Chromatographie de partage
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- Adélaïde Rochette
- il y a 7 ans
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1 - Greffage est souvent incomplet avec des pourcentages variables - Présence de résidus silanols libres Si-OH: interactions hydrophiles «parasites» - Gênant pour les composés basiques: liaison hydrogène - Reproductibilité, forme des pics Principe du «End-capping
2 Evolution des phases Domaine utilisation silice greffée 2 < ph <8
3 - Principe : La séparation des solutés est fondée sur leur patage entre une phase stationnaire et une phase mobile K = C S C M = coefficient de distribution = coefficient de partage Et k = K V S V M Chromatographie de partage = extraction liquide/liquide -- utilisation de 2 solvants non miscibles -- un fixé des particules de faible diamètre: - augmentation surface d échange - amélioration séparation : N
4 Les phases mobiles Tampon: fixé le ph de la phase mobile - Exemples de compositions de phases mobiles : -Tampon phosphate - Tampon acétate Chromatographie - Tampon citrate Chromatographie Polarité de phases normale - Tampon Polarité formiate de (SM) phases inversée Hexane/dichlorométhane/éthanol 80/15/5 % Eau (Tampon) /méthanol 80/20 % «Hydrophobe» /»Hydrophile» (Relative) «Hydrophobe» /»Hydrophile» (Relative)
5 - Principe : Phase stationnaire est - polaire: chromatographie de partage en polarité de phases normale séparation de composés polaires - apolaire: chromatographie de partage en polarité de phases inverse séparation de composés apolaires
6 - Partage en polarité de phases normales : Phase stationnaire hydrophile Si O - H O O - H O - H H H O O H H H H Eau des solvants Phase mobile hydrophobe Héxane /Dichlométhane Composé hydrophile Composé hydrophobe Ordre d élution Hydrophobe Hydrophile Temps de rétention peut être très élevé avec asymétrie
7 - Partage en polarité de phases normales : Utilisation de colonne de silice greffée avec des greffons présentant un caractère hydrophile
8 - Partage en polarité de phases normale : Hydrophile Hydrophobe
9 - Partage en polarité de phases inverse : Influence de la force éluante du solvant Phase mobile «hydrophile» Si O C 18 H 37 R R Silice greffée «hydrophobe» Eau/méthanol ou Eau/acétonitrile ou Eau/THF 80/20 %
10 - Partage en polarité de phases inverse : Phase stationnaire greffée avec des groupements apolaires: - C8 - C Phényle Phase mobile: % variable - eau ou tampon - méthanol ou acétonitrile ou THF
11 - Partage en polarité de phases inverse : Choix de la phase mobile est empirique : classification d Hildebrand 2 < k < 10 d d G: grande
12 - Partage en polarité de phases inverse : Ordre d élution Hydrophile Hydrophobe Hydrophobie Reverse Phase: RP
13 - Partage en polarité de phases inverse : Influence du caractère hydrophobe du soluté sur la rétention Ordre d élution Hydrophile Hydrophobe
14 BDCQ Hydrophilie et t R H Cyt Cyt Bis desethylchloroquine BDCQ H Mono desethylchloroquine MDCQ H Chloroquine CQ
15 - Partage en polarité de phases inverse : Influence de la fraction volumique du solvant (% solvant) Augmentation du pouvoir éluant
16 - Partage en polarité de phases inverse : Influence du ph de la phase mobile
17 - Partage en polarité de phases inverse : Influence du ph de la phase mobile R-COO- RCOOH + H 2 O RCOO - + H 3 O + Ka= [ RCOO - ]. [H 3 O + ] [ RCOOH] pka = -log Ka ph = pka % RCOOH ph = pka % RCOO - R-COOH 1 pka = 4,2 2 pka = pka = 3 4 pka = 4.1
18 - Chromatographie de partage : +++ utilisée - à polarité de phases normale - réservée à la séparation des composés polaires - possibilité d utiliser silice non greffée et greffée (amine,cyanopropyle) - élution plus hydrophobe au plus hydrophile - moins polyvalente et moins reproductible - à polarité de phases inversée - Reverse Phase (RP) avec phase greffée C18,C8, phényle - élution plus hydrophile au plus hydrophobe - reproductible et polyvalente - solutés à séparer solubles dans eau ou solvants polaires - applicables à la séparation de nombreux composés: médicaments, vitamines, polluants
19 Chromatographie avec formation de paires d ions -Cas particulier de la chromatographie de partage en polarité de phase inversée: chromatographie avec appariement d ions -Adaptés à la séparation des composés ionisables : - acides faibles: acides carboxyliques - bases faibles: amines - Ajout d un contre-ion (CI) à la phase mobile - concentration 10-3 à 10-2 mmol/l - composés chargés à chaîne hydrophobe
20 Chromatographie avec formation de paires d ions R + - Contre ion Soluté Phase mobile (Tampon ph fixé, % méthanol ou acétonitrile) - + R Paire ion Interactions hydrophobes R Si Phénomène de partage
21 Chromatographie avec formation de paires d ions - + R Contre ion donné à une concentration donnée R Variations de l hydrophophie de la paire d ions - + R - nombre de molécules de CI - hydrophobie du soluté : logp R Hydrophobie croissante
22 Chromatographie avec formation de paires d ions R + - Contre ion Soluté Phase mobile (Tampon ph fixé, % méthanol ou acétonitrile) R + - Si R + - Si Interaction ionique Phénomène d échanges d ions dynamiques
23 Chromatographie avec formation de paires d ions Influence de la concentration en contre ion
24 Chromatographie avec formation de paires d ions Influence de la fraction volumique du solvant Concentration en CI
25 Chromatographie avec formation de paires d ions Exemple de séparations de différents acides faibles
26 Chromatographie avec formation de paires d ions Exemple de séparations de catécholamines et métabolites
27 Chromatographie avec formation de paires d ions Conditions d application - ph de la phase mobile tel que le composé à séparer soit totalement ionisé - Concentration habituelle en CI 10-3 à 10-2 mmol/l - Quand la concentration en CI augmente, k augmente donc les t R augmentent -Augmentation de la fraction volumique du solvant diminue les temps de rétention, mais annule la séparation, baisse de la sélectivité (α) - Pas de gradient en chromatographie de paires d ions Ne pas confondre avec la chromatographie d échange d ions
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