Prépara2on à l Agréga2on interne de SV STU Universités Paris Diderot et Paris Est Créteil. Eléments de génie génétique
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- Nadine Laframboise
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1 Prépara2on à l Agréga2on interne de SV STU Universités Paris Diderot et Paris Est Créteil Eléments de génie génétique 2 octobre 2010 Hervé TOSTIVINT Muséum Na2onal d Histoire Naturelle htos2vi@mnhn.fr
2 Génie géné0que Ensemble des ou0ls et des techniques perme:ant d u0liser, reproduire ou modifier le génome des êtres vivants dans un but de recherche fondamentale ou appliquée Manipula0ons géné0ques Technologies de l ADN recombinant
3 Les manipula0ons de base Découper, recoller des morceaux d ADN en déterminer la séquence (séquençage) les répliquer (clonage) en modifier la séquence (mutagenèse) les exprimer (transcrip0on et traduc0on) In vitro (contexte purement acellulaire) et/ou in vivo (contexte cellulaire)
4 Exemple du clonage In vitro: PCR In vivo: via l u0lisa0on d un vecteur introduit dans des bactéries
5 Visualisa0on de l ADN (1) Électrophorèse sur gel Bromure d éthydium
6 Visualisa0on de l ADN (2) Hybrida0on de sonde Marqueur enzyma0que, fluorescent ou radioac0f Sonde marquée
7 Deux applica0ons majeures du génie géné0que Séquençage des génomes Produc0on d organismes géné0quement modifiés = transgéniques
8 Séquençage des génomes
9 Historique
10 Avancement des projets de séquençage (septembre 2010) complets en cours virus 2510? eubactéries archées eucaryotes
11 Stratégies de séquençage Séquençage possible uniquement sur pe0ts fragments d ADN
12 Séquençage proprement dit des fragments Méthode de Sanger Lecture assistée par ordinateur
13 Principe de la méthode de Sanger
14 Annota0on des génomes Séquence brute AAAAAAATTGTGGGAGAATTCCTTTAGCGTCTAGACTAAAAGAAAGTAAAGAGACGTAACATAACAACTAAATTCAATGTATGA GGCTTGCCTCAGATCTGGTTGGGAAGAGAAAGAAAAGAAAAGAGAAACAGCTAAAAAGACATTATCAGGGTAATTAGGAACA CTTAAGTATTAATACTGGGCAATATTATGAAATTATTATTTATTTTCTTGGAGGTGACAACAGTATCATAAAGTGAATTTTTTTTATT CTTAGAAGATGAATGTCGATGTATTTATATGCGAGGTGTCAATGCCAAAAACTTATTCTGAAATGGTACAGAAAAAAGTATACATA CAAAGAGAGAGAGAGAAGATATATGAAAAAATGTTAAAATTGTTGAATCTCATTGAAGGGTATATAGGTGACTTTATAATATTAT GTTAACTTTTTTATGGAAGAAATGTCTTAAGCGTACCATTTCCACAGTATATCTAATTTCTGAATACAATGTGTGTGTGTGTCTGTG TGTACACCTGTGCTTCAGAAAGCCCTAAGTACTGGCAATTCTTTGTACTTCCTTGCATAGGCCATGCAGAATGTCCTCCCCCATTT CATCGGTTTTATTTTCTTCTTTTTCTAACTTCTTAAGAAATAGTCTTTGTGCATCAACTTTAAGATAAAACTTTCTTCTTTGGCGATA TAAATGTTAAGGCCAAAATTTCCCTTCTAAGTTCTGTTTTAGTTTCATCTAAAAAGTTTTGACACATTTTTGTTCAGTCAATATTAC ATACTTTCTAAGTTTGTTTTGATATTGTATTTGATCCATGAATTATGTGTGTTCTTTTATTTTTAAATGTATTTTAAGCATGGATTTTT AATTATCTTGGGTAGTTAATTTCTGATGTGCTACGGTCAAGGGACACGGCCTGATTTTTATATTTGTTGAAACCTGGTTTGTGGA GGAGCAGATGGTCAACTCTTGTAAAAATTTTATATGTGCTTGAAACAGTAGGTTTTCTAAAATTTGGAGATACAGAGCTCTATCT ATGCATCTCCATTAGCTCAAGTTTGATAATTGTGTTATTCATATTCTCGATATTTTCACTAAGCTTTATCTACTTGATTTATGAAATCT GAGGGAGGAGTGTGAAAATCTTTCAGCACGACTGTGGTTTTGACTCTTTCTTCTTATAATTTGGATTATTTTTCCTCATGTATTTT GAGGACATATTTTAGGTGCATGAGAGGTACAGGGTCAAGATCATCAAAAAAAGAAAGGCTGAGAAAGTCTCAAGAAGCCACA GGGTAGAAGAACCTAAGGAGATATGATGACTAAATGTGATGTGATGTTTTGGATGAGATCCTGGGAGAGAAAAAGGACATTAG GTAAATTCCAAGGAAATTTGAGTAAAATATGGACTTCAGTTAATAATAACTTGTTAATGTTGTTTCATTAGTGGTGGTAAATGCAT
15 Iden0fica0on des gènes chez les procaryotes La prédic0on des gènes chez les eucaryotes par approche purement in silico est difficile car les ORF sont morcelés (présence d introns parfois beaucoup plus longs que les exons)
16 Carte intégrée voir.
17 Quelques données issues des grands programmes de séquençage des génomes
18 Cas des procaryotes pb
19
20 Cas des eucaryotes 3 kb 28 Kb
21 Bien voir qu il n y a pas de rela0on simple: entre la taille du génome (valeur C) et la complexité morphologique des organismes = paradoxe de la valeur C entre la taille du génome et le nombre de gènes L explica0on est liée à l importance de l ADN non codant (qui varie beaucoup en fonc0on de l abondance des séquences répétées)
22 Cas par0culier du génome humain
23 Nature des séquences répétées
24 Organisa0on du génome humain 3200 Mb Séquences associées à des gènes 37,5 % 1200 Mb Séquences extragéniques 62,5 % 2000 Mb Séquences codantes 50 Mb (1,5%) Introns Séquences leaders Pseudogènes 1150 Mb (36 %) Répé00ons dispersées 1400 Mb 43,5% LINE 640Mb 20% SINE 420 Mb 13% LTR 250 Mb 7,5% Transposons 90 Mb 3% Autres séquences intergéniques 600 Mb 19% Microsatellites 90 Mb 3% Divers % D après Venter, 2001
25 Transposons ADN Rétrotransposons
26 Intérêt du séquençage de génomes complets Inventaire des gènes d une espèce donnée déterminer leur structure, rechercher leurs fonc0ons, relier leurs anomalies éventuelles à des maladies connues Comparaison du génomes d espèces différentes intérêt évolu0f
27 Exemple d applica0on médicale projet de l Interna+onal Cancer Genome Consor+um: obtenir la séquence de génomes extraits de cellules cancéreuses et non cancéreuses auprès de 500 pa+ents et ce, pour chacun des 50 types de cancers étudiés. À raison de deux séquençages par pa+ent, ce sont donc séquençages de génomes humains qui sont prévus Séquençage du génome humain: : 3 milliards de dollars Séquençage d un génome humain aujourd hui quelques jours): 1500 dollars
28 Transgenèse Qu est ce qu un organisme géné0quement modifié? O.g.m. : Un organisme géné0quement modifié (OGM) est un être vivant (animal, végétal ou micro organisme) dont l'homme a modifié le patrimoine géné0que afin de lui conférer de nouvelles propriétés. Pour des raisons historiques: plantes = OGM animaux = transgéniques N.B. pour les bactéries ou les levures, on u0lise l expression de microorganismes recombinants
29 La modifica0on se traduit de 2 manières: addi0on d une informa0on nouvelle remplacement d une informa0on préexistante par une version modifiée de celle ci transgène transgène transgène transgène
30 Principales applica0ons de la transgenèse addi0ve transgène Transgène = gène provenant d une espèce différente de l espèce cible et des0né à conférer des propriétés nouvelles à ce:e dernière, ou gène de l espèce cible mais dont l expression est induite dans des condi0ons spa0o temporelles différentes transgène
31 Exemples de transgenèse addi0ve (1) Promoteur du gène de la métallothionéine (induc0ble par Zn ou Cd) Séquence codante du gène de la GH humaine 1 ère expérience de transgénèse réussie chez la souris (1982)
32 Exemples de transgenèse addi0ve (2) Gène cytotoxique Promoteur fort Séquence codante d un e toxine bactérienne (Cry1 ab) maïs Bt (Bacillus thuringiensis) produc0on d un insec0cide (an0pyrale)
33 Exemples de transgenèse addi0ve (3) Promoteur d un gène d expression cérébrale (Ngn2) Gène rapporteur Séquence codante du gène de la GFP d anémone de mer Anémone de mer (Aequora victoria) Souris green fluorescent protein (GFP) Prix Nobel Chimie 2008
34 Exemples de transgenèse addi0ve (4) Gène tumorigène souris Promoteur d un gène d expression pancréa0que (PyrK) Séquence codante d un oncogène viral (SV40 T) Produc0on ciblée de tumeurs (ex. dans le pancréas) Gène cytotoxique souris Promoteur d un gène d expression hypophysaire (GH) Séquence codante d une toxine bactérienne (Toxine Diphtérique A) Abla0on spécifique d un lignage cellulaire (ex. dans l hypophyse)
35 Principales applica0ons de la transgenèse de remplacement transgène Transgène = gène provenant de la même espèce mais sous une forme différente de la forme présente dans le génome Ex. version inac0ve knock out (= invalida0on génique) ou version modifiée avec propriétés nouvelles knock in (créa0on de modèles animaux de maladies humaines, transgène
36 On dis0ngue par ailleurs 2 types de transgenèse: Transgenèse germinale: le transgenèse est présent dans toutes les cellules de l organisme, y compris celles de la lignée germinale = transgenèse s.s Transgenèse soma0que: le transgène n est introduit que dans certaines cellules soma0ques
37 Transgenèse germinale: différentes stratégies Tg Tg Différentes cibles possibles: zygote (la plus évidente a priori, mais parfois difficiles à obtenir en nombre important) Tg Tg Tg Tg Tg Tg Tg cellules souches embryonnaires (ES) (culture délicate et possible chez certaines espèces seulement) Tg Tg Tg Tg Tg Tg Tg Tg Tg Tg Tg Tg Tg Tg Tg Tg Tg Tg Tg Tg Tg Tg Tg Tg Tg Tg
38 Transgenèse germinale: différentes stratégies (suite) Différents modes d introduc0on du transgène: par microinjec0on (possible uniquement sur des cellules de grande taille, nombre limité de cellules suscep0bles d être traitées dans le cas de certaines espèces) par transfec0on (méthodes chimiques ou électriques) par infec0on (méthode biologique) (par l intermédiaire d un virus) cellules ADN (+virus) Transfec0on/ infec0on
39 Devenir du transgène dans la cellule cible ne s intègre pas à son génome (en général, voué à être perdu) s intègre à son génome en un site quelconque, de façon aléatoire en un site bien déterminé (possible au niveau d une séquence homologue) Transgène Recombinaison homologue Génome hôte >99% 10 2/ 3 < 10 6
40 Procédure de transgenèse addi0onnelle chez la souris
41
42
43
44 Procédure de transgenèse de remplacement chez la souris Problème majeur: très faible rendement de la recombinaison homologue impossible à réaliser sur des zygotes Cellules cibles de choix: les cellules souches embryonnaires (ES)
45 Cellules souches embryonaires = ES (embryonic stem) Introduc0on du transgène Cellules ES: to0potentes, cul0vables ex vivo, réinjectables, transfectables Méthode d u0lisa0on des cellules ES mise au point par Mar0n Evans (années 1980) Prix Nobel 2009
46 Condi0ons de la recombinaison homologue < 10 6 Exploite la machinerie cellulaire de recombinaison impliquée durant la méiose
47 Séquence d inac0va0on Exon 2 promoteur Exon 1 Exon 2 Exon 3 promoteur Exon 1 Exon 3 Exon 2 interrompu Gène non fonc0onnel
48 comment favoriser l intégra0on ciblée du transgène plutôt que son intégra0on aléatoire, ou même sa non intégra0on (1)? Cellules ES ADN Transfec0on/ infec0on Milieu de culture sélec0f (létal pour les cellules ES) Séquence d inac0va0on = gène de résistance au milieu sélec0f Transgène Génome hôte >99% 10 2/ 3 < 10 6 Cellules non transfectées: tuées par le milieu de culture sélec0f Cellules transfectées: résistantes au milieu de culture sélec0f
49 comment favoriser l intégra0on ciblée du transgène plutôt que son intégra0on aléatoire, ou même sa non intégra0on (2)? Séquence marque = gène cytotoxique Transgène Génome hôte >99% 10 2/ 3 < 10 6 Cellules transfectées Cellules transfectées avec intégra0on avec intégra0on ciblée aléatoire du transgène: du transgène: tuées par le gène Non tuées par le gène cytotoxique cytotoxique
50 EX. Marqueur 1 : gène de résistance à la néomycine Ex. Marqueur 2 : gène de la thymidine kinase de l herpes virus transforme le gancyclovir en un produit cytotoxique Cellules ES ADN Transfec0on/ infec0on Milieu sélec0f = G418 (équivalent de la néomycine pour les eucaryotes + gancyclovir Stratégie développée par Mario Capecchi et Oliver Smithies (fin des années 1980) Prix Nobel 2009
51 La transgenèse chez l homme Le cas par0culier de la thérapie génique = transgenèse soma0que Tg Tg Tg Tg Tg Tg Pas de transmission possible à la descandance
52 Un des rares succès de thérapie génique à ce jour chez l homme
53
54
55 Bilan 10 ans après: enfants traités, 1 échec 4 ont développé une leucémie entre 2002 et 2005, 1 décédé, les 3 autres vivants avec immunité restaurée. Au total,7 enfants aujourd hui en bonne santé Nouveaux essais lancés en septembre 2010 Récemment nouveau succès pour traitement d une forme de β thalassémie
56 Bibliographie (liste agreg)
57 Autres ouvrages sur le thème
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