Titre du sujet : Evaluation de différentes routes d'administration in vivo dans la thérapie génique non-virale de la mucoviscidose
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- Claudine Roussy
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1 Fiche sujet pour le recrutement d un contrat doctoral 2013 (à faire parvenir aux responsables de GD de l ED SICMA par les Directeurs d Unités pour le 11 mars 2013) Il est impératif que cette fiche ne dépasse pas 7 PAGES Titre du sujet : Evaluation de différentes routes d'administration in vivo dans la thérapie génique non-virale de la mucoviscidose Bourse ministérielle Financement demandé : Indiquer l origine du cofinancement (s il y a lieu) : NOM, Prénom Montier Tristan Tél Titre Laboratoire Equipe interne Section CNU/CNRS HDR 2013 Directeur de thèse Co-directeur (s il y a lieu) Co-encadrant (s il y a lieu) Tristan.Montier@univ-brest.fr PhD - HDR Unité INSERM è "Biochimie et Biologie moléculaire" Noms des doctorants actuellement encadrés (date de 1 ère inscription et date estimée de soutenance) Co -encadrement : Nawael Belmadi (1er octobre 2012 ; Novembre 2015) 1
2 Renseigner les informations suivantes pour chaque docteur ayant soutenu depuis le 01/01/2009 et ayant été encadré par le directeur (et co-directeur s il y a lieu) de thèse. Préciser tout abandon de thèse s il y a lieu. Directeur(s) de thèse NOM : Lindberg Prénom : Mattias LEHN Pierre (Dir) MONTIER Tristan (co-dir) NOM : Le Gallo Prénom : Matthieu CATROS Véronique (Dir) MONTIER Tristan (Co-Dir) Durée de la thèse (mois) 36 mois 42 mois Mois et année inscription er février 2005 Mois et année soutenance 21 novembre juillet 2008 Financement de la thèse Source : Montant : Publications des doctorants qui ont soutenu avec le demandeur Auteur : Titre : Journal : Région Bretagne / 3 ans Lipothiophosphoramidates for gene delivery: critical role of the cationic polar headgroup. Fraix A, Montier T, Le Gall T, Sevrain CM, Carmoy N, Lindberg MF, Lehn P, Jaffrès PA. Org Biomol Chem. 2012;10(10): The gene transfection properties of a lipophosphoramidate derivative with two phytanyl chains LINDBERG M, CARMOY N, LE GALL T, FRAIX A, BERCHEL M, LORILLEUX C, COUTHON-GOURVES H, BELLAUD P, FAUTREL A, JAFFRES PA, LEHN P, MONTIER T. Biomaterials, 2012, 33(26): Deux autres publications sont en cours de rédaction dont Mattias Lindberg sera le premier auteur. Ligue contre le cancer 22 Activation of tumor-specific T cells by dendritic cells expressing the NY-ESO-1 antigen after transfection with the cationic lipophosphoramide KLN5. Le Gallo M, Toutirais O, Montier T, Cabillic F, Bouet F, Delépine P, Lehn P, Jotereau F, Catros V. J Gene Med. 2008;10(6):
3 Situation actuelle CDD CDI Employeur Post-Doc Université ou Etablissement Mattias Lindberg est en attente d'un stage postdoctoral aux USA. Post-doctorant UMR CNRS 6061 (Rennes Claude Prigent) Titre Evaluation de différentes routes d'administration in vivo dans la thérapie génique non-virale de la mucoviscidose Depuis plus de 15 ans, notre équipe "Transfert de gènes et Thérapie génique" - Unité INSERM 1078 travaille en collaboration avec des chimistes brestois et rennais (UMR CNRS UBO et UMR CNRS 6226 ENSC - Rennes), sur le développement et l'optimisation de vecteurs synthétiques pour le transfert de gènes et de biomolécules d'intérêt thérapeutique. Grâce à une meilleure compréhension de l'organisation moléculaires des complexes et de leur devenir extra et intracellulaire, nous avons accru très significativement leur efficacité de transfection, notamment in vivo en adaptant progressivement leur structure chimique et leur formulation. Grâce à l'apport de la bioluminescence et de la fluorescence in vivo, nous sommes allés encore plus loin dans l'étude du comportement in vivo des complexes afin d'en accroître l'efficacité tout en limitant leurs potentiels effets toxiques et inflammatoires. Nous avons ainsi démontré que ces vecteurs peuvent permettre une expression du gène rapporteur au niveau des cellules épithéliales pulmonaires que ce soit après injection systémique ou bien après voie locale (Intranasal ou Intratréachéal). Nous avons également démontré que ces formulations sont peu toxiques, non immunogéniques et peuvent donc être réadministrées. Contexte Si de nombreux vecteurs viraux ont été élaborés au regard de leur forte efficacité de transduction, ces systèmes viraux souffrent des inconvénients liés à leur nature et mode de production biologique, en particulier des problèmes d immunogénicité et d oncogénicité. Ces limites ont conduit à explorer une voie alternative de transfection faisant appel à la vectorisation de l ADN au moyen de molécules obtenues par synthèse chimique. Outre qu il s agit de molécules bien caractérisées sur le plan physico-chimique, ces vecteurs non-viraux ont aussi d autres avantages comme l absence de risques infectieux, une immunogénicité nulle et une facilité de production à grande échelle. De plus, il n y a pas de limite de taille ou de nature du transgene véhiculé par les vecteurs synthétiques. Sur le plan de l évaluation in vitro de nouveaux composés ou de nouvelles formulations, notre équipe dispose des outils nécessaires à la culture cellulaire mais aussi des instruments permettant d évaluer l efficacité et la biodistribution des complexes in vivo. Nous avons par ailleurs développé un système d'analyse micro volumique à partir de sang total permettant de mesurer la tolérance de ces administrations chez l'animal, à la fois en terme de toxicité et d'inflammation - réponse immunitaire. Dernièrement, en collaboration avec l'équipe de Steve Hyde à Oxford (UK), nous nous sommes également doté d'un appareillage permettant la nébulisation des complexes ADN/lipides dans une cage d'aérosolisation, permettant la transfection de plusieurs souris simultanément. 3
4 Objectifs identifiés Caractère novateur Collaborations nationales et internationales Retombées Dans le cadre de la thérapie génique de la mucoviscidose, notre objectif est d atteindre les cellules épithéliales respiratoires afin d y apporter le gène sain correcteur de la déficience génétique. Or, nous avons démontré que les lipoplexes développés à Brest étaient en mesure de conduire à une expression du gène rapporteur dans les pneumocytes de type II aussi bien après injection systémique qu'après administration locale. Ces études ont d'abord été menées chez la souris saine. Dans le cadre de ce travail de thèse, nous souhaitons procéder à des expériences d'administration et de réadministration similaires chez l'animal cf -/- pour voir si nous pouvons restituer l expression du transgène. Par voie IV, nous avons récemment démontré que nous obtenions une expression de la protéine CFTR. Nous ignorons encore si cette protéine est fonctionnelle et si elle est bien localisée au pole apicale des cellules épithéliales. Cette approche sera complétée par des études de fluorescence et par immunohistochimie sur coupes de tissus. Ensuite, nous procéderons à des études de dépôts nasals et d'aérosolisation. Cela nous permettra de comparer les différentes voies d'administration à la fois en terme d'efficacité d'expression du transgène mais aussi en terme de tolérance. Dans le cadre de ce projet de recherche, nous travaillerons sur la formulation des complexes selon la voie d'administration, sur l'évaluation de nouveaux vecteurs ± co-lipides et de plasmides dépourvus de séquences CpG. Peu de formulations lipidiques ont aujourd'hui fait la preuve de leur efficacité après aérosolisation. Des travaux préliminaires en collaboration avec l'équipe d'oxford ont permis de démontrer que les vecteurs brestois étaient en mesure d'assurer une transfection efficace dans ces conditions. Ce travail permettra également de développer de nouvelles compétences et s'inscrira donc dans le cadre des développements technologiques de la plateforme nationale IBiSA "SynNanoVect" et de la suite du projet stratégique porté par l AFM. Ce projet s'inscrivant dans le cadre d'une thérapeutique future de la mucoviscidose, il s'agit de continuer à développer à la fois de nouveaux vecteurs toujours plus performants, d'acquérir des informations sur le comportement des lipoplexes afin de les optimiser selon la voie d'administration mais aussi de mettre au point des techniques innovantes en terme d'approche thérapeutique de la maladie. Depuis plusieurs années, ce travail sur le développement de vecteurs synthétiques s effectue dans le cadre d un partenariat étroit avec deux équipes de chimistes (UMR CNRS 6521 UBO et UMR CNRS 6226 ENSC Rennes). Ce projet est parfaitement dans cette continuité et s inscrit également dans le cadre de la plate-forme nationale IBiSA «SynNanoVect» ainsi que dans le projet stratégique supporté par l AFM. Sur le plan des plasmides, nous collaborerons également avec l'équipe de Steve Hyde à Oxford qui a démontré que les séquences CpG contenus dans les plasmides étaient pour partie responsable de la réaction inflammatoire initiale ainsi que de la diminution de l'expression du gène rapporteur. Comme nous l avons indiqué, nous développons principalement ces vecteurs synthétiques dans le cadre d une future thérapie génique de la mucoviscidose. Cependant, depuis peu, nous avons montré au travers de travaux menés en propre sur le mélanome ou en collaboration sur la transfection des hépatocytes ou de cellules dendritiques que les applications potentielles de ces molécules étaient beaucoup plus larges. Nous avons également montré qu ils pouvaient permettre de transférer de grands fragments d ADN (>100 kb) ou encore qu ils pouvaient transporter des sirna pour inhiber tel ou tel gène cible. Le développement de ces vecteurs synthétiques constitue donc un intérêt majeur pour tous les domaines faisant appel à la transfection non-virale. 4
5 Title Context EVALUATION OF DIFFERENT IN VIVO ADMINISTRATION ROUTES FOR THE NON-VIRAL GENE THERAPY OF CYSTIC FIBROSIS In order to achieve transgene expression in most tissues, it is mandatory to use a system to carry the genetic material into the nucleus of the cell. Indeed, among other issues, DNA poorly interacts with the cell membrane by itself, due to its negative global charge and hydrophilic nature. Different strategies have been developed to solve these problems. Physical means like gene guns or electroporation exist, but they are irrelevant regarding pulmonary gene transfer because of the poor accessibility of the targeted tissue. However, viral and synthetic GTAs have shown encouraging results during the past decades. Viral vector have high transduction efficiency but are expensive and trigger immune responses in the patients after repeated use. Synthetic GTAs, however, are easy to engineer and nonimmunogenic. Their main drawback is lower transfection efficiency than viruses. Hence, current work on synthetic GTAs focus on that issue. The Gene Therapy team (Pr. P. Lehn and Dr. T. Montier), subunit of the INSERM U1078 (Pr. C Férec), is working on the development and study of synthetic GTAs, more specifically cationic lipids (CL). Indeed, their close partnership with the team of chemist supervised with Pr. PA Jaffres (UMR CNRS 6521, Brest) grant them access to a variety of original synthetic GTAs for diverse in-vitro and invivo gene transfer applications, and they developed various cationic lipids with a view to reach the best compromise between efficacies and side-effects to the target cells or animals. This collaboration already resulted in the design of several CLs showing good transfection efficiency in-vitro. Now, the main issue when studying synthetic GTAs is that the mechanisms underlying their ability to transfect cells are yet poorly understood. Thus, most of the trials with synthetic GTAs have been interpreted empirically, although they were designed following a rational. It is possible to conduct structure-function studies, but they are very difficult, because most of the time, even a change of a single atom in the molecule might have striking effects on the ability of the GTA to transfect. Studies performed to assess the transfection efficiency of GTAs in vivo have mainly been conducted by systemic injections of the transgene. If it is indeed a practical way for these kinds of studies, the interest for clinical applications regarding CF is limited. Here, we will explore the different administration ways and their relevance regarding CF gene therapy. Objectives Novelty of the project 5
6 International collaboration Expectations 6
Directeur de thèse HdR obligatoire. Co-encadrant (s il y a lieu) HdR non-obligatoire. Co-directeur (s il y a lieu) HdR obligatoire
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