la protéomique un génome, plusieurs protéomes Hélène ROGNIAUX Arabidopis thaliana

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1 Hélène ROGNIAUX la protéomique un génome, plusieurs protéomes Arabidopis thaliana

2 «proteome»: protein/genome Humphery-Smith et coll. Electrophoresis 1995 contexte : génomes : c. elegans gènes humain gènes arabidopsis gènes riz gènes le vivant est plus compliqué que la structure du génome! la complexité tiendrait surtout aux réactions chimiques réalisées et contrôlées par les protéines protéines attendues chez l humain : entre et 5 millions (épissage alternatif des ARNm, MPTs, maturations) la protéomique paraît la méthode logique et prometteuse pour étudier les mécanismes moléculaires de la cellule

3 principe général préparation des extraits protéiques (extraction, isolation d organites, fractionnement...) séparation des protéines par électrophorèse bi-dimensionnelle éch. 1 éch. 2 témoin mutant marqueur de la mutation 3 à 5 répétitions

4 identification des protéines d intérêt excision mesure par SM hydrolyse par une enzyme séquence-spécifique peptides : caractéristiques de la protéine prédictibles M/z CORRELATION? digestion in-silico des banques de données 2 approches : par MALDI-MS (masse des peptides) par LC-MS/MS (masse et séquence des peptides)

5 Approche par MALDI-MS (empreinte peptidique massique ou «peptide mass fingerprint» : PMF) % m/z

6 Approche par MALDI-MS (empreinte peptidique massique ou «peptide mass fingerprint» : PMF) Peak list MH+... Intensité % m/z

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11 Critères de validation des identifications Le nombre de peptides «reconnus» dans la protéine, c est-à-dire dont la masse correspond à une masse observée (± l imprécision de la mesure, de l ordre de 50 ppm, c.à.d. ± 0.1 Da à la masse 1500 Da). L interprétation quasi complète du spectre MALDI (au moins : les ions majeurs) Le MW et le pi de la protéine (corrélés avec le gel?) La couverture de séquence L organisme auquel appartient la protéine Le score de la protéine identifiée Le score de l identification suivante...

12 Approche par nanohplc-ms/ms peptides A, B, C,... HPLC ESI-MS et MS/MS A A QT2120HR 862 (36.521) : TOF ES+ 4.56e3 MS B C % détection UV t m/z e3 MS/MS % mass

13 La spectrométrie de masse MS/MS Source Chambre de Analyseur 1 Analyseur 2 collision Détecteur m Ar m m 1 m 2 m 3 M/z

14 MS/MS des peptides La fragmentation se produit majoritairement au niveau de la liaison peptidique : R1 O y 3 y 2 y 1 R2 O R3 O R4 H 2 N C C N C C N C C N C COOH H H H H H H H b 1 b 2 b 3 R1 O R2 H 2 N C C N C H H H O + R3 O R4 + H 3 N C C N C COOH H H H b 2 y 2

15 MS/MS des peptides masse du parent masse des fragments y 9 m y 8 E G V N D N E E G F F S A R m Da 100 EG V N D N E E GF FS AR bmax R A S F F G E E N D N V GE ymax y3 y6 y y7 % b y b y y y y y (M+H) M/z

16 Approche par nanohplc-ms/ms Chaque spectre MS/MS est résumé par une fiche du type : xxxx xxxx xxxx xxxx2 100 xxxx xxxx xxxx xxxx xxxx xxxx xxxx xxxx xxxx xxxx xxxx xxxx xxxx xxxx xxxx xxxx xxxx xxxx xxxx xxxx xxxx xxxx xxxx xxxx xxxx xxxx xxxx xxxx xxxx xxxx xxxx xxxx xxxx xxxx xxxx xxxx xxxx xxxx xxxx xxxx xxxx xxxx xxxx xxxx xxxx xxxx xxxx xxxx xxxx xxxx xxxx xxxx xxxx xxxx xxxx xxxx xxxx xxxx xxxx xxxx xxxx xxxx 3 xxxx xxxx xxxx xxxx xxxx xxxx Masse du peptide fragmenté M/z, z, et intensité des fragments Les données sont ensuite comparées par un algorithme de recherche aux données des banques : - 1 er filtre sur la masse du peptide fragmenté (+/- précision de mesure de masse), - confrontation des fragments mesurés avec les fragments attendus compte-tenu des règles de fragmentation des peptides (+/- précision de mesure sur les fragments)

17 Exemple d identification protéine identifiée nombre de peptides identifiés dans la protéine détail des peptides identifiés tps de rétention MS/MS

18 Critères de validation des identifications Le nombre de peptides «reconnus» dans la protéine. Double exigence : - la masse du peptide correspond à une masse observée (± l imprécision de la mesure, de l ordre de 100 ppm, c.à.d. ± 0.15 Da à la masse 1500 Da). - sa séquence produit des fragments théoriques qui corrèlent les fragments observés. La spécificité des informations obtenues en MS/MS permet d accepter une identification dès que > 2 peptides sont reconnus dans la protéine Le MW et le pi de la protéine (corrélés avec le gel?) La couverture de séquence L organisme auquel appartient la protéine Le score de la protéine identifiée Le score de l identification suivante...

19 MALDI-MS versus nanolc-ms/ms empreinte peptidique massique (MALDI-MS) nano-lc-ms/ms rapidité d'analyse consommation d'échantillon facilité d'interprétation des résultats coût minutes 5-10% heures 90% les peptides modifiés les protéines de bas poids moléculaire les mélanges de protéines (gels mono-dimensionnels) les protéines non répertoriées dans les banques la couverture de séquence (combiner les 2 types d'analyses)

20 MELANGES DE PROTEINES Problème posé par l'identification en MALDI-MS : les algorithmes d'identification gèrent difficilement les mélanges de plus de 2 protéines. L'information sur les spectres est en quantité insuffisante pour que l'analyse statistique soit discriminante : on a souvent plusieurs solutions! En LC-MS/MS : La séparation des peptides permet de tolérer les mélanges, même complexes. Chaque spectre MS/MS discrimine efficacement entre plusieurs protéines candidates

21 Exemple : mélange de protéines SDS-PAGE Bande épaisse d'un gel SDS-PAGE de protéines de l apoplasme de tabac entrée MW nb pep. seq. % 40kD 1. P Da 8 29% P Da 4 14% P Da 4 14% tps rétention

22 Exemple : mélange de protéines Glucan endo 1,3-beta-glucosidase - Tabac Bande épaisse d'un gel SDS-PAGE de protéines de l apoplasme de tabac entry MW (Da) Pep. % séq. m/z MH+ séq. peptides P (R)IYNPDTNVFNALR(G) (R)IYNPDTNVFNALR(G), méthylé (R)ANGWVQDNIINHFPDVK(F) (K)VSTATYSGILANTYPPK(D) Spectre MS/MS de l ion :

23 PROTEINES NON REPERTORIEES DANS LES BANQUES Problème posé par l'identification des protéines non répertoriées dans les banques en MALDI-MS : il faut trouver au moins 5 ou 7 peptides* strictement identiques (même masse que dans la protéine étudiée à 50 ppm près) dans une protéine homologue pour que la protéine soit identifiée (* suivant le seuil d'identification qu'on se fixe) En LC-MS/MS : le nombre de peptides minimum pour identifier une protéine peut être fixé plus bas sans induire de faux positifs dans l'identification, grâce aux données MS/MS on a plus de chances d'identifier des protéines non répertoriées dans les banques par homologie avec d'autres qui sont répertoriées

24 Exemple : protéines non répertoriées dans les banques Protéine prélevée sur un gel de colza (env. 25 kda) Résultats MALDI-MS non significatif???

25 Résultats nanolc-ms/ms Triosephosphate isomérase de B. napus (colza) identifiée à partir de 2 peptides trouvés dans la séquence d'arabidopsis et de 2 peptides trouvés dans la séquence de coptis japonica la séquence du colza doit contenir ces 4 peptides

26 les 2 peptides identifiés chez coptis japonica (avec T S) séq. d'arabidopsis contig aligné chez colza les 2 peptides identifiés chez Arabidopsis

27 PROTEINES NON REPERTORIEES DANS LES BANQUES L'information supplémentaire apportée par le séquençage MS/MS des peptides permet d'interroger avec une bonne fiabilité les banques d'est (nombreuses séquences fausses dans les mauvais cadres de lecture) The Institute for Genomic Research

28 Exemple : interrogation banque NCBI Protéine prélevée sur un gel de Medicago truncatula (env. 35 kda) 5 peptides dont les séquences proposées corrèlent bien les données MS/MS (mais dans des protéines différentes!)

29 Exemple : interrogation Tigr Medicago on retrouve les 5 peptides (+ 2 supplémentaires) dans le contig TC79093_5 similar to 35 kda seed maturation protein (Glycine max), partial (57%)

30 Quelques exemples de projets utilisant les techniques de la protéomique, en cours sur le Centre INRA de Nantes Mécanismes d accumulation des protéines de réserve dans les plantes de grande culture (colza, blé) : biosynthèse, formation des vésicules de stockage, trafic vésiculaire, etc. Impacts environnementaux (sécheresse) sur le remplissage Etude différentielle des protéomes de variétés affectées dans le remplissage, de stades de développement différents,... Mécanismes de biosynthèse de l amidon (maïs) : acteurs de la biosynthèse? Etude des protéomes à des stades de développement différents, effet serre/plein champ, effet année Allergènes alimentaires du gluten de blé? En combinaison avec des approches de Western-blot utilisant des serums de patients allergiques

31 Protéome de la graine de colza (équipe APR, Yves Popineau) Colette Larré et Vanessa Devouge graines matures - Darmor 4 variétés ac. érucique/glucosinolate* Gaspard +/+ JetNeuf 0/+ Darmor 0/0 Darmor Bzh 0/0 B D A C * influence sur la teneur 12S/2S

32 Protéome de la graine de colza (équipe APR, Yves Popineau) Colette Larré et Vanessa Devouge zone A MBP zone C beta-glucosidase Gaspard JetNeuf Darmor Darmor nain

33 Les écueils des approches protéomiques : préparation des extraits fractionnement (extractions sélectives, techniques séparatives..) isolation/purification d organelles déplétion des protéines majeures... séparation des protéines protéines membranaires protéines basiques bas MW analyse identification protéome : > protéines gel 2D : protéines de l identification à la fonction??

34 de l identification à la fonction?? questionnement scientifique / orientation du choix des échantillons annotations sur la fonction, la localisation subcellulaire, le processus biologique Dominique Tessier expériences de validation modifications post-traductionnelles : - phosphoprotéome - glycoprotéome - ubiquitination des protéines (ubiquitin : polypeptide de 76 aa. liaison aux Lys) (mécanisme de régulation central des protéines : stabilité, localisation, interactions,...?) interactome : identification des partenaires d interaction d une protéine cible

35 Principe général : SDS-PAGE MS Isolation du complexe (approche TAP : tandem affinity purification) Rigaut G., Shevchenko A., Rutz B., Wilm M., Mann M., Séraphin B. Nature Biotechnology 1999, 17: Contaminants AntiProtA Calmodulin beads Protéine cible CBP Protéine A Site de clivage TEV-protéase Elution (EGTA)

36 L approche TAP (Tandem Affinity Purification) Functional organization of the yeast proteome by systematic analysis of protein complexes Gavin A.-C. & al. Nature 2002, 415: gènes de S. cerevisiae ont été retenus pour cibles. Ils ont permis de purifier 589 assemblées de protéines. Une analyse bio-informatique a regroupé ces 589 assemblées en 232 complexes multi-protéiques distincts. Les résultats ont permis d assigner une fonction cellulaire à 344 protéines, parmi lesquelles 231 n avaient pas été annotées précédemment.