PRODUCTION DE PROTEINES RECOMBINANTES DANS DES CELLULES DE MAMMIFERES ET DES ANIMAUX TRANSGENIQUES

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1 PRODUCTION DE PROTEINES RECOMBINANTES DANS DES CELLULES DE MAMMIFERES ET DES ANIMAUX TRANSGENIQUES Pourquoi les cellules de mammifères? - Elles permettent la production de protéines complexes : anticorps et facteurs de coagulation. Fabrication de vaccins recombinants, facteurs sanguins. - Amélioration de l expression des protéines par rapport aux autres systèmes : - glycosylation : la N-glycosylation est possible dans les lignées cellulaires de mammifères - repliement des protéines. Nombre de protéines recombinantes (biomédicaments) produites dans les différents systèmes : 39% de cellules de mammifères, 29% de cellules d E. coli, 18% de Saccharomyces, 11% de cellules hybrides, très peu de cellules d insecte ou de cellules d animaux transgéniques. I. Production dans des cellules 1. Les lignées de cellules de mammifères utilisées Lignée Nature Mode de croissance BHK 21 Cellules de rein de hamster syrien Adhérentes NSO Myélome murin de souris En suspension CHO Cellules d ovaires de hamster chinois Adhérentes HEK 293 Cellules de rein d embryon Adhérentes, certaines en humain suspension Les lignées cellulaires de mammifères sont répertoriées par l ECACC (européen) et ATCC (américain). 2. Autres types cellulaires Cellules souches somatiques Cellules souche embryonnaires Culture de cellules primaires 1 3. Les vecteurs utilisés dans les cellules de mammifères - Plasmides - Adénovirus - Rétrovirus : virus de la leucémine murine de Moloney, lentivirus - Baculovirus

2 a) Les plasmides Les plus courants : pcdna, pires. b) Les adénovirus Virus non enveloppé à ADN db, linéaire de kb Hôtes naturels de l homme pour certains, utilisation des sérotypes 2 et 5 (non tumorigènes, non oncogènes) Large tropisme Génome adénoviral code 11 protéines différentes. Gène précoce E, gène tardif L. Délétion de la région E1/E3 pour l utilisation comme vecteur. E1/E3 code pour la capside virale, qui est reconnue par les Ac. Si on enlève ces éléments, le plasmide n est pas reconnu et on peut l utiliser comme plasmide. Ces vecteurs adénoviraux permettent d insérer jusqu à 8 kb d ADN étranger. L adénovirus recombiné est utilisé pour transfecter des cellules (HEK 293 modifiées pour produire les protéines E1, éventuellement E3). Dans ces cellules, l ADN viral est répliqué et les protéines virales sont produites. Les virions formés sont récoltés et serviront à transduire les cellules dans lesquelles on souhaite exprimer le transgène. L adénovirus recombinant peut infecter de nombreux types cellulaires (en prolifération, mais aussi quiescents). Après transduction virale de la cellule hôte, présence de nombreuses copies du virus. Ceci permet une forte expression transitoire du transgène. Les gènes viraux ne sont pas exprimés (absence des protéines transactivatrices E1 et E3 parfois. Le transgène est exprimé à partir d un pcmv. Exemple d un vecteur adénoviral : système Clontech : Adeno X Le gène d intérêt va être inséré dans un plasmide. Régions importantes pour le mettre sur l adénovirus. On obtient un gène recombiné avec le gène d intérêt. Le plasmide shuttle sera coupé par des enzymes de restriction particulières : Pi-Sce I qui reconnait une séquence relativement longue donc probabilité de coupure relativement faible. Quand on a multiplié le vecteur pshuttle2, on met l enzyme de restriction et on va peut-être retrouver une ou 2 coupures. On récupère ainsi le morceau qu on va rajouter sur l adénovirus par un système de clonage classique. Les 2 éléments sont mélangés, on fait une ligation in vitro et on rajoute l enzyme Swa I. Swa coupe le fragment de l adénovirus qui est supposé être à la place du fragment qu on veut rajouter. Sans cette enzyme, il y a compétition entre les 2 fragments, en présence de l enzyme ce n est plus le cas. Transformation E. coli et purification, puis Pac I qui va linéariser. 2

3 Ensuite méthode de transfection pour faire rentrer le plasmide dans le vecteur HEK. Ce sont les cellules HEK qui permettront de donner les adénovirus recombinés. Purification des Adénovirus recombinants : Recueil des plages de lyse : caractérisation du vecteur, amplification dans les cellules 293 et éclatement des cellules. Purification sur gradient de CsCl et dialyse. Caractérisation finale : - vérification de la structure de l adénovirus recombinant - titration des particules virales - vérification de l absence de particules adénovirales réplicatives. c) Les rétrovirus Famille de virus enveloppés à ARN trouvée chez tous les vertébrés. S intègrent dans l ADN de la cellule hôte. Outils puissants pour infecter tout type de cellules de mammifères en division ou en quiescence. Les différents types de rétrovirus γ-rétrovirus : virus simple Lentivirus et spumavirus : organisation plus complexe avec gag pol env plus d autres gènes codant des protéines virales. Vecteurs dérivés des rétrovirus Rétrovirus MoMLV (virus de la leucémie murine de Moloney) Remplacement des gènes gag pol env par le transgène. On peut infecter des virus en prolifération mais pas en quiescence. Encapsidation du gène thérapeutique dans la capside et l enveloppe virale ADN plasmidique sur lequel on a mis la construction avec le site d encapsidation, le LTR et le gène d intérêt. On transfecte : par électrophoration ou par un autre moyen on amène l ADN dans la cellule, pour former des virus recombinés. L ADN à portée va s intégrer dans la cellule d encapsidation. Permet 2 choses : la transcription du génome et l expression des différentes protéines qui sont celles de la capside, synthétisées dans le cytoplasme. On reforme l encapsidation càd l ADN va être entouré de la capside viral, qui sort par bourgeonnement. Rétrovirus infectieux à réplication-incompétent qui servira juste à véhiculer le morceau de gène. 3

4 Transduction de cellules cibles et expression du gène thérapeutique Rétrovirus recombinant : après infection, on retrouve la capside à l intérieur de la cellule cible, ainsi que l ARN qui va être rétrotranscrit grâce à la transcriptase inverse en ADN db, pour s intégrer dans la cellule cible. Les vecteurs rétroviraux : - si le vecteur rétroviral dérivé de MoMLV : transfection des cellules en mitose uniquement. - Pour la transfection de cellules quiescentes : utilisation de vecteurs dérivés des lentivirus qui présentent des séquences permettant le transport du génome viral à travers la membrane nucléaire (cppt = central polyurine tract). Les vecteurs rétroviraux permettent : - La transduction de nombreux types cellulaires (cultures primaires, cellules souches) - L obtention d une expression stable par intégration du transgène dans le génome de la cellule hôte, taux d expression dépend du lieu d insertion. 4. Régulation de l expresson dans les cellules de mammifères a) Le système TetOn / TetOff (Clontech) Le système TetOff En amont du promoteur, TRE MOD va reconnaitre une molécule tta qui est une protéine transactivatrice hybride formé du domaine de liaison à l ADN de tetr associé à 3 unités du domaine transactivateur de la protéine VP16 de HSV. Se lie en absence de tétracycline. Fonctionne pour activer la transcription. La transcription du gène se fait en absence de tétracycline : il y a un site de fixation sur tta, si la tetracycline se fixe, TRE inhibe la transcription. Dans TetOff : transcription du transgène en absence de tétracycline. Le système TetOn La construction de départ est la même, l élément TRE est modifié. C est surtout le répresseur qui est modifié de ne manière à se fixer à la TRE uniquement quand il y a de la tétracycline ou de la doxycycline. 4

5 rtta : protéine transactivatrice formée du domaine de liaison à l ADN de tetr associé à 3 unités du domaine transactivateur de la protéine VP16 de HSV. Dans TetOn : La transcription du gène ne se fait qu en présence de tétracycline. Il faut que rtta soit présent. Remarque : dans ce système inductible, nécessité d utiliser des cellules exprimant la protéine transactivatrice. HEK (ou autres cellules modifiées). 5. Protéines d intérêt thérapeutiques produites dans des cellules de mammifères a) Production de l activateur tissulaire du plasminogène = tpa = protéase à sérine Dissolution des caillots sanguins par action sur la fibrine. t-pa est un agent fibrinolytique puissant administré lors d infarctus du myocarde, embolie pulmonaire, AVC d origine ischémique. Un déficit en t-pa mène à un risque accru de thromboses. Son mode d action : Transformation du plasminogène en plasmine par le t-pa. La plasmine active la dégradation de la fibrine en produits de dégradation de la fibrine. La spécialité : l Altéplase, obtenu par génie génétique, est une glycoprotéine de 527 acides aminés, 335 cystéines, 14 ponts disulfures et de nombreux sites de glycosylation. Identique à l activateur tissulaire du plasminogène ou t-pa. Premier médicament produit commercialement à partir de culture de cellules de mammifères en 1987 par Genentech. Réservé à l usage hospitalier, administré par voie IV, coût d environ 2200 $/100 mg. La production dans les CHO (hamsters chinois) coûte environ $/g. II. Production de protéines recombinantes à partir d animaux transgéniques Animal transgénique : animal dont le patrimoine génétique a été modifié par l homme. Notamment la souris, le lapin, le porc, le mouton. 5

6 1. Principe général On utilise le gène naturel chez l animal qui code la béta caséine : en vert le promoteur de la béta caséine. On rajoute le gène étranger. On fabrique une structure hybride pour mettre le nouveau gène sous contrôle du promoteur de la béta caséine. Production de protéines recombinantes grâce à diverses techniques de transgénèse. 2. Les différentes techniques de transgénèse a) Microinjection d ADN dans un pronucléus But : intégrer ce nouvel ADN dans le chromosome. Exemple de la souris - Traitement hormonal de la souris femelle - Accouplement des souris mâle et femelle - Prélèvement et sélection des ovules fécondés : pronucléus mâle et femelle - Micro-injection directe de la solution d ADN dans le pronucléus mâle - Réimplantation de l embryon micro-injecté dans l oviducte de la souris Tous les souriceaux n auront pas intégré le transgène mais si la recombinaison homologue se fait : intégration du matériel apporté dans le matériel génétique. - Génotypage de la descendance : présence du transgène révélée par les fragments obtenus par PCR - Extraction de la protéine recombinante (dans le lait généralement) D après le schéma de la PCR : les souris 1 et 2 sont qualifiées d animaux fondateurs (génération F0). Le pourcentage de réussite varie de 0 à 20%. La ligne germinale est stable. b) Technique ICSI L ICSI (intracytoplasmic sperm injection) est largement utilisée en clinique comme méthode de reproduction médicalement assistée dans le cas de stérilité humaine dans les laboratoires pour des recherches sur la reproduction. But : introduction d un spermatozoïde (après mise en contact avec l ADN étranger) dans le cytoplasme d un ovocyte. Principal avantage de l ICSI : possibilité d obtenir de longs fragments d ADN avec une efficacité relativement bonne en comparaison avec l injection dans les pronucléi. 6

7 - Prélèvement des spermatozoïdes : une fois prélevés, ils seront mis en contact avec l ADN étranger dans un milieu de culture. - Recueil des ovocytes : injection d hcg pour permettre l ovulation et ainsi avoir un ovocyte mature. Prélèvement de l ovocyte au stade métaphase II (présence d un globule polaire). - ICSI : un spermatozoïde sera directement injecté dans le cytoplasme de l ovocyte à l aide de pipettes en verre très fines. Un microscope équipé d une excellente optique et une paire de micromanipulateurs seront nécessaires. Ensuite le processus de la fécondation se poursuit come une fécondation naturelle (in vitro). Si la fécondation (la fusion de noyaux des 2 gamètes) a eu lieu normalement, on peut observer après l injection, la présence des deux pronucléi au centre du cytoplasme et la présence du deuxième globule polaire dans l espace périvitellin. Introduction des embryons chez des femelles receveuses. La descendance porte dans son génome le gène étranger (taux de réussite : 20%). c) L infection virale Récupération des cellules de la morula, infection virale par éléments rétroviraux. d) Transgénèse via le transfert de noyau Le clonage par transfert de noyau a donné naissance à la brebis Dolly. Transfert d un noyau d une cellule différente dans une cellule énuclée. On obtient le noyau d une cellule différenciée dans un environnement différent : reprogrammation génétique. Principe : cellules génétiquement modifiées, puis sélectionnées comme donneuses de noyau pour réaliser des clonages. Polly : premier mammifère cloné transgénique. Facteur IX de la coagulation humain. Protocole : - Isolement des cellules somatiques ou pluripotentes, mise en culture - Des cellules sont transfectées avec un vecteur permettant l addition ou le remplacement de gène. - Sélection des clones porteurs du gène étranger par une double sélection positive et négative. - Introduction du noyau ou de la cellule sélectionnée dans le cytoplasme d un ovocyte énucléé Formation d un embryon complet. - Introduction de l embryon dans une mère adoptive e) Utilisation des cellules souches embryonnaires Cellules du stade blastocyste : cellules pluripotentes puisqu elles peuvent donner les 3 feuillets embryonnaires. Cellules non différenciées. Elles sont caractérisées par 2 propriétés majeures : - l auto-renouvellement : population pure de cellules indifférenciées pendant de longues périodes de culture - la pluripotence : capacité de générer tous les types cellulaires de l organisme. 7

8 Un outil idéal pour la thérapie cellulaire et la production d animaux transgéniques. Le génome de ces cellules peut être modifié en culture. On peut : - supprimer un gène (knock-out = invalidation génique), - remplacer un gène (knock-in), - apporter un nouveau gène (transgénèse additive). Les souriceaux d intérêt sont ceux qui ont intégré la nouvelle séquence dans les cellules germinales (ovules ou spermatozoïdes). La couleur agoutie est dominante sur la couleur noire. +/- = hétérozygote. Inconvénients : - méthode longue - applicable uniquement à des animaux prolifiques - très utilisée pour la souris - pas de succès chez les grands animaux. III. Exemples de protéines produites dans l animal 1. L antithrombine L antithrombine AT : inhibiteur de la protéase qui clive la prothrombine en thrombine, une substance qui joue un rôle essentiel dans le processus de la coagulation sanguine. Chèvres transgéniques possédant le gène humain de l AT, produit de l AT recombinante dans le lait. ATryn : première molécule commerciale obtenue à partir de chèvres transgéniques. AMM le 26 juillet 2006 en Europe, accord FDA en 2009 (USA). Prévention des accidents thromboemboliques chez les patients atteints de déficience héréditaire de production d T (pathologie touchant 1/5000). On peut produire des quantités très importantes par cette technique. 2. Le facteur IX Le facteur de coagulation IX est une protéine dont le rôle est essentiel dans la régulation de la coagulation du sang. Sa déficience entraine une hémophilie : naissance de la brebis Polly, la première brebis transgénique clonée produite par la technique de transfert nucléaire -> protéine facteur de coagulation IX dans le lait. 8

9 3. Les anticorps recombinants Les chaines légères L sont formées de 2 domaines : - un domaine variable VL - un domaine constant CL. Les chaines lourdes H comportent : - un domaine N-terminal variable (VH) - 3 ou 4 domaines constants (CH). Evolution structurale des anticorps monoclonaux à usage thérapeutique. Murin chimérique (partie variable de murin) humanisé humain. On peut produire des chaines d Ig totalement humaines chez les animaux. Principe de la production d anticorps humain par la Xenomouse : voir schéma Cellules ES murines : - inactivation des gènes murins codant la chaine lourde IgH et inactivation des gènes murins codant la chaine légère Igk souche de souris immunodéficiente incapable de produire des anticorps murins - introduction du locus humain IgL et introduction du locus humain IgH souche de souris produisant des anticorps humains et murins. On croise les deux souris obtenues souche de souris produisant des anticorps humains = Xenomouse. Plusieurs techniques appliquées pour le transfert des gènes dans un animal : Elles se différencient par leur plus ou moins bonne adaptation aux différentes catégories d animaux et par l efficacité de la transgénèse. Avantages : Ces techniques permettent l intégration d un gène étranger dans une cellule. Les sources naturelles de protéines médicamenteuses sont limitées, nécessité de produire par d autres moyens certaines protéines à visée thérapeutique. Cette technique permet de produire des protéines modifiées afin d augmenter par exemple l efficacité de la molécule médicamenteuse (en modifiant par exemple quelques AA). Animaux transgéniques Souris Lapin Chèvres Vache Quantité de protéines recombinantes produites dans le lait 1 g 1 kg/an 1 kg 1 tonne/ an Plusieurs tonnes/an Inconvénients : Faibles taux de production, de fécondation et de développement de ces animaux. Parmi les premiers individus transgéniques d une ignée, bon nombre sont des animaux mosaïques = ils sont porteurs dans certaines cellules seulement du transgène en question. 9