Bioinformatique: alignement de séquences

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1 Bioinformatique: alignement de séquences Céline Brochier-Armanet Université Claude Bernard, Lyon 1 Laboratoire de Biométrie et Biologie évolutive (UMR 5558) Celine.brochier-armanet@univ-lyon1.fr

2 Problème NP-complet Requière l utilisation d heuristiques > 100 heuristiques disponibles => solutions différentes Le choix

3 Alignement global vs alignement local A1 B1 C1 A'1 Séquence 1 A2 C2 B2 Séquence 2 Needleman & Wunsch FASTA A1 B1 C1 A'1 A2 C2 B2 A1 B1 C1 A'1 B1 B2 A1 A2 A'1 A2 C1 C2 Smith & Waterman BLAST A2 C2 B2

4 Alignement de deux séquences vs alignement multiple Séquence 1 Séquence 2 Séquence 1 Séquence 2 Séquence 3 Séquence 4

5 Représentation Les résidus (nucléotides, acides aminés) sont superposés de façon à maximiser la similarité entre les séquences (selon les critères choisis) : G T T A A G G C G G G A A A G T T G C G A G G A C A * * * * * * * * * * Il existe deux sortes de mutations : Substitutions (mismatches). Insertions et délétions (indels ou gaps).

6 Quel est le bon alignement? G T T A C G A G T T - G G A * * * * * ou G T T A C G A G T T G - G A * * * * * G T T A C - G A G T T - - G G A * * * * * Doit maximiser la «similarité» entre les séquences Évolution : seront alignés ensemble des résidus homologues, cad descendant d un même résidu ancestral. Structure : seront alignés ensembles des résidus occupant une position équivalente des résidus dans des structures 2D ou 3D. Fonction : seront alignés ensembles des résidus ayant des fonctions similaires. Critères d évaluation / comparaison des alignements

7 Matrices de points (dot-plot) Comparaison visuelle de deux séquences : Une suite de points en diagonale indique une similarité locale. Méthode simple et rapide : Algorithme en O(nm). Visualisation des répétitions directes ou inversées. Pas d alignement global. Pas de score associé. C T G C A C G T A T T A C T T G C A C G T A T

8 Élimination du bruit de fond Filtrage en affichant un point uniquement si plusieurs résidus successifs correspondent : Exemple des hémoglobines et humaines : Identités = 3/10 Identités = 5/10

9 Fonction de score de similarité G T T A A G G C G G G A A A G T T G C G A G G A C A * * * * * * * * * * Score = Score Identités + Score Différences Identité = +1 Substitution = 0 Gap = -1 Score = 10-4 = 6

10 Modèle d évolution (ADN) A C G T P(transition) > P(transversion) G T T A C G A G T T G - G A * * * : * * > G T T A C G A G T T - G G A * * * * *

11 Matrice de substitution (ADN) A 1 C G (A, A) = 1.0 (A, G) = 0.5 (A, ) = -1 T A C G T G T T A C G A G T T A C G A G T T - G G A < G T T G - G A Score = 4 Score = 4.5

12 Le cas des acides aminés Plus difficile à modéliser que celui des nucléotides : Un acide aminé peut être remplacé par un autre de différentes façons (code génétique). Asp (GAC) Tyr (UAC, UAU) 1 ou 2 mutations

13 Le cas des acides aminés Plus difficile à modéliser que celui des nucléotides : Un acide aminé peut être remplacé par un autre de différentes façons (code génétique). Le nombre de substitutions requises pour passer d un acide aminé à un autre diffère. Asp (GAC, GAU) Tyr (UAC, UAU) 1 mutation Asp (GAC, GAU) Cys (UGC, UGU) 2 mutations Asp (GAC, GAU) Trp (UGG) 3 mutations

14 Le cas des acides aminés Plus difficile à modéliser que celui des nucléotides : Un acide aminé peut être remplacé par un autre de différentes façons (code génétique). Le nombre de substitutions requises pour passer d un acide aminé à un autre diffère. La probabilité des substitutions au niveau nucléotidique diffère : P(AAU Asn GAU Asp ) > P(AAU Asn CAU His )

15 Le cas des acides aminés Plus difficile à modéliser que celui des nucléotides : Un acide aminé peut être remplacé par un autre de différentes façons (code génétique). Le nombre de substitutions requises pour passer d un acide aminé à un autre diffère. La probabilité des substitutions au niveau nucléotidique diffère : Certaines substitutions peuvent avoir plus ou moins d effet sur la fonction des protéines. Acidité, hydrophobicité, structure des protéines, etc. Val Ile Substitutions conservatrices NH2 H C COOH H C CH3 CH3 NH2 H C COOH H C CH3 CH2 CH3

16 Modèles d évolution (prot.) Mesure des fréquences de substitution dans des alignements de protéines homologues : Matrices basées sur des arbres construits en utilisant le maximum de parcimonie : PAM (Dayhoff et al., 1978). JTT (Jones et al., 1992). Matrices basées sur des arbres construits en utilisant le maximum de vraisemblance : WAG (Whelan et Goldman, 2001). Matrices basées sur des comparaisons par paires utili-sant des alignements locaux : BLOSUM (Henikoff et Henikoff, 1992).

17 Matrice de substitution (prot.) D 6 (D, D) (W, W) E 2 5 F G W Certains acides aminés sont moins facilement substituables D E F G W M R D W - G F M R - W D G F * * * * * > M R - D W G F M R W D - G F * * * * *

18 Matrices de Dayoff ou PAM PAM = Percentage of Accepted point Mutation Margaret Dayhoff, 1978 Probabilité d'observer la mutation X->Y après un temps évolutif donné. Basé sur alignement de protéines conservées à + de 85%. Chaque case représente la probabilité de voir ces deux résidus remplacés l'un par l'autre dans un alignement. (matrice lod-score, de "log-odds" ou "log des chances"). Un exemple de lod-score est: S = log (Fij / (Fi x Fj)) Où Fij est la fréquence de remplacement du résidu i par j, et Fi et Fj sont les fréquences respectives des résidus i et j. Dans cette matrice de similitude, plus la valeur est négative, plus la probabilité est faible, plus le remplacement est rare. La table est valable pour une certaine distance évolutive. La distance est mesurée en PAM: nbre de mutations ponctuelles par 100 aa. 2 Séquences séparées par une unité PAM: 1 mutation par 100 aa. Les valeurs sont déterminées initialement pour des protéines séparées de 6 à 100 PAM, puis extrapolées pour 150, 250 PAM, etc. Pour des protéines éloignées, on ne pourrait pas directement extrapoler à partir de valeurs tirées par ex. de PAM 10, car la nature des mutations change avec la distance évolutive. Le code génétique, par exemple, influence les mutations permises sur une courte durée, mais pas sur une longue durée.

19 Matrice de Dayoff (1979) A B C D E F G H I K L M N P Q R S T V W Y Z A B C D E F G H I University of Nijmegen W=Tryprophane (Cyclique) C= Cysteine (Soufre) K L M N P Q R S T V W Y 0.6 Z

20 Matrices PAM et JTT PAM (Point Accepted Mutation) : 71 familles de gènes nucléaires correspondant à 1300 séquences : Séquences peu divergentes entre elles (identité 85 % entre chaque paire possible dans une famille). Alignements globaux. JTT (Jones, Taylor and Thornton) : Construites à partir de mutations ponc-tuelles observées dans protéines. Alignements globaux.

21 % de différences Seuil pour les matrices PAM Twilight Zone PAM

22 Matrices BLOSUM BLOSUM (Blocks Substitution Matrices) : Utilisation de ~2000 domaines conservés provenant de 500 familles de protéines. Comparaisons effectuées dans les domaines alignés (banque BLOCKS). Matrices créées à partir de domaines comprenant des séquences ± divergentes : Toutes les paires ayant servi a construire une matrice BLOSUMk ont une identité à k %. Matrices plus adaptées pour des protéines distantes du point de vue évolutif.

23 BLOSUM Choix d une matrice Pas de matrice idéale. Meilleurs résultats avec les matrices utilisant des modèles d évolution : BLOSUM globalement meilleures que PAM. Degré de similarité des séquences. Il est recommandé d expérimenter! PAM Identité % 10 0

24 pénalité Pondération des gaps Pénalités linéaires : w = o + e k o : pénalité pour l ouverture d un gap. e : pénalité pour l extension d un gap. k : longueur du gap TGATATCGCCA TGAT-T--CCA **** * *** k > TGATATCGCCA TGAT---TCCA **** ***

25 pénalité Autres pondérations Pénalités logarithmiques : w = o + e log(k) Pondération par la distance évolutive : e diminue quand la distance augmente. Pondération par la nature des résidus : e diminue dans les régions hydrophiles Résidus hydrophiles k N Cœur hydrophobe C

26 Séquence B Needleman et Wunsch Représentation sous la forme d une trajectoire dans une matrice : Détermination de la trajectoire optimisant un score donné. Soit deux séquences A et B de longueurs m et n : Définition de la matrice de chemin S : Dans chaque case de cette matrice on stocke S(i, j), le score optimum de la trajectoire permettant d arriver à cette case. b 1 b j b n Séquence A a 1 a i a m S(i, j)

27 Construction de la matrice Soit S(i, j) la valeur optimum du score dans la case de coordonnées (i, j) : Définition par rapport aux scores dans les trois cases adjacentes (i 1, j), (i 1, j 1) et (i, j 1) : i 1 i j 1 j S(i, j) S(i, j) = max S(i 1, j) + (a i, ), S(i 1, j 1) + (a i, b j ), S(i, j 1) + (, b j )

28 Bords de la matrice Les cases situées sur le bord du haut ou le bord gauche de la matrice ne possèdent plus le total requis de trois cases précédentes : On ajoute une ligne et une colonne supplémentaires afin d initialiser la matrice. Le balayage ne se faisant plus qu avec des indices 1 on ne rencontre plus de cases nécessitant un traitement particulier. Bord gauche Bord du haut S(i, j) S(i, j)

29 Exemple de calcul A G C T A A T T A Identité : +1 Mismatch : +0 Gap : A G C T A A T T A S = +1 A G C T A A T T A S = +1

30 Smith et Waterman Algorithme dérivé de Needleman et Wunsch : Initialisation des bords à 0. N importe quelle case de la matrice peut être considérée comme point de départ pour le calcul du score. j 1 j i 1 i S(i, j) S(i, j) = max S(i 1, j) + (a i, ), S(i 1, j 1) + (a i, b j ), S(i, j 1) + (, b j ) 0 S(i, j) < 0 S(i, j) = 0

31 L alignement de n séquences Application possible du Needleman & Wunch à plus de deux séquences (en théorie) Pairwise Alignment: three possibilities Alignment of three sequences : seven possibilities Le nombre de possibilité pour aligner n séquences est proportionnel à 2 n 1. Le besoin en mémoire et ressources de calcul augmentent de manière exponentielle avec le nombre de séquences Application d heuristiques

32 Outils pour la recherche par similarité Utilisation d outils comme BLASTP/TBLASTN pour la recherche par similarité dans différentes banques de données de séquences protéiques/nucléiques Banques de séquences protéiques types SWISS-PROT : banque non redondante de séquences protéiques confirmées (Août 2010: entrées (158,316 en 2004), incluant de nombreuses annotations et références croisées avec d autres banques de séquences, de structures, de familles protéiques, de références bibliographiques, de descriptions de la fonction et du rôle biologique des protéines TrEMBL : banque non redondante de traduction des CDS soumis à EMBL (Août 2010: entrées ( en 2004)

33 Guy Perrière BLAST : principe général Mot Séquence banque Séquence requête Longueur du mot = w Score T Séquence banque Séquence requête Extension du segment similaire HSP : High Scoring Pair Score T Score max. Extension du segment x Extension stoppée quand : - la fin d une des deux séquences est atteinte - score 0 - score score_max - x

34 Guy Perrière Exemple S L A A L L N K C K T P Q G Q R L V N Q W T x Liste de mots voisins P Q G 18 P E G 15 P R G 14 P K G 14 P N G 13 P D G 13 P H G 13 P M G 13 P S G 13 P Q A 12 P Q N (P, P) = 7 (Q, R) = 1 (G, G) = 6 Score seuil T = 13 Query : 325 S L A A L L N K C K T P Q G Q R L V N Q W L A + + L + T P G R W Sbjct : 290 T L A S V L D C T V T P M G S R M L K R W 310

35 Guy Perrière Versions de BLAST blastp : protéine vs. protéine. Séquence Banque blastn : utile pour le non-codant. Protéique blastp Protéique blastx : séquences codantes non identifiées. tblastn : homologues dans un génome non complètement annoté. Nucléique T T blastn tblastx T Nucléique

36 Guy Perrière Évaluation statistique Similarités détectées : Relations significatives. Similarités dues au hasard. Fonction de score : Mesure sous la forme : D une espérance mathématique (E-value). Valeur en bits. Basée sur une distribution calculée à partir séquences non homologues. Les scores dépendent de la taille de la banque.

37 Guy Perrière E-value, bits et similarité Soit E, l espérance mathématique d avoir une similarité au score S observé : E = Kmn e S Avec m et n les longueurs des deux séquences considérées, et K et deux paramètres dérivés de la distribution précédente. Le score en bits S' est donné par : S' = [ S log(k)] / log(2) La relation entre E et S' est donc donnée par : E = mn 2 S'

38 Recherche par Blast au NCBI

39 Choix des paramètres

40 Choix des paramètres

41 Choix des paramètres avancés

42 Résultats du BLAST : Entête

43 Résultats du BLAST : Reformater les résultats

44 Résultats du BLAST : Domaines conservés

45 Résultats du BLAST : Vue graphique

46 Résultats du BLAST : Descriptions

47 Résultats du BLAST : Alignements locaux

48 Résultats du BLAST : Alignements locaux

49 Taxonomy report

50 Caractéristiques des principaux logiciels d alignement multiple Composants principaux des algorithmes Principaux logiciels (Chatzou et al. 2015)

51 L alignement progressif Principe = procédure itérative basée sur le regroupement d alignements deux à deux pour construire un alignement multiple Trois étapes : Alignement de paires de séquences Construction d un arbre guide Alignement de groupes de séquences déjà alignées (alignement progressif). CLUSTAL (Higgins, Sharp 1988, Thompson et al., 1994), le programme d alignement multiple le plus cité. MULTALIN, PILEUP, T-Coffee, Muscle

52 L homologie, base théorique de l alignement multiple Les séquences homologues sont reliées d un point de vue évolutif Idée = construire progressivement un alignement, à partir de séries de séquences (ou de groupes de séquences) alignées deux à deux, suivant un ordre de branchement donné par un arbre phylogénétique Alignement des séquences les plus proches d un point de vue phylogénétique Intégration progressive des séquences un peu plus éloignées Approche suffisamment rapide pour permettre la construction d alignements contenant un grand nombre de séquences

53 Alignement progressif Construction itérative par groupement des alignements de paires de séquences : Alignement de toutes les paires possibles : Établissement d une matrice de distances basée sur les scores des alignements. Groupement des paires et / ou des séquences. Groupement des alignements (alignement progressif proprement dit). Différentes implémentations disponibles : CLUSTAL, MULTALIN, MUSCLE.

54 Algorithme de CLUSTAL W Alignement de toutes les paires de séquences deux à deux par l algorithme de Needleman et Wunsh Construction d une matrice de distances d après la divergence mesurée entre chaque paire de séquences Calcul d un arbre guide à partir de la matrice de distances Alignement progressif des séquences suivant l ordre de branchement donné par l arbre

55 Exemple Alignement de 7 séquences de globines: Hémoglobine b Humaine (Hbb_H) Hémoglobine a Humaine (Hba_H) Hémoglobine b Cheval (Hbb_C) Hémoglobine a Cheval (Hba_C) Myoglobine de cétacé Physeter catodon (Myo) Hémoglobine V de lamproie Petromyzon marinus (Glb5) Leghémoglobine II de Lupin (Lgb)

56 Alignement des séquences 2 à 2 et construction de la matrice de distances Alignement des séquences 2 à 2 par programmation dynamique (algorithme de Needleman et Wunsh) connaissant une matrice de similarité et les pénalité dues aux gaps (ouverture et extension) Score = nombre d identités / nb de résidus comparés (excluant les gaps) % de divergence = 1 - score Remarque : le calcul du score ne tient pas compte des substitutions multiples, mais on peut utiliser des modèles d évolution comme Kimura ou JC pour en tenir compte

57 Alignement des séquences 2 à 2 et construction de la matrice de distances Hbb_H Hbb_C Hba_H Hba_C Myo Glb5 Lgb Hbb_H - Hbb_C Hba_H Hba_C Myo Glb Lgb

58 Construction de l arbre guide Arbre phylogénétique non raciné construit par la méthode du Neighbor-Joining à partir de la matrice de distances calculée précédemment Longueur des branches <=> proportionnelle à la divergence estimée Racine placée au «poids moyen» <=> Longueur des branches d un côté de la racine = longueur des branches de l autre côté

59 0.061 Construction de l arbre guide Hba_H Myo Hba_C Leg Hbb_H Hbb_C Glb5 Positionnement de la racine au poids moyen (point à partir duquel les longueurs moyennes des branches de chaque côté du nœud sont égales)

60 0.061 Placement de la racine Hba_H Myo Hba_C Leg Hbb_H ROOT Hbb_C Glb5 Positionnement de la racine au poids moyen (point à partir duquel les longueurs moyennes des branches de chaque côté du nœud sont égales)

61 Arbre guide raciné Hbb_H Hbb_C Hba_H Hba_C Myo ROOT Glb5 Leg

62 Pondération des séquences Principe : attribuer un poids à chaque branche de l arbre => Dépend de la taille de la branche et du nombre de taxa partageant cette branche (redondance de l information) => longueur de la branche / nombre de taxa partageant cette branche Poids d une séquence = des longueurs des branches pondérées de la racine au taxon considéré

63 Pondération des séquences Hbb_H W1 = 0.062/ / / / = Hbb_C Hba_H Hba_C Myo W2 = 0.062/ / / / = W3 = W4 = W5 = ROOT Glb5 W6 = Leg W7 = 0.442

64 Alignement progressif Principe : utiliser une série de paires d alignements pour aligner des groupes de séquences de plus en plus larges, en respectant l ordre de branchement dans l arbre guide (des feuilles vers la racine)

65 Alignement progressif Dans l exemple des globines, on aligne dans l ordre: Les b globines humaines et de cheval Les a globines humaines et de cheval Les a et b hémoglobines Les a, b hémoglobines et la myoglobine Les hémoglobines, myoglobine et l hémoglobine de lamproie La leghémoglobine avec toutes les autres

66 Alignement progressif Calcul du score à une position = moyenne des scores obtenus par toutes les comparaisons 2 à 2 des séquences de chaque groupe pondérés par le poids de chaque séquence

67 Alignement progressif Exemple: on cherche à aligner un groupe de 4 séquences (déjà alignées) avec un groupe de 2 séquences (déjà alignées) Calcul du score: 1 PEEKSAVTAL M(T,V) x w1 x w5 + 2 GEEKAAVLAL M(T,I) x w1 x w6 + 3 PADKTNVKAA M(L,V) x w2 x w5 + 4 AADKTNVKAA M(L,I) x w2 x w6 + M(K,V) x w3 x w5 + 5 EGEWQLVLHV M(K,I) x w3 x w6 + 6 AAEKTKIRSA M(K,V) x w4 x w5 + M(K,I) x w4 x w6 / 8 Score associé à la comparaison d un gap = 0 plus mauvais score possible

68 gi sp P02023 HBB_HUMAN gi pir HBHO gi sp P01922 HBA_HUMAN gi pir HAHO gi sp P02185 MYG_PHYCA gi sp P02208 GLB5_PETMA gi sp P02240 LGB2_LUPLU gi sp P02023 HBB_HUMAN gi pir HBHO gi sp P01922 HBA_HUMAN gi pir HAHO gi sp P02185 MYG_PHYCA gi sp P02208 GLB5_PETMA gi sp P02240 LGB2_LUPLU gi sp P02023 HBB_HUMAN gi pir HBHO gi sp P01922 HBA_HUMAN gi pir HAHO gi sp P02185 MYG_PHYCA gi sp P02208 GLB5_PETMA gi sp P02240 LGB2_LUPLU gi sp P02023 HBB_HUMAN gi pir HBHO gi sp P01922 HBA_HUMAN gi pir HAHO gi sp P02185 MYG_PHYCA gi sp P02208 GLB5_PETMA gi sp P02240 LGB2_LUPLU MVHLTPEEKSAVTALWGKVN--VDEVGGEALGRLLVVYPWTQR VQLSGEEKAAVLALWDKVN--EEEVGGEALGRLLVVYPWTQR MVLSPADKTNVKAAWGKVGAHAGEYGAEALERMFLSFPTTKT MVLSAADKTNVKAAWSKVGGHAGEYGAEALERMFLGFPTTKT VLSEGEWQLVLHVWAKVEADVAGHGQDILIRLFKSHPETLE PIVDTGSVAPLSAAEKTKIRSAWAPVYSTYETSGVDILVKFFTSTPAAQE GALTESQAALVKSSWEEFNANIPKHTHRFFILVLEIAPAAKD *: : : *. :.: * : FFESFGDLSTPDAVMGNPKVKAHGKKVLGAFSDGLAHLDN-----LKGTF FFDSFGDLSNPGAVMGNPKVKAHGKKVLHSFGEGVHHLDN-----LKGTF YFPHF-DLS-----HGSAQVKGHGKKVADALTNAVAHVDD-----MPNAL YFPHF-DLS-----HGSAQVKAHGKKVGDALTLAVGHLDD-----LPGAL KFDRFKHLKTEAEMKASEDLKKHGVTVLTALGAILKKKGH-----HEAEL FFPKFKGLTTADQLKKSADVRWHAERIINAVNDAVASMDDT--EKMSMKL LFSFLKGTSEVP--QNNPELQAHAGKVFKLVYEAAIQLQVTGVVVTDATL * :...:: *. :. : ATLSELHCDKLHVDPENFRLLGNVLVCVLAHHFGKEFTPPVQAAYQKVVA AALSELHCDKLHVDPENFRLLGNVLVVVLARHFGKDFTPELQASYQKVVA SALSDLHAHKLRVDPVNFKLLSHCLLVTLAAHLPAEFTPAVHASLDKFLA SNLSDLHAHKLRVDPVNFKLLSHCLLSTLAVHLPNDFTPAVHASLDKFLS KPLAQSHATKHKIPIKYLEFISEAIIHVLHSRHPGDFGADAQGAMNKALE RDLSGKHAKSFQVDPQYFKVLAAVIADTVAAG DAGFEKLMS KNLGSVHVSKGVAD-AHFPVVKEAILKTIKEVVGAKWSEELNSAWTIAYD *. *. :.: :.:... GVANALAHKYH GVANALAHKYH SVSTVLTSKYR SVSTVLTSKYR LFRKDIAAKYKELGYQG MICILLRSAY ELAIVIKKEMNDAA---. :

69 L alignement multiple n est pas toujours optimal Seul l un de ces alignements est optimal

70 Muscle Edgar (2004) Nucleic Acids Res. 32:1792

71 Global Alignments, Block alignments

72 Dialign Morgenstern et al PNAS 93:12098 Search for similar blocks without gap Select the best combination of consistent similar blocks (uniforms or not) : heuristic (Abdeddaim 1997) Alignment anchored on blocks Slower than progressive alignment, but better when sequences contain large indels Do not try to align non-conserved regions

73 Alignement multiples locaux MEME MATCH-BOX PIMA

74 Adapter les choix méthodologiques aux données Muscle ClustalW Dialign T-coffee MEME

75 Multiple alignment editor

76 Cas spéciaux

77 Alignement de séquences d ADN codantes F L F L CTT TTC CTT TTC CTC CTC L - - L (1) Alignement des séquences protéiques (2) Utilisation de l alignement obtenu comme guide pour aligner les séquences d ADN protal2dna:

78 Alignement de séquences d ADN codantes: le cas des frameshifts

79 Identification de gènes Alignement d un ARNm avec l ADN génomique Pas de pénalité de gap au niveau des introns => Identification de sites d épissage sim4, est2genome

80 Identification de gènes Alignement d une protéine avec l ADN génomique Pas de pénalité de gap au niveau des introns => Identification de sites d épissage genewise

81 Séquençage par shotgun

82 Assemblage Recherche de séquences chevauchantes entre les reads Autoriser / prise en compte des erreurs de séquençage et/ou du polymorphisme Prise en compte de la qualité des séquences cap3, phred/phrap (il existe des outils plus sophistiqués pour l assemblage de génomes)