COMPTE-RENDU DE TP DE SPECTROPHOTOMETRIE:

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1 TEISSIER Thomas MADET Nicolas Licnc IUP SIAL Univrsié d Créil-Paris XII COMPTE-RENDU DE TP DE SPECTROPHOTOMETRIE: HPLC Anné univrsiair 003/004

2 I OBJECTIF. Lors d c TP nous allons dérminr opimisr ls paramèrs d composiion d la phas mobil ainsi qu son débi afin d avoir un séparaion ds composans ds échanillons qui soi la plus prforman. Pour cla nous allons fair varir cs paramèrs ffcur un analys à chaqu modificaion. Ensui nous calculrons ds paramèrs d fficacié, d rénion, c. qui nous prmrons d dérminr ls paramèrs opimums. II PRINCIPE. La chromaographi s un méhod chimiqu d séparaion ds moléculs n foncion d lur différnc affinié avc d aurs moléculs. Il xis d nombrux yps d chromaographi mais cll qui nous inérss s la chromaographi liquid hau prformanc (HPLC). On l appll chromaographi liquid car l échanillon don on vu séparé ls composés s nraîné par un phas mobil liquid dans un colonn connan la phas saionnair qui s fixé à la paroi d la colonn. L princip d c chromaographi rpos donc sur la séparaion d moléculs n foncion d lur polarié d l inracion qu c polarié pu nraîné n foncion d la polarié d la phas mobil d la phas saionnair. III MATERIELS ET METHODE. III.1 Présnaion du sysèm chromaographiqu. Tous ls caracérisiqus du monag ds apparils son rgroupés sur l annx 1. III. Ordr d éluion ds composés du mélang. Pour un chromaographi liquid hau prformanc, l ordr d éluion ds composés s défini par la polarié ds composés ainsi qu par lur aill. On sai qu l mélang s composé d Propyl P, d Méhyl P, d Uracil d Ehyl P. L Uracil éan un molécul d polarié élvé, il n s pas rnu par la phas saionnair s donc élué n Uracil prmir prm d définir l volum mor. Uracil Ls aurs composés éan d polarié smblabl élun n foncion d lur mass moléculair croissan, on à donc l ordr suivan : 1 : METHYL PARABEN Mhyl-4-hydroxybnzoa : ETHYL PARABEN Ehyl-4-hydroxybnzoa 3 : PROPYL PARABEN Propyl-4-hydroxybnzoa - -

3 III.3 Changmns ds paramèrs. Tou d abord, nous ffcurons ls analyss avc un composiion d phas mobil consan, c's-à-dir 70% d méhanol 30% d au. Mais nous frons évolur l débi d phas mobil d 0,4 à 1, ml/min. Nous avons choisi d fair ls analyss avc ds débis d 0,4 0,8 1, ml/min. Un fois qu l on aura dérminr l millur débi, c's-à-dir clui qui prm un millur séparaion ds composés (voir analys ds résulas), nous fixrons l débi opimum, puis nous frons varir la phas mobil d 65%/35%, 70%/30% 75%/5%, avc rspcivmn ls pourcnags d méhanol d au. Après avoir dérminr la composiion opimal d phas mobil, nous réglrons c valur ffcurons un séparaion d l échanillon avc cs donnés pour vérifir la qualié d la séparaion. IV TRAITEMENT DES RESULTATS IV.1 Analys ds résulas. Ds courbs d séparaion nous pouvons déduir ou calculr plusiurs paramèrs qui définissn l fficacié, la résoluion, la sélcivié, ainsi qu l facur d raîné. IV.1.1 L fficacié : N L fficacié héoriqu d un colonn, c s l nombr d plaaux nécssairs à la sori complè d la quanié iniial d solué. On a : N ( ) 0 σ Avc l fficacié héoriqu d la colonn on pu calculr la hauur équivaln à un plaau héoriqu (HEPT ) : L Avc : L la longuur d la colonn N l nombr d plaaux héoriqus HEPT N Avc : l mps d rénion d un ds composé (calculr n foncion du mps mor : o ). E σ la largur du pic d c composé à la hauur d 60% IV.1. La résoluion : Rs L facur d résoluion prm d qualifir la qualié d la séparaion, c's-à-dir qu il prnd n comp l chvauchmn ds pics ou au conrair l spac qui sépar la bas ds pics. 1 Avc : Rs 1, ls mps d rénion ds pics 1 ω + ω1 ω 1 ω, ls largurs d pics à 13,5% ds pics 1 On doi avoir un résoluion d l ordr d 1,5 pour qu la séparaion soi bin ffcué. IV.1.3 La sélcivié : α L facur d sélcivié s l rappor nr ls cofficins d disribuions d dux spècs séparés, ou lur mps d rénion. Cla prm d prévoir n connaissan lur cofficin d disribuion d prévoir l ordr d éluion ds composés

4 α k k ' ' 1 Avc : 1, 0, ls mps d rénion ds pics 1 du pic d solvan. k 1 k, ls facurs d capacié ds composés 1 α doi êr différn d 1 pour qu il y ai un bonn séparaion. IV.1.4 L facur d raîné : F Il prm d qualifir la syméri ds pics, donc d savoir si ls pics son gaussins ou non, donc d dérminr l compormn d l échanillon avc la phas saionnair/phas mobil. b F Avc : b la largur du pic à droi du cnr à 10% d hauur a a la largur du pic à gauch du cnr à 10% d hauur Pour qu ls pics soin gaussins, il fau qu F 1. Si F > 1, il y a sauraion d la phas saionnair, sinon si F <1 alors, c s qu il y a u fixaion rop for du solué sur la phas saionnair. IV. Opimisaion d la colonn. Afin d rpérr la valur d débi d phas mobil puis d sa composiion opimal, nous avons racé la courb d Van Dmr qui donn la hauur équivaln à un plaau héoriqu n foncion d la viss linéair d la phas mobil. On pu aussi racr l nombr d plaaux héoriqus n foncion d la viss linéair v ρ ou du pourcnag n méhanol pour la dérminaion d la phas mobil. La viss linéair s donné par la formul : 4 ρ q v v π ( d) Avc : q v l débi d la phas mobil d l diamèr d la colonn L minimum d la courb corrspond à la valur opimal du paramèr, donc soi la viss linéair d la phas mobil (don on pu irr l débi), soi sa composiion

5 V RESULTATS ET INTERPRETATION. V.1 Résulas. Pour ls calculs, nous avons uilisé l drnir pic d l analys d l échanillon, c's-à-dir clui corrspondan au Propyl P. Ls Graphiqus d séparaion son rgroupés dans ls annxs d 3 à 7. Ls courbs d Van Dmr donnan l nombr d plaaux héoriqus n foncion d la viss linéair ou du pourcnag n méhanol dans la phas mobil son rgroupés dans ls annxs 8 9. Pour ls valurs d airs, nous avons inégré ls pics ainsi qu la raîné après l pic d produi. L ordinaur ayan calculé séparémn ls dux, nous avons addiionné ls airs pour fair ls courbs d Van-Dmr. Tablau I : Changmns ds paramèrs influnc sur ls caracérisiqus d séparaion. Composiion mps d facur Débi HEPT d phas rénion du N n n d n mobil n % composé 4 : ml/min 4 plaaux capacié m/plaau d'moh/h O n min : k' R s α F 0,4 70/30 8, ,3E-05 0,93 3,68 1,75,54 0,8 70/30 4, ,48E-05 0,9,74 1,73,5 1, 70/30, ,9E-05 0,91 4,81 1, 3,66 0,8 65/35 5, ,03E-05 1,36 0,79 1,4 3,51 0,8 70/30 4, ,48E-05 0,9,74 1,73,5 0,8 75/5 3, ,59E-05 0,59,6 1,67 3,47 V. Analys ds courbs. En raçan la courb donnan l nombr d plaaux héoriqus ou l HEPT n foncion d la viss linéair on obin un xrmum qui corrspond a la viss opimal d séparaion ds composés qui s d : On pu donc n déduir un débi d : 0.8 ml/min. En raçan l nombr d plaaux héoriqus ou l HEPT n foncion du pourcnag n méhanol dans la phas mobil, on obsrv d mêm un xrmum qui corrspond à 70 % n méhanol. Donc ls paramèrs opimums d séparaion son un débi d 0,8 ml/min un phas mobil consiué d 70 % n méhanol donc 30 % d au

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