Analyse chirale de stimulants du groupe «éphédrine» par électrophorèse capillaire

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1 Analyse chirale de stimulants du groupe «éphédrine» par électrophorèse capillaire

2 Par la présente, je soussigné, Pierre Schlungs, né le 17 mai 1985 à Luxembourg, déclare avoir réalisé ce travail par mes propres moyens. 2

3 Pierre Schlungs Candidat-professeur de Chimie Au Lycée Technique d Esch-sur-Alzette Analyse chirale de stimulants du groupe «éphédrine» par électrophorèse capillaire Laboratoire National de Santé Division Toxicologie Luxembourg,

4 Résumé Introduction : Les substances du type «éphédrine» sont des produits stimulants du système nerveux central. En médecine traditionnelle chinoise on utilise depuis des milliers d années le Ma Huang, une médecine à base de plantes du genre Ephedra, renfermant entre autres la (-)-éphédrine et la (+)-pseudoéphédrine, pour le traitement de rhumes, de toux et d asthme. En Afrique de l Est et au Moyen Orient on mâche les feuilles du khat, une plante renfermant des substances du type «éphédrine». Ces substances peuvent avoir plusieurs effets comme augmenter la vigilance, réprimer la faim ou provoquer un sentiment d euphorie. L abus de ces substances est fréquent, d un côté à cause des propriétés mentionnées, mais d un autre côté également à cause de leur utilisation pour la synthèse de stimulants du type «amphétamine». Les différentes substances du type «éphédrine» ont des propriétés pharmacologiques et des utilisations différentes. Leur structure chimique presqu identique ne permet pas une séparation par des méthodes de routine utilisées en toxicologie clinique et médico-légale. But : Pour ce travail, 6 substances du type «éphédrine» ont été choisies. D après mes recherches, il n y a pas de publication qui décrit une séparation rapide (<20 minutes) de l ensemble des 6 substances. Le but du présent travail est donc de développer une méthode simple et rapide pouvant être utilisée en routine au laboratoire de toxicologie et permettant la séparation des substances suivantes par électrophorèse capillaire (EC): la (+)-éphédrine, la (-)-éphédrine, la (+)- pseudoéphédrine, la (+)-noréphédrine, la (-)-noréphédrine et la (+)-norpseudoéphédrine. Après optimisation, la méthode développée devrait être utilisée pour l analyse de quelques produits renfermant/censés à renfermer ces substances. Finalement, la méthode devrait être appliquée à l analyse d échantillons d urines, pour en permettre le dosage. Méthodes : La séparation des substances se fait par EC. L EC permet la séparation de molécules chargées ou neutres dans un champ électrique. Par rapport à d autres méthodes de séparation utilisées en routine au laboratoire, elle a l avantage que le temps d analyse est en général plus court et qu elle ne nécessite pas d étapes de dérivatisation préalables ou de solvants «exotiques». En plus l EC ne nécessite que de faibles volumes de solvants et d échantillons. 4

5 Résultats : Aucune cyclodextrine testée n a permis la séparation totale des 6 analytes. Deux cyclodextrines, la γ-cyclodextrine hautement sulfatée (HS-γ-CD) et la heptakis(2,6-di-ométhyl)-β-cyclodextrine (DIMEB) ont fourni de bons résultats et ces deux ont été retenues pour les analyses. Bien qu une séparation totale ne fût pas possible, l utilisation de deux cyclodextrines différentes a permis de développer deux méthodes de séparation complémentaires qui permettent l analyse de nombreuses combinaisons des substances. Les séparations se font en utilisant des capillaires d un diamètre interne de 75 µm et un tampon phosphate 50 mm à ph 2,5. L emploi de la HS-γ-CD à une concentration de 1% (w/v) à une température de 20 C et avec une tension de 24 kv permet une séparation de 5 des 6 analytes en 12 minutes. Avec l ordre de migration suivant: (+)-noréphédrine ((+)-NEP) < (+)-éphédrine ((+)-EP) < (+)- pseudoéphédrine ((+)-PSE) < (-)-éphédrine ((-)-EP) < (-)-noréphédrine ((-)-NEP). Cette méthode permet une séparation totale des énantiomères de l éphédrine et de la noréphédrine. L emploi de la DIMEB à une concentration de 20 mm à une température de 25 C et avec une tension de 24 kv permet une séparation des 6 analytes en 12 minutes. Avec l ordre de migration suivant: (-)-noréphédrine < (+)-noréphédrine < (+)-norpseudoéphédrine < (-)- éphédrine < (+)-éphédrine < (+)-pseudoéphédrine. Cette méthode permet une séparation totale de la (±)-noréphédrine, de la (+)-pseudoéphédrine, de la (+)-norpseudoéphédrine ((+)-NPSE) et de la (+)-éphédrine. La méthode a été validée en combinaison avec la 2-phényléthylamine en tant que standard interne pour la HS-γ-CD, respectivement la scopolamine pour la DIMEB à une concentration de 20 µg/ml et est applicable à l analyse et au dosage d échantillons. Les analyses ont permis de confirmer la composition de plusieurs médicaments/produits (Ephédrine,HCl, Recatol mono, Cirrus, Alvalin ), mais ont également révélé un produit contrefait (Ephedra Supercabs) qui ne contenait pas de l extrait de Ma Huang comme indiqué, mais de la (+)-PSE à une concentration de 68,3 mg/capsule. Le khat, une plante qui jusqu à présent n a pas pu être analysée avec succès au laboratoire de toxicologie (chromatogrammes obtenus par chromatographie liquide à haute performance (CLHP) ou chromatographie en phase gazeuse (GC) inexploitables), a également été analysé et ses constituants actifs principaux (cathinone, cathine et noréphédrine) ont été détectés. La méthode a été appliquée au dosage d échantillons d urine collectés après ingestion d un ou de plusieurs comprimés des médicaments analysés. Les résultats de la validation montrent que 5

6 la méthode est répétable et sensible et peut être employée pour l analyse de la (-)-EP, de la (+)-PSE et de la (±)-NEP dans l urine. En effet, la concentration des analytes dans l urine est généralement assez élevée puisqu ils sont presque totalement excrétés par voie urinaire (par exemple : 11,7-33,2 µg de (+)-PSE par ml d urine entre 6 et 8,5 heures après ingestion d un comprimé de Cirrus ). Conclusion: Cette étude a montré que l électrophorèse capillaire en combinaison avec les cyclodextrines HS-γ-CD et DIMEB est un outil puissant pour l analyse chirale de produits ou d échantillons d urine renfermant des substances du type «éphédrine». Bien qu une séparation totale ne fût pas possible, les séparations partielles ont permis l analyse de tous les échantillons étudiés. Les temps d analyse inférieurs à 14 minutes sont nettement plus courts que ceux trouvés dans la littérature, ce qui favorise l emploi de ces méthodes en routine. 6

7 Remerciements Je tiens à remercier Monsieur le Docteur Michel Yegles pour m avoir donné la possibilité d effectuer ce travail au sein de son laboratoire. Je le remercie en particulier pour le temps qu il m a consacré et ses conseils pratiques, qui m ont aidé à surmonter les nombreux problèmes rencontrés. Merci aussi à tout le personnel du Laboratoire de Toxicologie pour leur aide précieuse et le temps agréable que j y ai passé. 7

8 Liste des abréviations AM : CD : CG : CG-SM : CLHP : DIMEB : EC : EC-ESI-SM : ECZ : EOF : EP : FDA : HS-β-CD : HS-γ-CD : IS : LOD : LLOD : LOQ : LLOQ : MA : NEP : NPSE : PEA : PSE : SCA : SM : STA : T éb : T fus : UV : Amphétamine Cyclodextrine Chromatographie en phase gazeuse Chromatographie en phase gazeuse couplée à la spectrométrie de masse Chromatographie liquide à haute performance Heptakis(2,6-di-O-méthyl)-β-cyclodextrine Electrophorèse capillaire Electrophorèse capillaire couplée à un ionisateur par électrospray et à un spectromètre de masse Electrophorèse capillaire de zone Flux électroosmotique Ephédrine Food and Drug Administration β-cyclodextrine hautement sulfatée γ-cyclodextrine hautement sulfatée Standard interne Limite de détection Limite de détection inférieure Limite de quantification Limite de quantification inférieure Métamphétamine Noréphédrine Norpseudoéphédrine 2-Phényléthylamine Pseudoéphédrine Scopolamine Spectrométrie de masse Substances de type «amphétamine» Température d ébullition Température de fusion Ultraviolet 8

9 Table des matières 1 Les stimulants du type «éphédrine» Structure chimique Occurrence et utilisation Caractéristiques chimiques La situation dans le monde 17 2 Les méthodes d analyses énantiosélectives en toxicologie analytique La chromatographie liquide à haute performance La chromatographie en phase gazeuse couplée à la spectrométrie de masse L électrophorèse capillaire Historique Principe et théorie Fonctionnement Flux électrophorétique Flux électroosmotique L appareillage Les capillaires Les modes d injection Les techniques de séparation La séparation énantiomérique Les modes de détection Séparation et dosage de substances du type «éphédrine» 31 3 Le but du travail 35 4 Matériel et méthodes Matériel Appareil d électrophorèse capillaire Tampons Solutions de référence Standards internes Cyclodextrines Echantillons Conditions optimisées Extraction 41 5 Résultats et discussion Mise au point de la méthode Choix du sélecteur chiral Influence du ph de l électrolyte Influence de la tension appliquée Influence de la température Influence de la concentration de l électrolyte Influence de la concentration en CD Autres facteurs Analyse de solutions de référence 52 9

10 5.2.1 Les courbes de calibration Utilisation de la HS-γ-CD a Courbe de calibration de la (+)-EP b Courbe de calibration de la (-)-EP c Courbe de calibration de la (+)-NEP d Courbe de calibration de la (-)-NEP e Courbe de calibration de la (+)-PSE f Courbe de calibration de la (+)-NPSE g Résumé h Conclusions Utilisation de la DIMEB a Courbe de calibration de la (+)-EP b Courbe de calibration de la (-)-EP c Courbe de calibration de la (-)-NEP d Courbe de calibration de la (+)-NEP e Courbe de calibration de la (+)-PSE f Courbe de calibration de la (+)-NPSE g Résumé h Conclusions Analyse et dosage d échantillons Analyse du médicament Recatol mono Analyse du médicament Alvalin Analyse du médicament Cirrus Analyse des comprimés Ephédrine,HCl Analyse des capsules Ephedra Supercabs Analyse du khat Conclusion Analyse et dosage d urines Mise au point Méthodes d extraction Electrophérogramme Courbes de calibration a Courbe de calibration de la (-)-EP b Courbe de calibration de la (+)-PSE c Courbe de calibration de la (-)-NEP d Courbe de calibration de la (+)-NEP Résumé Dosage d échantillons d urines a Urines collectées après ingestion de Cirrus b Urines collectées après ingestion de Recatol mono c Urines collectées après ingestion d Ephédrine,HCl Conclusions 76 6 Conclusion générale et perspectives 77 7 Bibliographie 79 10

11 a) Illustrations Illustrations et Tableaux Figure 1.1 : Les dérivés de la phényléthylamine 13 Figure 1.2 : Les énantiomères de l éphédrine et de la pseudoéphédrine 13 Figure 1.3 : Les énantiomères de la noréphédrine et de la norpseudoéphédrine 13 Figure 1.4 : Décomposition enzymatique lors du stockage 15 Figure 1.5 : (±)-EP 16 Figure 1.6 : (±)-PSE 16 Figure 1.7 : (±)-NEP 17 Figure 1.8 : (±)-NPSE 17 Figure 2.1 : Nombre de laboratoires illégaux de MA découverts aux Etats-Unis 18 Figure 2.2 : L effet de l EOF sur la migration des particules 24 Figure 2.3 : Ordre de migration des particules en EC 25 Figure 2.4 : Le signal observé en fonction du profil de migration 25 Figure 2.5 : Schéma d un système EC 26 Figure 2.6 : Injection hydrodynamique 27 Figure 2.7 : Injection électrocinétique 28 Figure 2.8 : Structure des cyclodextrines 29 Figure 2.9 : Principe de la séparation chirale en EC en présence de CDs 30 Figure 5.1 : Séparation de la (±)-NEP et de la (±)-EP par la HS-γ-CD 44 Figure 5.2 : Séparation de la (±)-NEP, de la (±)-EP, de la (+)-PSE et de la (+)-NPSE par la HS-γ-CD 44 Figure 5.3 : Séparation de la (±)-NEP, de la (±)-EP et de la (+)-PSE par la DIMEB 45 Figure 5.4 : Influence du ph sur la résolution d un mélange racémique d EP et de NEP avec la HS-γ-CD 46 Figure 5.5 : Influence de la tension sur la résolution des énantiomères de la NEP et de l EP en présence de HS-γ-CD 47 Figure 5.6 : Influence de la tension sur la résolution des énantiomères de la NEP et de l EP en présence de DIMEB 48 Figure 5.7 : Influence de la concentration de l électrolyte sur la résolution des énantiomères de la NEP et de l EP en présence de HS-γ-CD 49 Figure 5.8 : Influence de la concentration en HS-γ-CD sur la résolution des énantiomères de la NEP et de l EP 50 Figure 5.9 : Influence de la concentration en DIMEB sur la résolution des énantiomères de la NEP et de l EP 50 Figure 5.10 : Courbe de calibration de la (+)-EP en présence de HS-γ-CD 53 Figure 5.11 : Courbe de calibration de la (-)-EP en présence de HS-γ-CD 54 Figure 5.12 : Courbe de calibration de la (+)-NEP en présence de HS-γ-CD 54 Figure 5.13 : Courbe de calibration de la (-)-NEP en présence de HS-γ-CD 54 Figure 5.14 : Courbe de calibration de la (+)-PSE en présence de HS-γ-CD 55 Figure 5.15 : Courbe de calibration de la (+)-NPSE en présence de HS-γ-CD 55 Figure 5.16 : Courbe de calibration de la (+)-EP en présence de DIMEB 57 Figure 5.17 : Courbe de calibration de la (-)-EP en présence de DIMEB 57 Figure 5.18 : Courbe de calibration de la (-)-NEP en présence de DIMEB 57 Figure 5.19 : Courbe de calibration de la (+)-NEP en présence de DIMEB 58 Figure 5.20 : Courbe de calibration de la (+)-PSE en présence de DIMEB 58 Figure 5.21 : Courbe de calibration de la (+)-NPSE en présence de DIMEB 58 Figure 5.22 : Analyse du médicament Recatol mono 60 11

12 Figure 5.23 : Analyse du médicament Alvalin 61 Figure 5.24 : Analyse du médicament Cirrus 62 Figure 5.25 : Analyse des comprimés Ephédrine,HCl 63 Figure 5.26 : Analyse des capsules Ephedra Super Cabs 64 Figure 5.27 : Analyse du khat 65 Figure 5.28 : Electrophérogramme provenant d une urine dopée de (-)-EP, (+)-PSE et (±)-NEP après extraction 69 Figure 5.29 : Courbe de calibration de la (-)-EP dans l urine en présence de DIMEB 70 Figure 5.30 : Courbe de calibration de la (+)-PSE dans l urine en présence de DIMEB 70 Figure 5.31 : Courbe de calibration de la (-)-NEP dans l urine en présence de DIMEB 71 Figure 5.32 : Courbe de calibration de la (+)-NEP dans l urine en présence de DIMEB 71 Figure 5.33 : Analyse d une urine collectée 8,5 heures après ingestion d un comprimé Cirrus 72 Figure 5.34 : Analyse d une urine collectée 9 heures après ingestion d un comprimé Recatol mono 73 Figure 5.35 : Analyse d une urine collectée 4 heures après ingestion de 3 comprimés Ephédrine,HCl (25 mg (-)-EP,HCl) 75 b) Tableaux Tableau 5.1 : Conditions de séparation optimales 52 Tableau 5.2 : Paramètres des droites de calibration, LLOD et LLOQ des substances analysées 55 Tableau 5.3 : Répétabilité et justesse de la méthode en intra-jour (n=10) 56 Tableau 5.4 : Paramètres des droites de calibration, LLOD et LLOQ des substances analysées 59 Tableau 5.5 : Répétabilité et justesse de la méthode en intra-jour (n=10) 59 Tableau 5.6 : Rendements d extraction des méthodes modifiées 68 Tableau 5.7 : Paramètres des droites de calibration, LLOD et LLOQ des substances analysées 71 Tableau 5.8 : Répétabilité et justesse de la méthode en intra-jour (n=10) 72 Tableau 5.9 : Résumé des résultats d analyse d urine après ingestion d un comprimé Cirrus 73 Tableau 5.10 : Résumé des résultats d analyse d urine après ingestion d un comprimé Recatol mono 74 Tableau 5.11 : Résumé des résultats d analyse d urine après ingestion de 3 comprimés Ephédrine,HCl (25 mg (-)-EP,HCl) 75 12

13 1. Les stimulants du type «éphédrine» 1.1 Structure chimique La phényléthylamine (R 1 =R 2 =R N =H) constitue la structure de base des composés du type «éphédrine» (Figure 1.1). R 2 NH N R R 1 Figure 1.1: Les dérivés de la phényléthylamine La substitution de la chaîne alkyle en R 1 par un groupe méthyle et en R 2 par un groupement hydroxyle, ainsi que de la fonction amine en R N par un groupe méthyle, crée la sous-catégorie des composés du type «éphédrine». Cette substitution provoque la formation de deux centres stéréogènes. Ainsi, selon la position relative des substituants, on obtient les deux énantiomères de l éphédrine, ou de son diastéréoisomère, la pseudoéphédrine (Figure 1.2). OH OH NH NH CH3 CH3 CH 3 (1R,2S)-(-)-éphédrine OH NH CH3 CH 3 CH 3 (1S,2R)-(+)-éphédrine OH NH CH 3 CH3 (1S,2S)-(+)-pseudoéphédrine (1R,2R)-(-)-pseudoéphédrine Figure 1.2: Les énantiomères de l éphédrine et de la pseudoéphédrine La substitution de R N par un atome d hydrogène, donne naissance aux énantiomères de la noréphédrine, respectivement de la norpseudoéphédrine (Figure 1.3). O H N H H O H N H H C H 3 C H 3 (1R,2S)-(-)-noréphédrine O H N H H C H 3 (1S,2R)-(+)-noréphédrine O H N H H C H 3 (1S,2S)-(+)-norpseudoéphédrine (1R,2R)-(-)-norpseudoéphédrine Figure 1.3: Les énantiomères de la noréphédrine et de la norpseudoéphédrine 13

14 1.2 Occurrence et utilisation En médecine traditionnelle chinoise on utilise depuis des milliers d années le Ma Huang, une médecine à base de plantes du genre Ephedra, pour le traitement de rhumes, de toux et d asthme 1. Ces plantes contiennent plusieurs substances du type «éphédrine», dont majoritairement les stéréoisomères naturels: (-)-EP et (+)-PSE. Leurs énantiomères (+)-EP et (-)-PSE ne sont pas produits par des plantes et leurs présences dans un produit, prouve son origine synthétique. La (-)-EP, comme toutes les substances du type «éphédrine», est un stimulant du système nerveux central. Elle a des propriétés bronchodilatrices, augmente la vigilance, réprime la fatigue et augmente le taux en acides gras libres dans le sang 2. Jusqu aux années 1970, la (-)-EP était la substance de premier choix contre l asthme. A cause des propriétés mentionnées, de nombreux produits destinés à augmenter les performances sportives et/ou à maigrir renfermaient de la (-)-EP en combinaison avec d autres substances (vitamines, caféine, ). Depuis quelques années ces produits ont été interdits et ont principalement disparu du marché 3. Néanmoins des sprays, respectivement des solutions nasales contenant de la (-)-EP à faible dose pour décongestionner le nez, sont vendus dans les pharmacies et des comprimés renfermant de l éphédrine pure, respectivement de l extrait d Ephedra en combinaison avec de la caféine et de l acide acétylsalicylique (ECA) sont fréquemment vendus en cachette dans des centres de sports, afin d accélérer l amaigrissement, respectivement augmenter les performances sportives. La (+)-PSE est un stimulant plus doux que la (-)-EP, mais est un vasoconstricteur plus puissant. Pour cette raison, elle se retrouve dans beaucoup de médicaments destinés à traiter le rhume, en décongestionnant le nez. En combinaison avec des antihistaminiques, la (+)-PSE se retrouve dans beaucoup de médicaments (par exemple Clarinase et Cirrus ) pour traiter la conjonctivite allergique et les symptômes du rhume des foins 4. Depuis des siècles, les habitants de l Afrique de l Est et de la péninsule arabique consomment le khat. Le khat (Catha edulis) est une espèce d arbuste originaire d Afrique orientale. Dans ces régions plus de 20 millions de gens consomment du khat quotidiennement, ce qui montre qu il s agit d une tradition socioculturelle fermement ancrée. Les populations de ces régions mâchent les feuilles fraîches pour leur effet stimulant et euphorisant comparable à celui de l'amphétamine. Ces effets sont principalement provoqués par la (-)-cathinone, une substance fortement psychoactive, mais très instable. En effet, le taux en cathinone, élevé dans les 14

15 feuilles fraîches, diminue rapidement lors du séchage et la cathinone se décompose en (+)- NPSE, appelée également cathine et en (-)-NEP (Figure 1.4) 5 O NH H CH 3 S-(-)-cathinone OH OH NH H NH H CH 3 CH 3 (1R,2S)-(-)-noréphédrine (1S,2S)-(+)-norpseudoéphédrine Figure 1.4: Décomposition enzymatique lors du stockage Ces produits sont deux substances du type «éphédrine», beaucoup moins psychoactives que la (-)-cathinone, ce qui explique la consommation de feuilles fraîches. La (-)-NEP et la (+)-NPSE sont des substances ayant des propriétés similaires que les autres substances du type «éphédrine» déjà mentionnées. Or elles répriment plus fortement la faim que celles-ci et sont ainsi contenues dans des médicaments (Alvalin, Recatol mono) fréquemment prescrits pour permettre des régimes plus faciles, bien que ces produits ne soient destinés qu à l administration à court terme aux personnes ayant un indice de masse corporelle >30. Dans ces médicaments se retrouve ou bien l énantiomère dextrogyre de la NPSE, ou bien un mélange racémique des deux énantiomères de la NEP. On peut supposer que l abus de consommation directe de substances du type «éphédrine» est plutôt faible. Ce ne sont que des faibles stimulants du système nerveux central et dans beaucoup de pays, ils ne sont vendus que sur prescription médicale. La consommation régulière en forte dose peut provoquer de nombreux effets secondaires comme des troubles neurologiques, la formation de calculs rénaux, l insomnie ou la tachycardie 6. Néanmoins, l abus indirect de ces substances en tant que précurseurs pour la synthèse de stimulants du type amphétaminique (STA), n est pas négligeable. En fait, les énantiomères naturels (-)-EP et (+)-PSE sont des précurseurs pour la synthèse du plus puissant énantiomère 15

16 de la métamphétamine (MA), la (+)-MA. La NEP et la (+)-NPSE en tant que précurseurs pour la synthèse de l amphétamine (AM) ne jouent pour l instant qu un rôle subordonné. 1.3 Caractéristiques chimiques 7,8 a) Ephédrine OH NH CH3 CH 3 (-)-EP OH NH CH3 CH 3 (+)-EP Figure 1.5: (+-)-EP Ephédrine Formule: C 10 H 15 NO MM: 165,24 g/mol T fus : 40 C (hémihydrate) pka : 9,6 Hydrochloride : Formule: C 10 H 15 NO,HCl MM: 201,7 g/mol T fus : C L énantiomère naturel et commercialisé est la (-)-EP. Environ 70-80% de la (-)-EP est excrétée telle quelle via l urine dans les 48 heures. Environ 4% est excrétée en tant que (-)- NEP, qui se forme par N-déméthylation. b) Pseudoéphédrine OH NH CH3 CH 3 (+)-PSE OH NH CH3 CH 3 (-)-PSE Figure 1.6: (+-)-PSE Pseudoéphédrine Formule: C 10 H 15 NO MM: 165,24 g/mol T fus : ,7 C (hémihydrate) pka : 9,8 Sulfate: Formule: (C 10 H 15 NO) 2,H 2 SO 4 MM: 428,5 g/mol T fus : C L énantiomère naturel et commercialisé est la (+)-PSE. Jusqu à 88% de la (+)-PSE est excrétée telle quelle via l urine dans les 36 heures. Moins que 1% est excrétée en tant que (+)- NPSE, qui se forme par N-déméthylation. 16

17 c) Noréphédrine OH NH H CH 3 (-)-NEP OH NH H CH 3 (+)-NEP Figure 1.7: (+-)-NEP Noréphédrine Formule: C 9 H 13 NO MM: 151,21 g/mol T fus : C pka : 9,4 Hydrochloride: Formule: C 9 H 13 NO,HCl MM: 187,67 g/mol T fus : C L énantiomère naturel est la (-)-NEP, tandis que la NEP commercialisée est un mélange racémique des deux énantiomères. Jusqu à 97% de la NEP est excrétée telle quelle via l urine dans les 24 heures. d) Norpseudoéphédrine OH NH H CH 3 (+)-NPSE OH NH H CH 3 (-)-NPSE Figure 1.8: (+-)-NPSE Norpseudoéphédrine Formule: C 9 H 13 NO MM: 151,21 g/mol T fus : C pka : 8,9 Hydrochloride: Formule: C 9 H 13 NO,HCl MM: 187,67 g/mol T fus : C L énantiomère naturel et commercialisé est la (+)-NPSE. La (+)-NPSE est excrétée telle quelle via l urine avec 40% présent dans les 6 heures après administration. 1.4 La situation dans le monde Comme mentionné, à cause des effets stimulants faibles et à cause de leur application dans des médicaments, il est difficile d obtenir des chiffres sur la consommation ou l abus direct de ces substances. A la fin du 20 e siècle, les substances du type «éphédrine» n étaient que peu 17

18 réglées, bien que l EP et la PSE se trouvent depuis 1988 sur la liste des substances contrôlées des Nations Unies 9. Le Ma Huang par exemple, contenant principalement de la (-)-EP et de la (+)-PSE, était vendu librement dans des drogueries pour le traitement de rhumes. Ces dernières années par contre les restrictions sont devenues plus sévères. Ainsi en 2006, l administration de la nourriture et des médicaments des Etats-Unis (FDA : Food and Drug Administration) a interdit la vente de tous les produits à base d Ephedra destinés à maigrir. En 2005, un règlement du Conseil Européen 10 est entré en vigueur qui prévoit des contrôles pour l importation et l exportation de nombreuses substances du type «éphédrine» (EP, PSE, NEP et NPSE). Cette réglementation était nécessaire, puisque l abus de ces substances en tant que précurseurs pour la fabrication des STA augmentait d année en année. (Figure 2.1) Figure 2.1: Nombre de laboratoires illégaux de MA découverts aux Etats-Unis Le diagramme montre que dans un premier temps les régulations ont porté leurs fruits, mais que peu après la production dans des laboratoires a de nouveau commencé à augmenter. Ceci est dû au fait que les producteurs ont trouvé d autres moyens pour la synthèse de la MA. Ainsi les laboratoires se sont spécialisés peu à peu sur l extraction des précurseurs de médicaments, respectivement de thés à base d Ephedra toujours en vente libre. Bien que l Asie et les Etats- Unis soient les principaux producteurs de la MA, l Europe et donc également le Luxembourg jouent un rôle capital notamment dans la distribution des précurseurs dans le monde. En 2007 au Luxembourg, la douane a saisi 2 tonnes d Ephedra, portant la fausse indication Citrus aurantium (orange amère) à destination du Mexique 11. Le contenu en éphédrine était de 20%, ce qui prouve son utilisation pour la synthèse de la MA. La saisie la plus récente d un précurseur de la MA, était une livraison de 76,5 kg de (+)-PSE, confisquée à l Aéroport de Luxembourg et à destination de l Amérique du Sud en

19 Depuis quelques années, les saisies de khat augmentent continuellement en Europe et également au Luxembourg. Bien que cette plante ne soit pas utilisée pour la synthèse des STA, sa possession et sa consommation sont interdites dans de nombreux pays. Ceci est dû notamment à sa teneur en cathinone, une substance psychotrope, qui se trouve sur la liste des substances psychotropes sous contrôle international 13. Au Luxembourg, 47 kg de khat ont été confisqués, en 2006 et déjà 60 kg en En 2012, le laboratoire national de santé a déjà eu plusieurs échantillons de khat confisqués. Bien qu il n existe pas de statistiques sur la consommation de khat au Luxembourg, il est fort probable que ce khat était destiné à l export, notamment en Grande-Bretagne, où il est consommé par des immigrants, puisque la possession et l usage de cette plante n y sont pas interdits. 19

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21 2. Les méthodes d analyses énantiosélectives en toxicologie analytique 15 La séparation d énantiomères nécessite des techniques d analyse spécifiques. En effet les énantiomères d une molécule ont en principe des propriétés physiques et chimiques identiques, et sont donc difficiles à séparer par des méthodes d analyse utilisées en routine au laboratoire. Il existe plusieurs techniques de séparation, dont les plus connues sont la chromatographie en phase gazeuse (CG), la chromatographie liquide à haute performance (CLHP) où l électrophorèse capillaire (EC) La chromatographie liquide à haute performance (CLHP) La séparation d énantiomères par CLHP peut se faire selon trois modes : Dérivatisation des énantiomères à l aide d un réactif chiral avec formation de diastéréoisomères Emploi d une phase stationnaire chirale Ajout d un sélecteur chiral dans la phase mobile Ces différents modes sont appliqués en toxicologie analytique. Les inconvénients principaux de la CLHP sont l utilisation de grandes quantités de solvant, souvent des gradients de solvants, difficiles à recycler et les durées d analyse longues La chromatographie en phase gazeuse couplée à la spectrométrie de masse (CG-SM) La CG-SM est une technique d analyse largement utilisée en toxicologie clinique et médicolégale pour la détection et le dosage de médicaments et de drogues, notamment à cause de sa sensibilité élevée. Une condition pour l utilisation de la CG est que les substances à séparer ne soient pas thermiquement instables. Si tel est le cas, les molécules doivent être dérivatisées avant la séparation. La séparation d énantiomères par CG peut se faire ou bien par dérivatisation à l aide d un sélecteur chiral, ou bien par l emploi d une colonne chirale. Les colonnes chirales existantes 21

22 sont surtout à base de cyclodextrines. Ces colonnes ont été employées avec succès pour la séparation de substances du type «éphédrine» 18, mais ne sont que peu employées en toxicologie analytique, notamment à cause de leur durée de vie et de leur utilisation limitées L électrophorèse capillaire (EC) L EC permet de séparer des molécules chargées sous l influence d un champ électrique. Selon les techniques de séparation utilisées, elle permet également la séparation de molécules neutres. L EC a plusieurs avantages par rapport aux autres techniques d analyse citées. Elle ne nécessite que de faibles volumes d échantillons et de solvants, les temps d analyse sont généralement courts. Le plus grand avantage cependant est la possibilité de séparer des énantiomères, sans dérivatisation préalable et sans achat d une phase stationnaire coûteuse, par ajout d un sélecteur chiral dans la phase mobile. La détection des analytes se fait souvent par un détecteur d absorption ultra-violet (UV) ou visible. Pour augmenter la sensibilité, il est possible d employer des détecteurs à fluorescence induite par laser, voir même de combiner l EC à la SM 19. Les avantages de l EC ont été reconnus depuis longtemps et d année en année le nombre de publications traitant la séparation d énantiomères augmente Historique La migration d ions dans un champ électrique a déjà été étudiée il y a plus de 100 ans par Kohlrausch. Dans les années 1930, Tiselius a réalisé la séparation de protéines. Pour ces travaux il a obtenu le prix Nobel en Or, le problème principal de l EC était l évacuation de la chaleur produite par effet Joule. Ce problème a été résolu par Hjerten 20 qui était le premier à avoir décrit l emploi de capillaires d un diamètre allant de 1 à 3 mm. Les séparations ont pu être améliorées par l utilisation de capillaires de plus en plus minces ( µm) et par l utilisation de détecteurs UV-visible. L introduction de l EC micellaire par Terabe 21 en 1984 a élargi le champ d application de l EC à la séparation de molécules neutres Principe et théorie Fonctionnement Le terme électrophorèse capillaire regroupe plusieurs techniques de séparation. La technique utilisée pour le présent travail est l électrophorèse capillaire de zone (ECZ). Le principe de séparation est basé sur la différence des mobilités d ions dans un champ électrique. La 22

23 séparation se fait dans des capillaires minces, remplis d une solution d électrolyte. Ce milieu conducteur est généralement stationnaire et selon leurs mobilités électrophorétiques, les ions migrent à travers le capillaire jusqu au détecteur. Or, selon le ph de l électrolyte, un mouvement supplémentaire de l électrolyte, appelé flux électroosmotique, peut se produire. La mobilité d un ion est donc la résultante des deux mouvements Flux électrophorétique La vitesse d une molécule chargée en solution et soumise à un champ électrique E est appelée vitesse électrophorétique (v EP ). Elle s exprime par : v EP = µ EP E avec v EP = vitesse de l ion (en m/s) µ EP = mobilité électrophorétique (en m 2 /V s) E = champ électrique (en V/m) Le champ électrique dépend de la longueur du capillaire et de la tension appliquée. La mobilité électrophorétique (µ EP ) est constante pour une espèce ionique donnée. Elle est déterminée par l équilibre entre la force électrique F E et la force de frottement F F. F E = q E F F = - 6 π η r v EP avec q = charge ionique (C) η = viscosité de la solution (N s/m 2 ) r = rayon de l ion (m) De l équilibre entre ces deux forces on tire : µ EP = q 6 π η r La vitesse de migration dépend donc du rapport charge/taille. Une molécule petite et hautement chargée migrera rapidement, une molécule grosse et faiblement chargée migrera lentement. D autre part, dans un électrolyte stationnaire, les cations migrent vers la cathode, tandis que les anions migrent vers l anode. 23

24 Flux électroosmotique Lorsque le ph de l électrolyte utilisé est >3, l application d une tension au système provoque la formation d un flux dans le capillaire. Ce flux est appelé flux électroosmotique (EOF). La surface intérieure du capillaire, le plus souvent en silice fondue, est alors recouverte d une couche de charges négatives SiO -. Cette charge négative est compensée par des charges positives provenant de l électrolyte (ions adsorbés). Près de la paroi, il se forme donc une double couche d ions qui crée une différence de potentiel, appelée potentiel zêta ζ (en V) (Figure 2.2). Ions mobiles Ions adsorbés Groupes silanolates déprotonés Figure 2.2 : L effet de l EOF sur la migration des particules L EOF ainsi créé, dépend de la viscosité et de la concentration de l électrolyte, ainsi que du ph. Il est donné par : µ EOF = ε ζ 4 π η avec ε = constante diélectrique ζ = potentiel zêta (en V) η = viscosité de la solution (en N s/m 2 ) La vitesse du flux électroosmotique est donnée par : v EOF ε ζ = E 4 π η Ce flux est nul pour un ph<3 (groupes silanolates protonés), il augmente avec le ph et il reste constant pour des ph>6 (groupes silanolates complètement déprotonés). La vitesse apparente d une molécule chargée est donc la résultante des flux électrophorétique et électroosmotique. Elle est donnée par : v ap = v EOF + v EP 24

25 En général la vitesse du flux électroosmotique est supérieure à celle du flux électrophorétique. Par conséquent toutes les espèces migrent vers la cathode. Les cations sont entraînés par les deux flux, les molécules neutres ne sont qu entraînées par l EOF, tandis que le flux électrophorétique tend à faire migrer les anions en sens inverse. L ordre de séparation (pour un EOF non nul) est donc en général le suivant : Figure 2.3 : Ordre de migration des particules en EC Contrairement aux fronts des profils de migration générés par pression (par exemple en CLHP) de forme parabolique, les fronts des profils de migration générés en EC sont plats. Ceci augmente l efficacité de la séparation et entraîne la formation de pics minces (Figure 2.4). Flux électroosmotique Flux laminaire Signaux observés Figure 2.4 : Le signal observé en fonction du profil de migration 25

26 L appareillage Le capillaire est rempli avec l électrolyte. Après injection de l échantillon, les extrémités du capillaire plongent dans la solution tampon. Les électrodes sont reliées à une source haute tension. L évacuation de la chaleur produite par effet Joule, se fait à l aide d un liquide de refroidissement, qui circule à l intérieur d une cartouche contenant le capillaire. La détection se fait en direct, le plus souvent à l aide d un détecteur UV-visible (Figure 2.5) Les capillaires Figure 2.5 : Schéma d un système d EC Les capillaires normalement utilisés sont en silice fondue d un diamètre interne de 50 à 100 µm. Ils sont entourés d une couche de polyimide, qui leur confère plus de stabilité. Au niveau de la fenêtre de détection, cette couche doit être enlevée, puisqu elle absorbe les rayons UV. Les capillaires minces ont l avantage de mieux évacuer la chaleur produite par effet Joule, mais ils ont le désavantage que l utilisation d un capillaire mince diminue le signal, ce qui réduit la sensibilité. La longueur du capillaire peut varier entre 10 et 100 cm. Plus le capillaire est long, plus la séparation est bonne. En même temps le temps d analyse augmente et le front du profil de migration s allonge, ce qui provoque l élargissement des pics. La détection se fait 26

27 en direct, quelques cm avant la fin du capillaire, grâce à la fenêtre créée par enlèvement de la couche de polyimide. La cartouche contenant le capillaire peut être dotée d une petite fenêtre (100x200 µm) ou d une grande fenêtre (100x800 µm). Le signal enregistré augmente avec la taille de la fenêtre, mais également le temps de passage de l analyte et donc la largeur du pic Les modes d injection Il existe plusieurs modes d injection, dont les plus utilisés sont l injection hydrodynamique et l injection électrocinétique. a) Injection hydrodynamique Il s agit du mode d injection le plus utilisé. L injection se fait le plus souvent du côté de l anode avec une pression de l ordre de psi qui est appliquée pour quelques secondes. Alternativement, une dépression à l extrémité opposée peut être appliquée afin d aspirer l échantillon dans le capillaire (Figure 2.6). L échantillon est souvent dissous dans de l eau distillée, ce qui produit un effet appelé electrostacking. Par injection de l échantillon, on retrouve au début du capillaire une zone composée d eau distillée contenant l analyte, tandis que le reste du capillaire est rempli de solution tampon. Le champ électrique plus élevé dans l eau distillée fait migrer les ions rapidement jusqu à l interface avec la zone tampon. En entrant dans la zone tampon, les ions rassemblés migrent plus lentement à cause du champ électrique plus faible. Selon leur mobilité apparente, ils sont séparés dans le capillaire et on obtient des pics minces sur l électrophérogramme. Il s agit du mode d injection utilisé dans cette étude. Figure 2.6 : Injection hydrodynamique 27

28 b) L injection électrocinétique L introduction de l échantillon se fait par application d une tension électrique de l ordre de 10 kv. Les différents ions sont sélectivement attirés selon leur mobilité. Les ions les plus mobiles sont enrichis, les ions les moins mobiles sont discriminés. Le grand désavantage de cette méthode est qu elle modifie la concentration des ions de l échantillon, ainsi un nouveau échantillon est nécessaire pour chaque injection. Figure 2.7 : Injection électrocinétique Les techniques de séparation Il existe plusieurs techniques de séparation en EC comme l électrophorèse capillaire de zone (ECZ), la chromatographie électrocinétique micellaire ou l électrophorèse sur gel. Pour des raisons de simplification que l ECZ, la technique appliquée pour cette étude, sera présentée. L électrophorèse capillaire de zone Il s agit du mode le plus utilisé en EC à cause de sa simplicité. Les caractéristiques fondamentales de cette méthode de séparation sont l homogénéité de la solution électrolyte et donc la constance du champ électrique sur toute la longueur du capillaire. La séparation est basée sur les différences de mobilités électrophorétiques des molécules chargées. Ces mobilités dépendent de leur taille, ainsi que de leur charge à un ph donné. Des molécules neutres ne peuvent pas être séparées par cette technique. A des ph<3 que des anions, respectivement cations peuvent être analysés. A des ph>3, donc en présence de l EOF, les anions et cations peuvent être analysés et en plus l EOF transporte les molécules neutres 28

29 jusqu au détecteur. Le domaine d application de cette technique est très large et s étend de l analyse d ions minéraux (Li), jusqu à l analyse de grandes molécules biologiques (peptides) La séparation énantiomérique Puisque les énantiomères d une molécule possèdent le même rapport charge/masse, une séparation par EC traditionnelle est impossible. Une alternative consiste à dérivatiser préalablement les molécules à l aide d un auxiliaire chiral pour former ainsi des diastéréoisomères. Une méthode directe, ne nécessitant pas de dérivatisation préalable, est plus souvent appliquée en EC. Par injection d un sélecteur chiral (dissous dans la solution tampon) on rend possible l énantioséparation par des interactions stéréosélectives des énantiomères avec le sélecteur chiral. Parmi les agents chiraux on retrouve les cyclodextrines (CD), les éthers couronnes, les maltodextrines et beaucoup d autres 27. Les CDs sont de loin les sélecteurs chiraux les plus utilisés en EC. Les CDs sont des oligosaccharides cycliques formés de sous unités de D-(+)-glucopyranose liées en α-(1,4). Selon le nombre de sous-unités de glucose on distingue les α-cyclodextrines (6 unités), les β-cyclodextrines (7 unités) et les γ-cyclodextrines (8 unités) (Figure 2.8) 28. Figure 2.8 : Structure des cyclodextrines Les CDs forment un cône avec deux ouvertures. La cavité interne est hydrophobe, tandis que la partie extérieure est polaire. Ainsi la cavité hydrophobe peut former des complexes d inclusion avec la partie hydrophobe d un substrat (par exemple un anneau phényle), tandis que la partie extérieure peut faire des interactions de type ponts H

30 Outre ces CDs natives, il existe de nombreuses CDs modifiées 30. Ces modifications ont des influences sur les propriétés des cyclodextrines, comme leur stabilité, leur solubilité et leur sélectivité dans l inclusion. L affinité d un analyte pour une cyclodextrine donnée dépend donc à la fois de sa taille, de sa géométrie, de son hydrophobicité et da sa capacité à former des ponts H. Bien qu il n existe pas de règle qui permette de prévoir l affinité d un analyte pour une cyclodextrine, on utilise généralement les α-cyclodextrines pour un petit substrat sans anneau phényle, les β- cyclodextrines pour les substrats comprenant un seul anneau phényle et les γ-cyclodextrines pour les grandes molécules comprenant plusieurs anneaux phényle 31. Les cyclodextrines étant des composés hautement chiraux, l interaction avec des énantiomères conduit à la formation de diastéréoisomères. Ces diastéréoisomères migrent avec une mobilité réduite. Un énantiomère qui interagit fortement avec une CD va donc migrer plus lentement et ainsi être séparé de son isomère optique, qui est moins retenu et migrera plus rapidement (Figure 2.9). Figure 2.9 : Principe de la séparation chirale en EC en présence de CDs. L efficacité de séparation des énantiomères est évaluée par le calcul de la résolution (Rs) des pics énantiomériques : avec : 2 (t Rs = ω + ω t1) 2 t 2 = temps de migration de l énantiomère le plus retenu (en s) t 1 = temps de migration de l énantiomère le moins retenu (en s) ω = largeur à la base des pics (en s) 30

31 Les modes de détection Plusieurs modes de détection couplés à l EC ont été décrits dans la littérature. Les plus utilisés sont la spectrophotométrie UV-visible, la fluorimétrie et la spectrométrie de masse. a) La détection en UV-visible Ces types de détecteurs sont les détecteurs standards utilisés en EC. Il existe des détecteurs UV-visible et des détecteurs à barette de diodes permettant l acquisition de spectres à plusieurs longueurs d onde. Leur désavantage est leur faible sensibilité. En fait, le volume d échantillon injecté (quelques nl) et le court chemin optique dû au petit diamètre des capillaires font que le signal résultant est très faible. Les limites de détection sont en général comprises entre ng/ml L utilisation de ce type de détecteur nécessite souvent des étapes de préconcentration préalables. b) Les détecteurs à fluorescence La fluorescence induite par laser permet d abaisser considérablement les limites de détection, d un facteur 100. Cette méthode de détection a comme désavantage qu elle nécessite souvent une dérivatisation préalable afin de former un fluorophore et que ces détecteurs sont très chers. c) Les détecteurs de masse Le couplage de l EC à la spectrométrie de masse (SM) a plusieurs avantages par rapport aux autres modes de détection. D un côté, la molécule à analyser ne doit pas contenir un chromophore, respectivement un fluorophore, ce qui augmente le domaine d application. D un autre côté la SM permet également d obtenir des informations structurelles sur la molécule analysée. A cause du prix élevé et de l offre limitée d appareils EC-SM cette technique d analyse ne fait pas encore partie des méthodes de routine. En plus, les tampons peu volatils utilisés normalement en EC, comme le tampon phosphate ne sont pas compatibles avec la source d ionisation de type électrospray utilisée pour cette méthode de détection Séparation et dosage de substances du type «éphédrine» Ces dernières années, de nombreux articles ont été publiés démontrant le potentiel de séparation de l EC en combinaison avec des CDs pour les substances du type «éphédrine». 31

32 Mateus-Avois et al. 34 a décrit la séparation des substances étudiées (en n utilisant qu un seul énantiomère de chaque substance) avec différentes CDs (α-cd, β-cd, β-cds-substituées, γ- CD). Cette étude montre que les cyclodextrines α-natives et β-natives ne montrent aucune, respectivement qu une très faible affinité pour ces substances, tandis que les cyclodextrines β- substituées et γ montrent une forte affinité pour ces substances. Les meilleurs résultats ont été obtenus en utilisant la DIMEB. Ces résultats ont été confirmés par Liu et al. 35 qui a séparé 5 des 6 substances (la (+)-NPSE n y figure pas) de cette étude en moins de 22 minutes en utilisant la DIMEB à une concentration de 40 mm. La séparation la plus réussie de l ensemble des substances de cette étude est celle d Iwata et al. 36 qui a séparé les 6 composés étudiés, mais la séparation dure plus de 30 minutes, ce qui n est pas judicieux pour une application en routine. Pour leur travail ils ont testé plusieurs CDs. La γ-cd hautement sulfatée à une concentration de 10 mm a donné de loin les meilleurs résultats. Dans la majorité des cas la détection en UV-visible est utilisée, ce qui engendre des LLOD d environ 100 ng/ml. Afin d abaisser la LLOD, Zhang et al. 37 a décrit la séparation de six dérivés de l EP et de l AM en utilisant un détecteur à fluorescence induite par laser avec des limites de détection de 0,2 ng/ml. L EC couplée à la SM ne possède pas les désavantages de la détection en UV-visible (faible sensibilité) et de la détection par fluorescence (dérivatisation préalable) et est en train de devenir une méthode de choix pour les analyses en toxicologie médico-légale et clinique complémentaire à la CLHP-SM 38. Cette méthode de détection permet d atteindre de bonnes sensibilités (de l ordre de 50 ng/ml), mais a également l avantage de fournir des informations structurelles sur les analytes détectés. Jingguo H. et al. a décrit la séparation chirale de plusieurs substances du type «éphédrine» par EC-ESI-SM avec des limites de détection de l ordre de ng/ml 39. La détection des substances dans l urine: L application de l EC à l analyse d échantillons d urine renfermant des substances du type «éphédrine» a également été démontrée. Mateus-Avois et al. insiste sur le fait que les échantillons d urine renfermant des substances du type «éphédrine» sont en général très concentrés (plusieurs µg/ml d urine), ce qui rend possible une injection directe, malgré la 32

33 présence de nombreux composés susceptibles de créer des interférences, après une simple filtration à travers un filtre 0,2 µm. Pour éviter les problèmes d interférences et éliminer tous les sels et protéines présents dans les urines, Liau 40 propose une simple extraction liquide-liquide. 33

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35 3. Le but du travail Vu leur utilisation en tant que précurseurs pour la synthèse des STA, des méthodes rapides et fiables pour l analyse chirale des substances du type «éphédrine» sont nécessaires. Les méthodes de routine comme la CG-SM ou la CLHP ne permettent pas des analyses chirales rapides, puisqu elles nécessitent ou bien des colonnes chirales, ou bien une dérivatisation préalable. En plus, les diastéréoisomères comme par exemple la (-)-EP et la (+)-PSE engendrent des chromatogrammes et des spectres de masse identiques lors d une analyse par CG-SM 41. Or une différentiation est nécessaire pour plusieurs raisons. D un côté, les énantiomères d une molécule peuvent montrer des propriétés pharmacologiques différentes, comme la (+)-EP qui n atteint que 80% de l effet stimulant de la (-)-EP 35. Ainsi une méthode d analyse chirale permettrait de prédire les propriétés pharmacologiques d un échantillon. D un autre côté, seulement un des deux énantiomères permet la synthèse de l énantiomère le plus puissant des STA. La (-)-EP et la (+)-PSE par exemple fournissent la (+)-MA, tandis que leurs énantiomères donnent la (-)-MA, beaucoup moins puissante. La possession en grandes quantités de précurseurs permettant la synthèse de la (+)-MA est donc punie plus sévèrement par la loi. En plus une méthode d analyse chirale permettrait d étudier l origine naturelle ou synthétique d un échantillon, puisque la nature ne synthétise qu un seul des deux énantiomères. Pour ce travail, 6 substances du type «éphédrine» ont été choisies. D après mes recherches, il n y a pas de publication qui décrit une séparation rapide (<20 minutes) de l ensemble des 6 substances. Le but du présent travail est donc de développer une méthode simple et rapide pouvant être utilisée en routine au laboratoire de toxicologie et permettant la séparation des substances suivantes par EC: la (+)-EP, la (-)-EP, la (+)-PSE, la (+)-NEP et la (-)-NEP et la (+)-NPSE. Après l optimisation et la validation de la méthode pour l analyse des substances en solution aqueuse, la méthode sera appliquée à l analyse d échantillons d urine. 35

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37 4. Matériel et Méthodes 4.1 Matériel Appareil d électrophorèse capillaire L appareil d EC utilisé est un BECKMAN P/ACE TM MDQ équipé d un détecteur à barette de diodes. L injection se fait par injection hydrodynamique. Les analyses sont réalisées à tension constante avec un temps de montée de 1 min. La tension maximale est de 30 kv et le courant maximal est de 300 µa. L appareil est équipé d un échantillonneur automatique capable d accueillir 48 flacons. Pour le traitement des données, l appareil est relié à un ordinateur équipé du programme 32 Karat TM Version 7.0. Les capillaires utilisés, d un diamètre interne de 75 µm, proviennent de BECKMAN et sont placés dans une cartouche thermostatée par un liquide de refroidissement organique. Selon les CDs utilisées, la température choisie était 20 C (HS-γ-CD), respectivement 25 C (DIMEB). Les échantillons sont maintenus à 15 C dans le chariot. On a utilisé des capillaires d une longueur totale de 60 cm. L analyse se faisait en mode normal (cathode à la sortie) à une longueur d onde de 200 nm Tampons Les conditions optimales déterminées pour les séparations nécessitent la préparation d une solution phosphate 50 mm de ph 2,5. Matériel utilisé: Acide orthophosphorique 85% (H 3 PO 4 ) de Merck Solution NaOH 1 mol/l, pastilles de NaOH de Merck Filtre Minisart avec des pores de 0,2 µm de Sartorius AG Eau distillée préparée par une unité Millipore AFS 8 Préparation: 337 µl d acide orthophosphorique sont dilués dans environ 90 ml d eau distillée. Le ph est ajusté à 2,5 par ajout de NaOH 1 mol/l. La solution est transvasée dans une fiole jaugée de 100 ml et le niveau est ajusté avec de l eau distillée. L électrolyte est finalement filtré à travers un filtre Minisart avec des pores de 0,2 µm. 37