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1 EFS Santé Département Oncogenèse et Biotechnologie Immunobiologie et Immunothérapie des cancers Pierre-François Meyer 2012

2 Laboratoire R&D-EFS Santé Le laboratoire dans lequel j ai effectué mon stage d excellence au cours du mois de juillet 2012 se spécialise dans le domaine de la biologie cellulaire et plus particulièrement en immunologie. L intitulé de la recherche au sein de ce laboratoire est «Immunobiologie et Immunothérapie des cancers». L équipe étudie les cellules immunitaires impliquées lors du développement tumorale dans l objectif de développer de nouvelles stratégies thérapeutiques. L étude est portée principalement sur les cellules dendritiques, qui sont à la base de la réponse immunitaire, et sur les lymphocytes T cytotoxiques. La particularité de leur recherche est qu ils travaillent sur des cellules dendritiques plasmocytoïdes (PDC) qui, comme ils ont pu le montrer auparavant, jouent un rôle majeur dans la réponse anti-tumorale en sécrétant de nombreux intermédiaires et en stimulant les lymphocytes T cytotoxiques spécifiques. Le but de la recherche est de développer un vaccin et ou une thérapie pour le cancer en se concentrant principalement sur le mélanome. L objectif est d utiliser les PDCs de manière à ce qu ils engendrent une réaction immunitaire spécifique au cancer. Dans le cas du mélanome, l objectif est de rendre les PDCs sensible à la présence de protéines spécifiques des cellules tumorales afin d assurer une réponse immunitaire plus rapide et plus forte. Pour réaliser cela il faut donc effectuer une transduction des PDC avec un gène d intérêt afin qu ils puissent réagir. Le travail au sein du laboratoire est divisé. J ai pu travailler spécifiquement sur deux parties bien distinctes. Biologie Moléculaire L équipe travaille au sein d un projet Européen et est donc en collaboration avec d autres équipes notamment une basée à l University College London (UCL). L équipe d UCL a déjà mis en place une partie biologie moléculaire visant à la production de nombreux plasmides portant des gènes d intérêts qui peuvent ensuite être utilisés pour la transduction de cellules. Lorsque je suis arrivé, le laboratoire R&D était, à son tour, en train de mettre en place un travail en biologie moléculaire afin de créer une réserve de différents gènes qu ils pourront utiliser par la suite afin d être autonome. Biologie cellulaire Une fois que les plasmides sont produits en quantité suffisante ils peuvent ensuite être utilisés pour la transduction des PDCs afin de s inscrire dans la stratégie globale de l équipe. L objectif pour nous était d incorporer le ou les gènes d intérêts au sein des PDCs puis de vérifier s il y avait ensuite réaction par rapport à des cellules «malades».

3 Activités au sein du laboratoire Biologie Moléculaire Transformation bactérienne Dans un premier temps je me suis retrouvé impliqué dans la mise en place d une réserve de différents plasmides portant des gènes d intérêts. A la base l équipe disposait de tous ces plasmides mais dans une quantité extrêmement faible. Pour cette raison mon rôle (en binôme avec une autre stagiaire issue de deuxième année d IUT de biologie) était de procéder, en premier lieu, à une transformation bactérienne. Pour cela, on utilise une lignée cellulaire C2988J qui est particulièrement utile pour ce genre de manipulation. On note que tous les plasmides que l on souhaite incorporer dans les bactéries codent pour un gène de résistance à la carbenicillin. J ai ensuite procédé à la manipulation suivante : 1) 25uL de bactéries sont incuber dans la glace dans un eppendorf de 0.5mL. NB : On utilise une micropipette de 200uL pour faire ce prélèvement car on ne dispose que de pipettes de 10, 20, 200 et 1000uL 2) 2uL de plasmide sont ajoutés aux bactéries (toujours dans la glace) et une incubation de 20 à 60 minutes commence. 3) On procède ensuite à un choque thermique. L objectif de ce choc est de dilater la membrane bactérienne afin de permettre aux plasmides de rentrer au sein des bactéries. On déplace donc l eppendorf de 0.5mL dans un bain marie à 42 C pendant exactement 25s puis on remet le tout dans la glace au moins 2 minutes. 4) On ajoute ensuite 250uL de milieu de croissance bactérien qui optimise la transformation des cellules compétentes: le SOC puis on met le milieu sous une agitation de 200 rpm (Rotations par minutes), à 37 C pendant 40 à 80 minutes. Cette transformation bactérienne a pour seul et unique but la production en masse du plasmide incorporé. Cette dernière étape vise donc à commencer le développement bactérien. On procède ensuite à la distribution du mélange préalablement créer sur un milieu d agarose dans des boites de pétri. Ce milieu d agarose favorise la croissance bactérienne et contient de la carbenicillin. Ainsi, toutes les bactéries non transformées seront éliminées par l antibiotique ce qui permet de faire une première sélection des cellules transformées.

4 5) On réparti le milieu SOC + bactérie dans une boite de pétri en faisant bien attention à répartir largement avec une baguette afin d obtenir un maximum de colonies bactériennes isolées. Les miniprep, midiprep et les digestions enzymatiques Culture de masse Pour optimiser la production de plasmides, l idée est de produire en grande quantité des bactéries ayant incorporées le plasmide d intérêt. Dans un premier temps on va d abord chercher à vérifier que les bactéries ont bel et bien incorporées le plasmide. La croissance sur le milieu d agarose contenant de la carbenicillin participe à la sélection. Dans un second temps, l objectif va être de vérifier par digestion puis par southern blot que les bactéries possèdent le plasmide. Suite à la mise en culture en boite de pétri on va donc prélever une colonie que l on va ensuite mettre dans un milieu de culture bactérien en présence de carbenicillin. On fait d abord cela en petite quantité. En effet, on ne va pas procéder à une culture bactérienne de masse avant d être absolument certain que les bactéries ont répondues correctement à la transformation. Afin de maximiser nos chances de trouver, au sein de nos premières cultures, une colonie de bactéries ayant complètement intégrée le plasmide, il est important de choisir une colonie très isolée et, si possible, de faire plusieurs cultures avec des colonies différentes. Dans notre cas, à chaque fois que l on faisait une nouvelle transformation nous mettions ensuite 4 colonies en culture. La marche à suivre pour cette mise en culture est la suivante : - On utilise une pipette pour mettre 5 ml de milieu LB (milieu de culture bactérien) dans un tube à essaie de 15 ml à fond rond - On ajoute 10uL de carbenicillin. Ceci nouveau dans un but de sélection. On s assure ainsi qu aucune bactérie n ayant pas incorporé le plasmide ne puisse contaminer notre milieu de culture. - On prélève une colonie au sein de notre boite de pétri à l aide d un cône en plastique que l on plonge dans le tube. Ce tube est ensuite fermé mais pas de manière hermétique pour permettre la respiration bactérienne. NB : La colonie doit être la plus isolée possible afin de minimiser le risque de contamination par une autre colonie qui, elle, n aurait pas été transformée, et inversement. - Les cultures sont mises sous une agitation de 250 rpm à 37 C pendant 12h à 16h. Miniprep On va donc chercher à récupérer l ADN contenue dans les bactéries. Pour cela, il existe des kits. Dans notre cas nous utilisions le QIAprep Spin Miniprep kit de Qiagen.

5 L objectif est simple : il faut lyser la bactérie et se défaire de l ADN bactérien pour récupérer uniquement l ADN plasmidien. Les étapes de cette manipulation sont les suivantes : 1) On prélève 1.5mL de la culture bactérienne que l on centrifuge à G pendant 3 minutes afin de faire former un culot par les bactéries. 2) On remet les bactéries en suspension dans 250uL dans un tampon nommé P1 qui est un tampon de suspension. 3) On ajoute ensuite 250uL d un tampon de lyse qui va permettre de lysée les bactéries et de libérer l ADN. En revanche, il faut faire attention à ne pas faire durer cette étape plus de 5 minute car cela risque d endommager l Adn. 4) Il suffit de rajouter 350uL d un tampon qui neutralise le tampon de lyse et qui arrête la réaction. 5) On centrifuge ensuite 10 min à rpm 6) Le surnageant est ensuite passé à travers une colonne qui va retenir l ADN plasmidien. On effectue une première centrifugation de 60s. 7) On nettoie ensuite la colonne avec 750uL d un quatrième tampon nommé PE. Par la suite il faut faire deux centrifugations successives d environ 60s chacune pour nettoyer puis pour éliminer des résidus de ce tampon. 8) On utilise enfin 50uL de tampon d élution pour éluer l ADN dans un eppendorf NEUF. NB : Toute cette manipulation se fait avec des eppendorfs de 0.5mL sauf pour l étape 8 qui se fait dans un eppendorf de 1.5mL. Digestion enzymatique Afin de vérifier que la transformation est efficace il suffit de montrer que l ADN plasmidien récupéré au sein de nos bactéries correspond à celui que l on souhaitait incorporer. Pour cela on soumet l ADN extrait à l activité de plusieurs enzymes différentes : - EcoR1 et HindIII simultanément - NhEI seul - BgL2 et Xho1 simultanément On n oublie pas de garder un test qui, lui, n est soumis à aucune activité enzymatique. Ainsi, connaissant les sites de restrictions de chacune de ces enzymes on peut ensuite effectuer une vérification par southern blot. Lorsque l on fait la digestion on a utilisé des quantités considérées comme «standard» d enzyme en rapport avec la quantité de plasmide.

6 Puits 1 Quantités Puits 2 Quantités Puits 3 Quantités Puits 4 Quantités Tampon 4 3uL Tampon 4 3uL Tampon 4 3uL Tampon 4 3uL BSA 0, 3uL EcoRI 0.5uL BSA 0, 3uL BSA 0, 3uL Eau stérile 23.7uL HindIII 0.5uL NheI 0.5uL Tampon 3 3uL Eau stérile 23uL Eau stérile 23,2uL BgL2 0.5uL XhoI 0.5uL Eau stérile 19.7uL Plasmide 3uL Plasmide 3uL Plasmide 3uL Plasmide 3uL NB : Les tampons favorisent le bon fonctionnement de la digestion En revanche, ces quantités ne sont pas arrêtées puisque, dans certain cas, nous nous sommes trouvés dans l obligation de les modifier pour obtenir des résultats plus clairs. Lorsque les concentrations de plasmides sont très élevées par exemple, il faut augmenter les volumes d enzymes et réduire les volumes de plasmide dans chaque puits. Le Southern blot Le southern blot vise donc à vérifier simplement que le plasmide a bien été incorporé. Sachant que l on connaît la structure de notre plasmide (modèle plasmidique SFG qui présente des gènes rapporteurs), les sites de restrictions des enzymes utilisées et le gène incorporé dans le plasmide il suffit de comparer le résultat de notre migration. On compare notamment en utilisant le logiciel clone manager qui permet de visualiser le résultat à obtenir et celui réellement obtenu. Figure : carte des sites de restrictions enzymatiques des plasmides utilisés dans le cadre de nos expériences

7 On note que le type de gel employé pour nos migrations contenait : 1,5g d agarose pour 150 ml de TBE (Tris, Borate, EDTA) qui est un tampon de migration et, 15uL de gel red qui est un colorant servant à l observation de l ADN. Photo : exemple de résultat obtenu dans le cas d un plasmide contenant le gène d intérêt env. Dans le puits 1 on observe des markers de taille, dans les puits 2 à 5 on observe le plasmide non digéré, digéré par EcoRI+HindIII, par NheI puis par BgL2 et XhoI pour des plasmides extraits d une première colonie bactérienne. Dans les puis 6 à 9 on retrouve la même chose mais pour des plasmides issus d une seconde colonie bactérienne. Les midi prep Les midi prep se présentent de manière exactement similaire au mini prep. En revanche, elles se font après vérification des bactéries par digestion enzymatique. En effet, les midi prep permettent de récupérer l ADN plasmidien contenu dans un très grand nombre de bactéries. Elles permettent donc de constituer notre réserve de plasmides. Une fois que les midi prep sont effectuées, on se livre à un dosage de la concentration en plasmide des échantillons récupérés. Pour le dosage, on utilise une machine qui : -effectue le dosage en ng/ul - mesure l absorbance à 280nm - mesure l absorbance à 260nm - donne le ratio de ces deux absorbances Ce ratio est très important car il permet de définir si il y a une contamination de l ADN plasmidien par de l ADN bactérien ou par des protéines. Place dans la stratégie générale L'étude porte principalement sur les cellules du système immunitaire qui sont impliquées dans les réponses au développement tumoral, ceci dans un but de recherche thérapeutique. Dans cet objectif, l'équipe se concentre et sur les cellules dendritiques et sur les lymphocytes T cytotoxiques qui jouent un rôle majeur dans les réponses anti-tumorales. Les objectifs sont les suivants: - faciliter la présentation des peptides de Class I -Augmenter l'amplification des cellules T spécifiques -Comprendre les mécanismes d'actions - Transduire différents gène codant dans les cellules de la lignée GEN-T, GEN2.2, B-EBV (cellules dendritiques plasmocytaires) --> Protéines tumorales ou virales --> Epiptotes de class I

8 --> Epiptotes de class II --> Molécules Co-stimulatrices --> Protéines virales qui interfèrent avec l'expression de HLA Pour atteindre ces objectifs nous sommes donc obliger de passer par 3 étapes: 1) La transformation bactérienne: - incorporation du plasmide d'intérêt dans une bactérie (E. Coli optimisées pour les transformations NEB 5-alpha competent cells) - Amplification du plasmide par culture bactérienne 2) La transfection qui vise à incorporer le plasmide dans des cellules de la lignée GEN sans utiliser de vecteur viral. - Le gène dans le plasmide est exprimé par les cellules 3) La transduction qui vise à incorporer le plasmide dans le génome des cellules de la lignée GEN en utilisant un rétrovirus. - Le gène est intégré dans le génome des cellules - Les protéines sont exprimées de manière permanente.

9 Les étapes précédentes nous permettent de produire les plasmides que l on va incorporer dans les cellules de la lignée GEN-T mais aussi de produire le surnageant rétrovirale qui va permettre la transduction de ces même cellules (ie : gagpol et env) Le travail en biologie moléculaire est donc indispensable à la mise en place du travail en biologie cellulaire et il permet aussi de le compléter en permettant la vérification des résultats. Expression protéique et western blot Lors du stage, on a aussi commencé à mettre en place la possibilité de faire des western blot au sein du laboratoire. En effet, nous avion des cellules transduites pour lesquelles nous devions déterminer si elles avaient été correctement transformées. Pour réaliser cela il fallait déterminer la présence d une protéine (protéine Mage 3). Pour cela il fallait donc effectuer un western blot. Sachant que cette manipulation n avait pas été mise en place au sein du laboratoire depuis longtemps nous avons été responsable de la relancer totalement. Nous avons donc procédé à

10 l épluchage des protocoles puis, à l inventaire du matériel afin d avoir un matériel complet et en bon état pour réaliser ceci. Biologie Cellulaire Au cours de mon stage, j ai été impliqué dans la biologie cellulaire mais de manière nettement inférieure. Dans la continuité de notre travail en biologie moléculaire nous devions travailler avec comme objectif final la transduction des cellules de la lignée GEN par un rétrovirus. Pour réaliser cela on doit tout d abord se livrer à une triple transfection d'une lignée cellulaire dite de "packaging" qui va servir à la production du rétrovirus. Dans notre cas, on a utilisé les cellules HEK 293T qui sont des cellules de reins d embryons humains. On incorpore 3 plasmide: - Env (RD114) - Gagpol (peq-pam3-e) - le plasmide d intérêt Env est une protéine virale qui sert à la formation de l'enveloppe virale. Gag code la matrice virale, la capside ainsi que les nucléoprotéines alors que Pol est associé à une transcriptase inverse et à une intégrase. Ainsi, Gagpol et Env vont permettre la formation d'un rétrovirus qui présentera dans son génome le gène d'intérêt. Ces cellules sont ensuite misent en culture ce qui entraine la formation d'un surnageant rétroviral. La dernière étape consiste donc en la transduction des cellules d'intérêt (ie: GEN) en utilisant ce surnageant. Ces cellules sont ensuite misent en culture. Lorsque je suis arrivé, l étudiante avec qui je travaillais possédait déjà deux lignées cellulaires : - une lignée de HEK qui avait servies à la transfection de PDCs par Melan-A - une ligné de GEN transfectée par Melan-A Purification d une lignée Dans un premier temps on s est attelé à vérifié que les cellules avaient bien était transfectée. Pour cela, nous avons utilisé le phénotypage par FACS en utilisant un marquage CD 34. En effet, comme montré précédemment, les plasmides contenaient un gène codant pour CD34. Lors du marquage on s est aperçue qu une très faible proportion de nos cellules avaient été transfectées. Pour cette raison, les mettre en culture n était pas d une grande utilité pour nous. Nous avons donc procédé à une purification de nos cellules en utilisant une colonne contenant un Ac qui fixerait spécifiquement CD 34. Ainsi, on conserverait uniquement les cellules CD34+ et, ainsi, les cellules Melan-A+.

11 Figure : Résultats du FACS. Seulement 11.8% de nos cellules sont CD34+ Figure : Résultats du FACS après purification et remise en culture de la lignée purifiée Lorsque je suis parti, nous nous venions de montrer que ces cellules exprimaient bien la protéine Mage 3 comme prévu. En revanche, nous nous apprêtions à réaliser un second marquage intracellulaire pour Melan- A, le premier ayant été un échec.

12 Le stage d excellence J ai pu bénéficier du stage d excellence grâce à mes résultats en L1. Je dois avouer que je n aurais pas fait de stage cette année si je n avais pas été sélectionné. Ce stage m a permis de réellement découvrir quel est le métier de chercheur : un travail de passionné. J ai énormément apprécié l impression de faire partie d une équipe et ce sentiment d effort de groupe. J ai aussi beaucoup appris au niveau biologie cellulaire et immunologie. Avant tout, je regrettais au début l absence de stage dans certains domaines. Par contre, cela m a poussé à faire un effort et à faire ma propre démarche au sein du laboratoire R&D et auprès de Joël PLUMAS. J aimerais d ailleurs le remercier de m avoir accueillit au sein de son équipe alors que mes connaissances étaient restreintes. Ce stage m a vraiment permis de découvrir un domaine de recherche qui pourrait, à terme, être le mien. Le stage d excellence est une bonne manière d encourager les élèves à découvrir le monde de la recherche et à se lancer rapidement dans les stages en laboratoire. Pour moi, cela a été une expérience très enrichissante et formatrice. J espère pouvoir en bénéficier à nouveau l année prochaine.

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