactifs nécessaires pour une série de 10 échantillons (y compris les contrôles positifs/négatifs/absence de matrice) sont mélangés conformément aux instructions du Tableau 5. La procédure suivante s applique à un échantillon contenant 48 µl de mg1/mg2 et 2 µl de solution d ADN. Toutes les solutions sont conservées dans de la glace durant la préparation du. Tableau 5. mg1/mg2 Concentration finale pour un échantillon pour 10 échantillons Eau déionisée stérile 32,75 µl 327,5 µl Tampon PCR 10x 1x 5 µl 50 µl 25 mm de MgCl 2 2,5 mm 5 µl 50 µl 4 mm de dntp 0,2 mm 2,5 µl 25 µl 20 µm d oligonucléotides mg1 0,5 µm 1,25 µl 12,5 µl 20 µm d oligonucléotides mg2 0,5 µm 1,25 µl 12,5 µl ADN polymérase Taq 0,025 U/µl 0,25 µl 2,5 µl TOTAL 48 µl 480 µl Préparer un tube microcentrifuge de 1,5 ml Ajouter les réactifs dans l ordre indiqué au Tableau 5 Mélanger doucement le mg1/mg2 en pipetant et centrifuger brièvement Diviser le en parties aliquotes de 48 µl dans des tubes de réaction PCR de 0,2 ml Ajouter 2 µl de la solution d ADN aux parties aliquotes précédentes Mélanger doucement et centrifuger brièvement Placer les tubes de réaction PCR dans le thermocycleur

21 Détection qualitative du maïs MON810, du maïs Bt-176 et du soja Roundup Ready par PCR 21 Programme PCR (mg1/mg2) Température Durée Dénaturation initiale 95 C 3 mn Dénaturation 95 C 45 s Hybridation Extension 60 C 72 C 50 s 50 s Nombre de cycles 35 Extension finale 72 C 3 mn 4 C Après l amplification, les échantillons sont centrifugés brièvement et placés dans la glace. Préparation du n 2 Les réactifs nécessaires pour une série de 10 échantillons sont mélangés conformément aux instructions du Tableau 6. La procédure suivante s applique à un échantillon contenant 49 µl de mg3/mg4 et 1 µl de solution d ADN pré-amplifiée de la première PCR. Toutes les solutions sont conservées dans la glace durant la préparation du. Tableau 6. mg3/mg4 Concentration finale pour un échantillon pour 10 échantillons Eau déionisée stérile 33,75 µl 337,5 µl Tampon PCR 10x 1x 5 µl 50 µl 25 mm de MgCl 2 2,5 mm 5 µl 50 µl 4 mm de dntp 0,2 mm 2,5 µl 25 µl 20 µm d oligonucléotides mg3 0,5 µm 1,25 µl 12,5 µl 20 µm d oligonucléotides mg4 0,5 µm 1,25 µl 12,5 µl ADN polymérase Taq 0,025 U/µl 0,25 µl 2,5 µl TOTAL 49 µl 490 µl Préparer un tube microcentrifuge de 1,5 ml Ajouter les réactifs dans l ordre indiqué au Tableau 6 Mélanger doucement le mg3/mg4 en pipetant et centrifuger brièvement

22 Détection qualitative du maïs MON810, du maïs Bt-176 et du soja Roundup Ready par PCR 22 Diviser le en parties aliquotes de 49 µl dans des tubes de réaction PCR de 0,2 ml Ajouter 1 µl de la solution d ADN aux parties aliquotes précédentes Mélanger doucement et centrifuger brièvement Placer les tubes de réaction PCR dans le thermocycleur Programme pour la PCR nichée (mg3-mg4) Température Durée Dénaturation initiale 95 C 3 mn Dénaturation 95 C 45 s Hybridation Extension 60 C 72 C 50 s 50 s Nombre de cycles 40 Extension finale 72 C 3 mn 4 C Après l amplification, les échantillons sont centrifugés brièvement et placés dans la glace. Analyse des produits de la PCR Après l amplification, les produits de la PCR sont analysés par électrophorèse sur gel d agarose en présence de bromure d éthidium. 8 µl de la solution sont mélangés avec 2 µl de tampon de charge ; la solution est ensuite chargée sur un gel d agarose (2,5%). La migration doit s effectuer à 100 V pendant une durée d 1 heure. Des étalons de masse moléculaire (15 µl d échelle 100 pb) migrent dans les puits adjacents du gel afin de déterminer avec précision la taille des amplicons. Après l opération, une transillumination avec lumière UV permet de visualiser l ADN dans le gel. Le gel peut être pris en photo afin de fournir un enregistrement permanent du résultat de l essai. Interprétation des résultats Les paires d amorces mg1/mg2 et mg3/mg4 ont été mises au point pour détecter spécifiquement la lignée MON810 par PCR nichée, produisant un fragment final de 149 pb. La spécificité réside dans le fait que les amorces sont conçues dans la région couvrant le promoteur E-35S et le gène exon/intron hsp70. Le contrôle positif s amplifiera en présentant

23 Détection qualitative du maïs MON810, du maïs Bt-176 et du soja Roundup Ready par PCR 23 une bande à 149 pb. Le contrôle négatif et l absence de matrice ne devraient pas donner de bande visible. Si les contrôles positifs/négatifs ne donnent pas les résultats escomptés, l analyse PCR des échantillons sélectionnés n est pas valable. Si les contrôles donnent les résultats escomptés et si l échantillon donne une bande à 149 pb, cela signifie que cet échantillon contient de l ADN de maïs MON810. Détection du maïs Bt-176 Le gène cible est le gène cryia(b), qui protège la plante contre les insectes tels que la pyrale du maïs. Caractéristiques des amorces CRYIA1, CRYIA2, CRYIA3 et CRYIA4 CRYIA1 CGGCCCCGAGTTCACCTT Longueur 18 Poids moléculaire (g/mol) 5394,6 Point de fusion * (G/C) 59,5 CRYIA2 CTGCTGGGGATGATGTTGTTG Longueur 21 Poids moléculaire (g/mol) 6519,2 Point de fusion * (G/C) 57,6 CRYIA3 CCGCACCCTGAGCAGCAC Longueur 18 Poids moléculaire (g/mol) 5397,6 Point de fusion * (G/C) 61,7 CRYIA4 GGTGGCACGTTGTTGTTCTGA Longueur 21 Poids moléculaire (g/mol) 6479,2 Point de fusion * (G/C) 57,6 *sur la base d un [Na+] de 50 mm

24 Détection qualitative du maïs MON810, du maïs Bt-176 et du soja Roundup Ready par PCR 24 Contrôles Contrôle positif : ADN de la matière de référence (Bt-176 0,1%) Contrôle négatif : ADN de la matière de référence (maïs 0% GM) Absence de matrice : contrôle négatif du, où l ADN est remplacé par de l eau Préparation du n 1 Les réactifs nécessaires pour une série de 10 échantillons (y compris les contrôles positifs/négatifs/absence de matrice) sont mélangés conformément aux instructions du Tableau 7. La procédure suivante s applique à un échantillon contenant 48 µl de CRYIA1/CRYIA2 et 2 µl de solution d ADN. Toutes les solutions sont conservées dans la glace durant la préparation du. Tableau 7. CRYIA1/CRYIA2 Concentration finale pour un échantillon pour 10 échantillons Eau déionisée stérile 32,75 µl 327,5 µl Tampon PCR 10x 1x 5 µl 50 µl 25 mm de MgCl 2 2,5 mm 5 µl 50 µl 4 mm de dntp 0,2 mm 2,5 µl 25 µl 20 µm d oligonucléotides CRYIA1 0,5 µm 1,25 µl 12,5 µl 20 µm d oligonucléotides CRYIA2 0,5 µm 1,25 µl 12,5 µl ADN polymérase Taq 0,025 U/µl 0,25 µl 2,5 µl TOTAL 48 µl 480 µl Préparer un tube microcentrifuge de 1,5 ml Ajouter les réactifs dans l ordre indiqué au Tableau 5 Mélanger doucement le CRYIA1/CRYIA2 en pipetant et centrifuger brièvement Diviser le en parties aliquotes de 48 µl dans des tubes de réaction PCR de 0,2 ml Ajouter 2 µl de la solution d ADN aux parties aliquotes précédentes Mélanger doucement et centrifuger brièvement Placer les tubes de réaction PCR dans le thermocycleur

25 Détection qualitative du maïs MON810, du maïs Bt-176 et du soja Roundup Ready par PCR 25 Programme PCR (CRYIA1/CRYIA2) Température Durée Dénaturation initiale 95 C 3 mn Dénaturation 95 C 40 s Hybridation Extension 60 C 72 C 40 s 40 s Nombre de cycles 25 Extension finale 72 C 3 mn 4 C Après l amplification, les échantillons sont centrifugés brièvement et placés dans la glace. Préparation du n 2 Les réactifs nécessaires pour une série de 10 échantillons sont mélangés conformément aux instructions du Tableau 8. La procédure suivante s applique à un échantillon contenant 49 µl de CRYIA3/CRYIA4 et 1 µl de solution d ADN pré-amplifiée de la première PCR. Toutes les solutions sont conservées dans la glace durant la préparation du. Tableau 8. CRYIA3/CRYIA4 Concentration finale pour un échantillon pour 10 échantillons Eau déionisée stérile 33,75 µl 337,5 µl Tampon PCR 10x 1x 5 µl 50 µl 25 mm de MgCl 2 2,5 mm 5 µl 50 µl 4 mm de dntp 0,2 mm 2,5 µl 25 µl 20 µm d oligonucléotides CRYIA3 0,5 µm 1,25 µl 12,5 µl 20 µm d oligonucléotides CRYIA4 0,5 µm 1,25 µl 12,5 µl ADN polymérase Taq 0,025 U/µl 0,25 µl 2,5 µl TOTAL 49 µl 490 µl

26 Détection qualitative du maïs MON810, du maïs Bt-176 et du soja Roundup Ready par PCR 26 Préparer un tube microcentrifuge de 1,5 ml Ajouter les réactifs dans l ordre indiqué au Tableau 6 Mélanger doucement le CRYIA3/CRYIA4 en pipetant et centrifuger brièvement Diviser le en parties aliquotes de 49 µl dans des tubes de réaction PCR de 0,2 ml Ajouter 1 µl de la solution d ADN aux parties aliquotes précédentes Mélanger doucement et centrifuger brièvement Placer les tubes de réaction PCR dans le thermocycleur Programme pour la PCR nichée (CRYIA3/CRYIA4) Température Durée Dénaturation initiale 95 C 3 mn Dénaturation 95 C 40 s Hybridation Extension 60 C 72 C 40 s 40 s Nombre de cycles 35 Extension finale 72 C 3 mn 4 C Après l amplification, les échantillons sont centrifugés brièvement et placés dans la glace. Analyse de produits PCR Suite à l amplification, les produits PCR sont analysés par électrophorèse sur gel d agarose en présence de bromure d éthidium. 8 µl de la solution sont mélangés avec 2 µl de tampon de charge ; la solution est ensuite chargée sur un gel d agarose (2,5%). La migration doit s effectuer à 100 V pendant une durée d 1 heure. Des étalons de masse moléculaire (15 µl d échelle 100 pb) migrent dans les puits adjacents du gel afin de déterminer avec précision la taille des amplicons. Après l opération, une transillumination avec lumière UV permet de visualiser l ADN dans le gel. Le gel peut être pris en photo afin de fournir un enregistrement permanent du résultat de l essai.

27 Détection qualitative du maïs MON810, du maïs Bt-176 et du soja Roundup Ready par PCR 27 Interprétation des résultats Les paires d amorces CRYIA1/CRYIA2 et CRYIA3/CRYIA4 ont été mises au point pour détecter spécifiquement le gène cryia(b) synthétique par PCR nichée, produisant un fragment de 189 pb. Ce gène est présent dans la lignée de maïs Bt-176 et d autres lignées (par ex. Bt-11). Le contrôle positif s amplifiera en présentant une bande à 189 pb. Le contrôle négatif et l absence de matrice ne devraient pas donner de bande visible. Si les contrôles positifs/négatifs ne donnent pas les résultats escomptés, l analyse PCR des échantillons sélectionnés n est pas valable. Si les contrôles donnent les résultats escomptés et si l échantillon donne une bande à 189 pb, cela signifie que cet échantillon contient de l ADN de maïs Bt-176. Détection du soja Roundup Ready La cible est le gène EPSPS CP4, qui confère la résistance à l herbicide Roundup. Caractéristiques des amorces GMO5, GMO9, GMO7 et GMO8 GMO5 CCACTGACGTAAGGGATGACG Longueur (pb) 21 Poids moléculaire (g/mol) 6479,4 Point de fusion * (G/C) 59,5 GMO9 CATGAAGGACCGGTGGGAGAT Longueur (pb) 21 Poids moléculaire (g/mol) 6559,4 Point de fusion * (G/C) 59,5 GMO7 ATCCCACTATCCTTCGCAAGA Longueur (pb) 21 Poids moléculaire (g/mol) 6309,6 Point de fusion * (G/C) 55,8 GMO8 TGGGGTTTATGGAAATTGGAA Longueur (pb) 21 Poids moléculaire (g/mol) 6579,8 Point de fusion * (G/C) 51,7 *sur la base d un [Na+] de 50 mm

28 Détection qualitative du maïs MON810, du maïs Bt-176 et du soja Roundup Ready par PCR 28 Contrôles Contrôle positif : ADN de la matière de référence (RRS 0,1% GM) Contrôle négatif : ADN de la matière de référence (soja 0% GM) Absence de matrice : contrôle négatif du, où l ADN est remplacé par de l eau Préparation du n 1 Les réactifs nécessaires pour une série de 10 échantillons (y compris les contrôles positifs/négatifs/absence de matrice) sont mélangés conformément aux instructions du Tableau 9. La procédure suivante s applique à un échantillon contenant 48 µl de GMO5/GMO9 et 2 µl de solution d ADN. Toutes les solutions sont conservées dans la glace durant la préparation du. Tableau 9. GMO5/GMO9 Concentration finale pour un échantillon pour 10 échantillons Eau déionisée stérile 32,75 µl 327,5 µl Tampon PCR 10x 1x 5 µl 50 µl 25 mm de MgCl 2 2,5 mm 5 µl 50 µl 4 mm de dntp 0,2 mm 2,5 µl 25 µl 20 µm d oligonucléotides GMO5 0,5 µm 1,25 µl 12,5 µl 20 µm d oligonucléotides GMO9 0,5 µm 1,25 µl 12,5 µl ADN polymérase Taq 0,025 U/µl 0,25 µl 2,5 µl TOTAL 48 µl 480 µl Préparer un tube microcentrifuge de 1,5 ml Ajouter les réactifs dans l ordre indiqué au Tableau 7 Mélanger doucement le GMO5/GMO9 en pipetant et centrifuger brièvement Diviser le en parties aliquotes de 48 µl dans des tubes de réaction PCR de 0,2 ml Ajouter 2 µl de la solution d ADN aux parties aliquotes précédentes Mélanger doucement et centrifuger brièvement Placer les tubes de réaction PCR dans le thermocycleur

29 Détection qualitative du maïs MON810, du maïs Bt-176 et du soja Roundup Ready par PCR 29 Programme PCR (GMO5/GMO9) Température Durée Dénaturation initiale 95 C 3 mn Dénaturation 95 C 30 s Hybridation 60 C 30 s Extension 72 C 40 s Nombre de cycles 25 Extension finale 72 C 3 mn 4 C Après l amplification, les échantillons sont centrifugés brièvement et placés dans la glace. Préparation du n 2 Les réactifs nécessaires pour une série de 10 échantillons sont mélangés conformément aux instructions énumérées dans le Tableau 10. La procédure suivante s applique à un échantillon contenant 49 µl de GMO7/GMO8 et 1 µl de solution d ADN pré-amplifiée de la première PCR. Toutes les solutions sont conservées dans la glace durant la préparation du. Tableau 10. GMO7/GMO8 Concentration finale pour un échantillon pour 10 échantillons Eau déionisée stérile 33,75 µl 337,5 µl Tampon PCR 10x 1x 5 µl 50 µl 25 mm de MgCl 2 2,5 mm 5 µl 50 µl 4 mm de dntp 0,2 mm 2,5 µl 25 µl 20 µm d oligonucléotides GMO7 0,5 µm 1,25 µl 12,5 µl 20 µm d oligonucléotides GMO8 0,5 µm 1,25 µl 12,5 µl ADN polymérase Taq 0,025 U/µl 0,25 µl 2,5 µl TOTAL 49 µl 490 µl

30 Détection qualitative du maïs MON810, du maïs Bt-176 et du soja Roundup Ready par PCR 30 Préparer un tube microcentrifuge de 1,5 ml Ajouter les réactifs dans l ordre indiqué au Tableau 8 Mélanger doucement le GMO7/GMO8 en pipetant et centrifuger brièvement Diviser le en parties aliquotes de 49 µl dans des tubes de réaction PCR de 0,2 ml Ajouter 1 µl de la solution d ADN aux parties aliquotes précédentes Mélanger doucement et centrifuger brièvement Placer les tubes de réaction PCR dans le thermocycleur Programme pour la PCR nichée (GMO7/GMO8) Température Durée Dénaturation initiale 95 C 3 mn Dénaturation 95 C 30 s Hybridation 60 C 30 s Extension 72 C 40 s Nombre de cycles 35 Extension finale 72 C 3 mn 4 C Après l amplification, les échantillons sont centrifugés brièvement et placés dans la glace. Analyse des produits de la PCR Après l amplification, les produits de la PCR sont analysés par électrophorèse sur gel d agarose en présence de bromure d éthidium. 8 µl de la solution sont mélangés avec 2 µl de tampon de charge ; la solution est ensuite chargée sur un gel d agarose (2,5%). La migration doit s effectuer à 100 V pendant une durée d 1 heure. Des étalons de masse moléculaire (15 µl d échelle 100 pb) migrent dans les puits adjacents du gel afin de déterminer avec précision la taille des amplicons. Après l opération, une transillumination avec lumière UV permet de visualiser l ADN dans le gel. Le gel peut être pris en photo afin de fournir un enregistrement permanent du résultat de l essai.

31 Détection qualitative du maïs MON810, du maïs Bt-176 et du soja Roundup Ready par PCR 31 Interprétation des résultats Les paires d amorces GMO5/GMO9 et GMO7/GMO8 ont été mises au point pour détecter spécifiquement le gène chimère du soja Roundup Ready par PCR nichée, produisant un fragment de PCR nichée de169 pb. Les amorces GMO5 et GMO7 sont complémentaires du promoteur CaMV 35S, l amorce GMO9 s hybride avec le gène EPSPS CP4 de la souche CP4 du Agrobacterium sp. et l amorce GMO8 avec le gène EPSPS CTP. Le contrôle positif s amplifiera en présentant une bande à 169 pb. Le contrôle négatif et l absence de matrice ne devraient pas donner de bande visible. Si les contrôles positifs/négatifs ne donnent pas les résultats escomptés, l analyse PCR des échantillons sélectionnés n est pas valable. Si les contrôles donnent les résultats escomptés et si l échantillon donne une bande à 169 pb, cela signifie que cet échantillon de soja Roundup Ready contient de l ADN.

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